專利名稱：：來自actinomaduranamibiensis的抗菌和抗病毒肽的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及從w"/m》/es&(DSM6313)分離的新肽，其制備方法及其用于制備下述藥物的用途，所述藥物用于治療細菌感染、治療病毒感染和治療疼痛。
背景技術：
：文獻中已知若干種高度橋連的肽，例如從芋螺(conesnail)中分離的芋螺多肽(conopeptide，綜述見例如Terlau&Olivera，Physiol.Rev.2004，84，41-68)或來自革蘭氏陽性菌來源的所謂的羊毛硫抗生素(Chatterjee等，Chem.Rev.2005，105，633-683)。所述肽具有多種功用。在其他功用中，羊毛硫抗生素乳鏈菌肽從許多年前已被用作食品防腐劑。所述芋螺多肽例如適用于治療疼痛、糖尿病、多發(fā)性硬化和心血管疾病，并且目前正進行臨床前或臨床開發(fā)。芋螺多肽的實例為a-GI(序列ECCNPACGRHYSC*,*酰胺化的，連接能力(connectivity):1-3，2-4)和a-GID(序列IR/CCSNPACRVNNOHVC,連接能力l-3，2-4),其中O/Hyp是羥脯氨酸，且連接性指出涉及各特異二硫鍵的半胱氨酸的位置，例如在a-GID中為第一到第三，和第二到第四<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>j__-^_■^--.............-'—'S-S-~~-H2N-lle-Arg-Cys-CSer-Asn-PrcKAIa-Gys-Arg-WAS!>Mf>Hyp'His-His-Cys-OHL__——s—$——__J(ex-GID)。發(fā)明概述現(xiàn)在已驚人地發(fā)現(xiàn)，高度橋連的肽可從微生物菌林爿"/朋/mw^m/m附/6/e"^y(DSM6313)中分離，并適用于治療細菌感染、病毒感染和/或疼痛。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個實施方案是式(I)化合物，其中Rl為H、C(OHC廣C6)烷基或C(0)-0-(C廣C6)烷基；R2為OH、NH2、NH-(C廣C6)烷基、NH-(C廣C4)亞烷基-苯基或NH-(d-C4)亞烷基-吡咬基；R3和R4彼此獨立地為H或OH，或R3和R4—起為-O;且m和n7彼此獨立地為0、l或2;其為任何立體化學形式，或是任何比例的任何立體化學形式的混合物，或其生理學可耐受的鹽。在另一實施方案中，式(I)化合物是式(II)化合物，其中R1、R2、R3、R4、m和n如上文定義。R1優(yōu)選為H。R2優(yōu)選為OH。R3和R4優(yōu)選為H或OH，其中如果R3為OH則R4為H，且如果R3為H則R4為OH，或R3和R4—起為=0。更優(yōu)選R3和R4為H或OH，其中如果R3為OH則R4為H，且如果R3為H則R4為OH。優(yōu)選m和n均為0，或m和n均為2，或m為0且n為2，或m為2且n為0。更優(yōu)選m和n均為0。本發(fā)明的另一實施方案是式(I)或式(II)化合物或其生理學可耐受的鹽，其中Rl為H;R2為OH;R3和R4為H或OH,其中如果R3為OH則R4為H，且如果R3為H則R4為OH;且m和n彼jt匕獨立地為0、l或2，優(yōu)選m和n均為0，或m和n均為2，或m為0且n為2，或m為2且n為0，尤其優(yōu)選m和n均為O。最優(yōu)選式(I)化合物是式(III)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>為了進一步表征本發(fā)明的化合物，從核糖體肽合成將肽殘基轉化回其可能的前體。殘基l和10中的a、a-雙取代的氨基酸在文獻中沒有報導。所述氨基酸可被描述為通過亞甲基橋連并在P-位置上被取代的Ala殘基，:i口下文所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的式(l)、(n)和(lll)的化合物的所有明顯化學等價物。這些等價物是下述化合物，其僅顯示輕孩t的化學差異并具有相同的藥理學作用，或其在溫和條件下被轉化為根據(jù)本發(fā)明的化合物。所述等價物也包括例如式(l)、(ii)和(ni)的化合物的鹽、還原產物、氧化產物、部分水解過程的酯、醚、縮醛或酰胺，以及本領域技術人員能夠使用標準方法制備的等價物，除此之外，還包括所有的旋光對映體和非對映異構體和所有的立體異構形式。除非另有說明，式(I)化合物中的手性中心以R構型或S構型存在。本發(fā)明涉及光學純凈的化合物和立體異構體混合物二者，例如對映異構體混合物和非對映異構體混合物。式(I)、(II)和(III)的化合物的生理學耐受的鹽理解為其有機鹽及其無機鹽，如Remington'sPharmaceuticalSciences(笫17版，第1418頁(1985))中所述。因為其生理和化學穩(wěn)定性及其溶解度，對酸根尤其優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽、鉤鹽和銨鹽；對堿基尤其優(yōu)選鹽酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，或羧酸鹽或磺酸鹽，如乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯曱酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽和對曱笨璜酸鹽。全文中本發(fā)明的化合物被稱作Labyrinthopeptin。本發(fā)明還涉及制備其中m和n彼此獨立地為0、1或2的式(I)化合物的方法，所述方法包括a)在合適的條件下，在培養(yǎng)基中發(fā)酵菌林JdVio/mw/"niwfl附幼/emis(DSM6313),或其變體和/或突變體之一，直到培養(yǎng)基中產生一種或多種式(I)化合物，b)從培養(yǎng)基中分離式(I)化合物，和c)適當時將式(I)化合物衍生化，和/或適當時將其轉化為生理學可耐受的鹽。本發(fā)明優(yōu)選地涉及制備式(I)化合物的方法，其中化合物(I)是式(II)化合物，更優(yōu)選地本發(fā)明涉及制備式(I)或優(yōu)選制備(II)的化合物的方法，其中m和n均為0，或m和n均為2，或m為0且n為2，或m為2且n為0。尤其優(yōu)選的，本發(fā)明優(yōu)選地涉及制備式(I)化合物的方法，其中化合物(I)是式(III)化合物。培養(yǎng)基是營養(yǎng)溶液或固體培養(yǎng)基，其含有至少一種慣用碳源和至少一種氮源，以及一種或多種慣用無機鹽。根據(jù)本發(fā)明的方法可用于以實驗室規(guī)模發(fā)酵(毫升到升的規(guī)模)，和用于以工業(yè)規(guī)模發(fā)酵(立方米的規(guī)模)。用于發(fā)酵的合適碳源是可同化的糖類和糖醇，例如葡萄糖、乳糖、蔗10糖或D-甘露糖醇，以及含糖類的天然產物，例如麥芽提取物或酵母提取物。含氮營養(yǎng)物的例子是氨基酸；肽和蛋白質及其降解產物，例如酪蛋白、蛋白胨或胰蛋白胨；肉提取物；酵母提取物；谷蛋白；地面種子(groundseed),例如來自玉米、小麥、豆類、大豆和棉花植物；來自生產醇的蒸餾殘渣；肉粉；酵母提取物；銨鹽；硝酸鹽。優(yōu)選該氮源是一種或多種已通過合成或生物合成獲得的肽。無機鹽的實例是堿金屬、堿土金屬、鐵、鋅、鈷和錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。微量元素的實例是鈷和錳。特別適用于形成本發(fā)明的Labyrinthopeptin的條件如下0.05到5%，優(yōu)選0.1到2.5%的酵母提取物；0.2到5.0%,優(yōu)選0.1到2%的酪胨；0.02到1.0%,優(yōu)選0.05到0.5%的CaCl2x2H20;0.02到1.5%,優(yōu)選0.05到0.7%的MgS04x7H20和0.00001%到0.001%的氰鈷銨素。給出的百分比數(shù)值在各情況下以總營養(yǎng)液的重量為基礎。對微生物進行需氧培養(yǎng)，即例如浸沒時在搖瓶或發(fā)酵罐中振動或攪拌，或適當時在固體培養(yǎng)基上時通入空氣或氧氣。微生物可在約18到35°C,優(yōu)選地約20到32。C,尤其是27到30。C的溫度范圍內培養(yǎng)。pH范圍應當在4和10之間，優(yōu)選地在6.5和7.5之間。微生物通常在這些條件下培養(yǎng)2到10天，優(yōu)選72到168小時的周期。有利地以若干步驟培養(yǎng)^L生物，例如最初在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中制備一種或多種初步培養(yǎng)物(preliminaryculture),然后將這些初步培養(yǎng)物例如以1:10到1:100的體積比接種進實際的生產培養(yǎng)基中，即主要培養(yǎng)物。如下獲得初步培養(yǎng)物例如將營養(yǎng)細胞或孢子形式的菌抹接種進營養(yǎng)液中，并允許其生長約20到120個小時，優(yōu)選48到96個小時?？衫缛缦芦@得營養(yǎng)細胞和/或孢子允許菌林在固體或液體營養(yǎng)底物例如酵母瓊脂上生長約1到15天，優(yōu)選地生長4到10天?？墒褂靡阎姆椒ú⒖紤]天然物質的化學、物理和生物學特性，從培養(yǎng)基中分離和純化Labyrinthopeptin衍生物。使用HPLC，通過將形成的物質的量與校準液便利地比較，測試培養(yǎng)基中或各個分離步驟中Labyrinthopeptin衍生物的濃度。ii對分離而言，任選地將培養(yǎng)物發(fā)酵液或培養(yǎng)物與固體培養(yǎng)基一起凍干，并使用有機溶劑，或水和有機溶劑的混合物從凍干物中提取Labyrinthopeptin衍生物，所述混合物優(yōu)選地含有50-卯％的有機溶劑。有機溶劑的實例為曱醇和2-丙醇。有機溶劑相含有根據(jù)本發(fā)明的天然物質；適當時將其真空濃縮并進行進一步純化。根據(jù)本發(fā)明的一種或多種化合物的進一步純化在合適材料上通過層析進行，優(yōu)選地例如在分子篩上、在硅膠上、在氧化鋁上、在離子交換器上或在吸附樹脂上或在反相(RP)上。使用該層析分離Labyrinthopeptin衍生物。使用緩沖的、堿性或酸化的水性溶液或水性和有機溶液的混合物對Labyrinthopeptin衍生物進行層析。水性或有機溶液的混合物理解為是所有易與水混合的有機溶劑，優(yōu)選地為曱醇、2-丙醇或乙腈，其濃度為5到99%有4幾溶劑，優(yōu)選5到50%有機溶劑，或者是易與有機溶劑混合的所有緩沖的水性溶液。有待使用的緩沖液與上文所述相同?；贚abyrinthopeptin衍生物有差異的極性，借助于反相層析對其進行分離，所述層析例如在MCI(吸附樹脂，Mitsubishi,日本)或AmberliteXAD(TOSOHAAS)上，或在其他疏水材料例如RP-8或RP-18相上進行。另外，分離可借助于正相層析，例如在硅膠、氧化鋁等等上進行。緩沖的、堿性或酸化的水性溶液理解為是例如水、磷酸鹽緩沖液、乙酸銨和檸檬酸鹽緩沖液(濃度高達0.5M)，以及曱酸、乙酸、三氟乙酸、氨和三乙胺，或技術人員已知的所有可商業(yè)獲得的酸和堿(優(yōu)選地濃度高達1%)。在緩沖水性溶液的情況下，尤其優(yōu)選0.1%乙酸銨?？墒褂锰荻韧瓿蓪游?，所述梯度從100。/。水開始，以100%有機溶劑結束；優(yōu)選地用5到95%乙腈的線性梯度進行層析。或者也可能進行凝膠層析或在疏水相上層析。凝膠層析可例如在聚丙烯酰胺凝膠或共聚物(copolymer)凝膠上進行。上述層析步驟的順序可以逆轉。在Labyrinthopeptin作為立體異構體存在的情況下，它們可以使用已知的方法分離，例如借助于使用手性柱的分離進行分離。OH基團到酯或醚衍生物的衍生化使用本身已知的方法進行(J.March,AdvancedOrganicChemistry,JohnWiley&Sons,第4版，1992),例如借助于與酸酐反應或通過與二烷基碳酸鹽或二烷基硫酸鹽反應進行衍生化。COOH基團到酯或酰胺基衍生物的衍生化使用本身已知的方法進行(J.March,AdvancedOrganicChemistry,JohnWiley&Sons,第4版，1992)，例如借助于與氨反應成相應的conh2基團，或與任選地活化的烷基化合物反應成相應的烷基酯進行衍生化。-<:112-8-(:112-基團到-ch2-s(o)-ch2-或-ch2-S(0)2-CHr基團的氧化可以在將相應的Labyrinthopeptin衍生物暴露于氧氣或空氣后實現(xiàn)。根據(jù)布達佩斯條約，在1991年1月23日將微生物菌林爿"Z"o/mw/"ra"ff附幼/e附^的分離菌在編號DSM6313下以識別參考(identificationreference)FH曙A1198保藏于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen[德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中性GmbH(DSMZ)，MascheroderWeg1B，38124Braunschweig,德國。孩t生物菌抹K/"o附ad"m艦附幼/msis由Wink等，在InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology2003，53，721-724中進一步描述。4戈替菌林J"iVw附flJwYi"附幼^附&(DSM6313)，還可能4吏用其突變體和/或變體，所述突變體或變體合成一種或多種根據(jù)本發(fā)明的化合物。突變體是下述微生物，其中基因組中的一個或多個基因已被修飾，使得負責該生物生產本發(fā)明化合物的能力的所述一個或多個基因維持功能并且是可遺傳的。這類突變體可以用本身已知的方式，使用物理手段或化學誘變劑制備，所述物理手段例如使用紫外線或X射線輻射，所述化學誘變劑例如乙基曱磺酸酯(EMS)、2-羥基-4-甲氧基二苯曱酮(MOB)或N-甲基-N'-亞硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，或如Brock等，in"BiologyofMicroorganisms",PrenticeHall,第238-247頁(1984)中所述制備變體是微生物的一種表型。微生物具有適應其環(huán)境的能力，因此顯示高度發(fā)達的生理學適應性(flexibility)。微生物的所有細胞均涉及該表型適應，改變的本質不是遺傳限制的(geneticallyconditioned)，并且在改變的條件下是可逆的(H.Stolp，Microbialecology:organism,habitats,activities.CambridgeUniversityPress,Cambridge,GB，第180頁，1988)。如下完成合成一種或多種本發(fā)明化合物的突變體和/或變體的篩選任選地凍干發(fā)酵培養(yǎng)基，用如上所述的有機溶劑，或水和有機溶劑的混合物提取該凍干物或發(fā)酵液，并借助于HPLC或TLC或通過測試生物活性進行分析。發(fā)酵條件可應用于^4"/"o/waflf"m/jfl附^Ze附/s(DSM6313)及其突變體和/或變體。本發(fā)明的又一實施方案是上文所述式(I)化合物，優(yōu)選式(II)或(III)的化合物用于治療細菌感染，特別是革蘭氏陽性菌引起的細菌感染，用于治療病毒感染和/或用于治療疼痛，特別是神經性疼痛或炎癥引發(fā)的疼痛的用途。上述藥物(也稱作藥物制劑或藥物組合物)含有有效量的至少一種式(I)化合物和至少一種可藥用的載體，所述式(I)化合物是如上所述的任何立體化學形式，或任何比例的任何立體化學形式的混合物，或生理學可耐受的鹽或其化學等價物，所述可藥用的載體優(yōu)選地是一種或多種可藥用的載體物質(或媒介物)和/或添加劑(或賦形劑)。藥物可以經口施用，例如以丸劑、片劑、涂膜片(lacqueredtablet)、包衣片、顆粒劑、硬明膠膠嚢劑和軟明膠膠嚢劑、溶液劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑或氣霧劑混合物的形式。然而，也可以經直腸進行(例如以栓劑的形式)施用，或以注射溶液或輸液劑、微嚢劑、植入物或棒(rod)的形式胃腸外地(例如靜脈內、肌內或皮下)進行施用，或經皮或局部進行(例如以軟膏劑、溶液劑或酊劑的形式)施用，或以其他形式(例如以氣霧劑或鼻噴劑的形式)施用。根據(jù)本發(fā)明的藥物以本身已知且本領域技術人員熟悉的方式制備，除14了式(I)化合物外還使用可藥用的惰性無機和/或有機載體物質和/或添加劑，所述式(I)化合物為如上所述的任何立體化學形式，或是任何比例的任何立體化學形式的混合物，或是其生理學可耐受的鹽或化學等價物。為了生產丸劑、片劑、包衣片劑和硬明膠膠嚢劑，可能使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等。用于軟明膠膠嚢劑和栓劑的載體物質為例如脂肪、蠟、半固體和固體的多羥基化合物、天然油或硬化油等。用于生產溶液劑(例如注射溶液)或乳劑或糖漿的合適的載體物質為例如水、鹽水、醇、甘油、多羥基化合物、蔗糖、轉化糖、葡萄糖、植物油等。用于微嚢劑、植入物或棒的合適的載體物質為例如羥乙酸和乳酸的共聚物。藥物制劑通常含有按重量計約0.5到約90%的式(1)化合物和/或其生理學可接受的鹽和/或其前藥。藥物中式(I)活性成分的量(以如上所述的任何立體化學形式，或任何比例的任何立體化學形式的混合物，或其生理學可耐受的鹽或其化學等價物)通常為約0.5到約1000mg，優(yōu)選約1到約500mg。除了式(I)的活性成分(以如上所述的任何立體化學形式，或任何比例的任何立體化學形式的混合物，或其生理學可耐受的鹽或其化學等價物)和載體物質以外，藥物制劑可含有一種或多種添加劑，例如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、防腐劑、甜味劑、著色劑、調味劑、芳香劑、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質、溶劑、增溶劑、用于達到保藏作用的試劑、用于改變滲透壓的鹽、包衣劑或抗氧化劑。它們也可以含有兩種或更多式(I)化合物，其為任何立體化學形式，或任何比例的任何立體化學形式的混合物，或其生理學可耐受的鹽或其化學等價物。一旦藥物制劑含有兩種或更多式(I)化合物，則個體化合物的選擇可針對藥物制劑的特異總體藥理學譜。例如，可將具有較短作用時間的高效化合物與較低效能的長效化合物組合。式(I)化合物取代基的選擇所許可的適應性允許極大控制化合物的生物特性和理化特性，因而允許選擇這類期望的化合物。另外，除了至少一種式(I)化合物外，藥物制劑也可含有一種或多種其他的治療或預防活性成分。使用式(I)化合物時，劑量可在廣泛的限度內變化，并且如常規(guī)和醫(yī)師所知道的，有待在各個個體的案例中合適個體的條件。這取決于例如使用的特定化合物，有待治療的疾病的本質和嚴重性，施用的模式和時間表，或取決于治療的病癥是急性或是慢性，或是否進行預防?？墒褂冕t(yī)學領域公知的臨床途徑確立適當?shù)膭┝?。通常，用于在體重約75kg的成人中達到預期結果的每日劑量為約0.01到約100mg/kg，優(yōu)選為約0.1到約50mg/kg，尤其是從約0.1到約10mg/kg(在各情況下以每kg體重計)。每曰劑量可^L劃分為若干次(例如2、3或4次)部分施用，尤其是在施用相對大量的情況下。通常，根據(jù)個體的表現(xiàn)，可能需要向上或向下偏離指定的每日劑量。實施例1:制備j"/"0附fff/"rawtf附幼/e附/s(DSM6313)的低溫培養(yǎng)物(ciyoculture)在無菌的500ml錐形瓶中用菌抹J"/wo附m/w/Yiw"附/6/e朋/s(DSM6313)接種100ml培養(yǎng)基(1升自來水中10g淀粉、2g酵母提取物、10g葡萄糖、10g甘油、2.5g玉米桿粉、2g蛋白胨、lgNaCl、3gCaC03，滅菌前調至pH7.2)，并在搖床上于27。C和120轉/分鐘下孵育72小時。隨后將lml培養(yǎng)物與1ml無菌保藏溶液(20g甘油、10g蔗糖、70ml去離子水)混合并儲存于-80'C。或者，將瓊脂上的小塊生長良好的培養(yǎng)物用1.5ml50%無菌甘油溶液轉移至Cryotubes(VangardInternational)并在液氮中儲存于-196。C。實施例2:制備Labyrinthopeptin用在瓊月旨平板上生長的爿"/"oimw/wflwfl柳幼/ews/s(DSM6313)培養(yǎng)物接種含有100ml實施例1中所述培養(yǎng)基的無菌500ml錐形瓶，并在搖床上于27'C和120轉/分鐘下孵育。72小時后，各用2ml該預培養(yǎng)物接種以相同量含有相同培養(yǎng)基的其他錐形瓶，并在同樣的條件下孵育168小時?；蛘哂勉輈""o附"flfwmwa附幼/ewsis(DSM6313)的培養(yǎng)物接種含有100ml實施例1中所述培養(yǎng)基的300ml錐形瓶，并在25X:和180轉/分鐘下賻育。72小時后，各用5ml該預培養(yǎng)物接種以相同量含有相同培養(yǎng)基的其他錐形瓶，并在同樣的條件下孵育168小時。實施例3:分離Labyhnthopeptins向根據(jù)實施例2的10升培養(yǎng)液中添加2%HyfloSuper-cd硅藻土(HyfloSupercell;VWR，Darmstadt,德國)，并將培養(yǎng)物濾過壓濾器，從而將培養(yǎng)液與菌絲體(mycd)分離。將濾出液上樣在含1升AmberliteXAD-16樹脂(柱直徑5.5cm，柱高42cm)的柱上，并用5升去離子水和5升含20%曱醇的水。用5升含60%曱醇的水和5升含80%曱醇的水洗脫Labyrinthopeptin。通過HPLC-DAD和LC-ESI-MS鑒定含Labyrinthopeptin的級分，在旋轉蒸發(fā)器上集合性濃縮直至獲得水性殘余物，隨后將其凍干。獲得300mg粗產物。實施例4:對Labyhnthopeptins進行具有二極管陣列檢測的高效液相層析(HPLC-DAD)柱Nucleosil100-C18;20+125mmx4.6mm,5n(Machery-Nagel)流動相水中0.1%H3P04(洗脫液A)和乙腈(洗脫液B)在15分鐘的時間段中洗脫液A中從0%到100。/。洗脫液B的線性梯度流速每分鐘2ml通過210、230、260、280、310、360、435和500nm處的UV/Vis吸收檢測產生的峰。式(II)的Labyrinthopeptin的滯留時間7.75分鐘。實施例5:對Labyrinth叩eptin進行具有電噴射離子化質譜的高效液相層析(HPLC-ESI-MS)柱PurospherRP-18e;125mmx4mm,5(Agilent)17流動相Wasser中0.1%三氟乙酸(洗脫液A)和乙腈中0.1%三氟乙酸(洗脫液B)在10分鐘的時間段中洗脫液A中從5%到100%洗脫液B的線性梯度流速每分鐘1.5ml。通過T分流器將到質鐠儀ES界面的流速降低至每分鐘0.4ml。通過210nm處的UV吸收和其中使用離子阱作為質量分析器的ESI-MS(陽性模式)進行檢測。式(III)的Labyrinthopeptin的滯留時間為5.9分4中。分子量為1922Da。實施例6:純4匕Labyrinthopeptin將根據(jù)實施例3獲得的Labyrinthopeptin粗產物(300mg)溶于二甲基亞砜、甲醇和水的混合物(1:3:6)中，并使用等度洗脫(水+0.1%曱^/甲醇35:65)以每分鐘20ml的流速在Nucleosil100-ds柱(顆粒尺寸10p，柱尺寸250x16mm)上通過層析分離組分。通過HPLC(比較實施例4)分析級分。獲得62mg99%純度的式(111)的Labyrinth叩eptin。實施例7:Labyrinthopeptin(III)的一般表征式(III)化合物在暴露于氧氣后被氧化為對應的亞砜。式(III)化合物在2Asp-3Trp和llrThP-12Gly之間含有2順式-酰胺。實施例8:高分辨率ESI-FTICR-質鐠法通過注射泵使式(III)的Labyrinthopeptin在甲醇中的溶液(c=0.2mg/ml)以2nl/分鐘的流速進入裝備了電噴射源的BrukerApexIIIFTICRMS(7T磁鐵)。使用外部校準以陽性模式記錄波鐠。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>C85H11()N2()024S4的理論質量[M1922.6885分子式C85H110N20O24S4實施例9:氨基酸分析水解在氮氣氛中用6NHCl、5。/。苯酚于110。C下將Labyrinthopeptin(III)(0.05mg)水解24小時。在氮氣流中干燥水解產物。非手性GC-MS:將水解產物與雙-(三曱代甲硅烷基)三氟-乙酰胺(BSTFA)/乙腈(1:1)一起在150。C加熱4小時。對GC-MS實驗，使用DB5-融合的-二氧化硅-毛細管(I=15mx0.25nm融合的二氧化硅，涂有二甲基-(5%-苯基曱基)-聚硅氧烷，d產0.10ftm;溫度程序T=65。/3V6/280'C)。手性GC-MS:于110。C下用200jU2NHCl將水解產物在乙醇中酯化30分鐘并干燥。隨后，于110。C下在100nl二氯甲烷中用25plTFAA將混合物酰化10分鐘并干燥。對GC-MS而言，使用融合的二氧化硅毛細管(I=22mx0.25融合的二氧化珪，涂有chirasil-S-Val(Machery-Nagel)，df=0.13nm;溫度程序T=55。/3V3，2/180。C)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例10:NMR光i普法在裝備了5mmZ-Grad三元共振探頭的AMX600MHzNMR波譜儀(Bruker,Karlsruhe,德國)和裝備了5mmZ-Grad寬鐠帶逆轉探頭的DRX500NMR波鐠儀(Bruker，Karlsruhe,德國)上測量2-DNMR譜(COSY，TOCSY，NOESY，HSQC，HMBC)。下表顯示測量中獲得的信號。DMSO-d6中式(III)的Labyrinthopeptin的NMR數(shù)據(jù)0.68:0.71;0,75;0.78;1,05;1,07;1.10;1,35;1.40;1,42;1,49;1.90;1.96;2,00;2.10;2,17;2.26;2.77;2,86;2.90;2,97;3.03;3.14;3.16;3.18;3,18;3.20;3.24;3.29;3.30;3箭'3.59;3.67;3.67;3.72;3,99;4,02;4,03;4,10;4.13;4.14;4,16;4,19;4.34;4.36;4.45;4.49;4.59;6鄰；7,26;7.00;7.04;7,08;7.08;7.10:7.18:7.22;7.23;7.24;7.24;7.31:7.35;7,36;7.42;7.51;7.53;7.65;7.65;7.69;7.77;7.84;7.98;譜;8.01;8,56;濕O;10.81.19.7;21,3;21,4;22,6;23,04;23,2;23,7;26.4;26.4;27'1;33.4;35,2;35,4;36.7;38.3:40.0:40.5:40J;40.8:40,8:41.2:41.2:43.4;48.4;48.7;49.0;51.2;51.4:52.5;52.6;52.7:53,2:53,5;54.0;56.9;60.0;60.3;66.4;109.8;110.6;111,2;111,2;117,4;118,1;118.1;118,2;120.7;120.7;122.1:123.4;126,5;127.2;127.3;127.8;129.4;136.0;136,1;136.6;140.8;徹4;173眾174.3;176,9.實施例11:Labyrintopeptin(III)的X射線晶體學結晶條件將蛋白質溶于0.02MTrispH8.2(濃度7mg/ml)中。晶體在室溫下通過蒸汽滴擴散(vapourdropdiffusion)從該蛋白質溶液與60%乙醇、0.75%PEG6000、0.025M乙酸鈉和0.05M氯化鈉的1:1混合物中生長。晶體生長約l周。測量在Bruker3-環(huán)衍射儀上用旋轉陽極和鏡面單色CuK-a輻射(mirrormonochromatedCuK-alpharadiation)收集X-射線數(shù)據(jù)。輻射強度在SMART6000CCD區(qū)域監(jiān)測器上收集。晶體數(shù)據(jù):式NaN20C85S4048NaC85N20024S4式重量2220.291834.82結晶體系正交晶空間群(spacegroup)P21212(第18號)晶胞維度(unitcelldimension)a=41.136()Ab=12.885()A20<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例12:氧化Labyrinthopeptin(III)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在室溫下4奪50mgLabyrinthopeptin(III)(0.026mmol)溶于1mlDMSO中并與11mgl-羥基-l-氧化物-l，2-苯碘酰-3(1H)-酮(l國Hydroxy-l-oxide-l，2-Benziodoxol-3(1H)-one，IBX，0.039mmol)混合。將混合物在40。C攪拌6小時，在室溫下再攪拌12小時，然后在帶有XTerraPr印MSC1810jim前置柱(Waters,尺寸19x10mm)的PhenomenexLunaAxia5C18(2)柱(尺寸100mmx30mm)上通過反相HPLC純化。在30分鐘內使用含5%到95%乙腈的水(含0.1%乙酸銨，pH7.0)的梯度作為洗脫液。將柱流出液(60ml/分鐘)分級并通過UV檢測。級分7到ll含有期望的化合物。所述級分在凍干后產生25mg(50%)。通過質^普法(BrukerDaltonicsMicroTof)表征產物。UV:222sh，278nmESI-MS:MW=1920.66518(單MW)分子式C85H108N20O24S4分子量(MW)=1922.2實施例13:Labyrinthopeptin(III)C-末端的肽合成將40mgLabyrinthopeptin(III)(0.021mmol)溶于2ml無水二曱基曱酰胺中并用10mg(0.045mmol)二-叔-丁基-重碳酸鹽(Boc20)和7mg(0.054mmol)二異丙基乙胺在室溫下處理1小時。然后添加6.8mg(0.063mmol)節(jié)胺和丙基磷酸酐在DMF中的50%溶液50nl(0.072mmol)。在含有XBridgeShieldC1810前置柱(Waters,尺寸19x10mm)的WatersXBridgeShield5,C18Saule(尺寸100mmx30mm)上通過反相HPLC純化反應混合物。在30分鐘內使用含5%到95%乙腈的水(含0.1%乙酸銨，pH7.0)的梯度作為洗脫液。將柱流出液(60ml/分鐘)分級并通過UV檢測。將級分30到31合并并產生9.6mg(22。/。)期望的化合物。通26過質譜法(BmkerDaltonicsMicroTof)表征產物。UV:222sh,276nmESI-MS:MW=2U1.7卯18(單MW)分子式C97H125N21025S4分子量(MW)=2113.5實施例14:Labyrinthopeptin(III)N-末端的肽合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>將5mg(0.028mmol)2-氯誦4,6-二甲氧基畫l，3，5-三噪(triazin)(CDMT)溶于2ml無水二曱基曱酰胺中，并與8.6mg(0.085mmol)N-曱基嗎啉(NMM)混合。將混合物在室溫下攪拌l小時。添加3.3mg(0.028mmol)正己酸并將混合物在室溫下再攪拌30分鐘。隨后添加40mg(0.021mmol)Labyrinthopeptin(III)，并將得到的混合物在室溫下再攪拌2小時。在帶有XBridgeShieldC1810前置柱(Waters,尺寸19x10mm)的WatersXbridgeShield5jimC18Saule(尺寸100mmx30mm)上通過反相HPLC純化反應混合物。在30分鐘內使用含5%到95%乙腈的水(含0.1%曱酸，pH2.0)的梯度作為洗脫液。將柱流出液(60ml/分鐘)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>分級并通過UV檢測。將級分38到40合并并產生11.0mg(26。/。)期望的化合物。通過質鐠法(BrukerDaltonicsMicroTof)表征產物。UV:220sh,278應ESI-MS:MW=2020.75738(單MW)分子式C91H120N20O25S4分子量(MW)(MW)=2022.3實施例15:抗菌活性將生物在液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(beefextractbroth)中培養(yǎng)后，通過用新鮮的培養(yǎng)基稀釋，將細菌懸浮液調節(jié)至確定的密度(5-105生物/1111)。將Labyrinthopeptin(III)溶解并用水以幾何稀釋系列(因數(shù)2)稀釋。將各個稀釋步驟中1.5ml溶液與13.5ml液體瓊脂(Mtiller-Hinton瓊脂)在約45。C下混合。培養(yǎng)皿中最大的化合物濃度通常為100mg/l。使用無化合物的瓊脂平板作為對照。培養(yǎng)基冷卻并固化后，使用每個接種點遞送5-104個菌落形成單位(cfu)的多點接種器(MultipointInoculator)同時用20種不同的細菌菌林接種瓊脂平板，然后在有氧條件下于37。C孵育17小時。醉育后，肉眼檢查平板得到細菌生長不再是可見的最低化合物濃度。忽略接種點處的單個菌落或混濁(haze)生長。抗菌作用被評價為測試化合物的最小抑制濃度(MIC:細菌生長不再是肉眼可見的最低化合物濃度)測^式生物MIC金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/r盧cocc"51SG51112.5mg/1金黃色葡萄球菌28512.5mg/1金黃色葡萄球菌5033.13mg/1酉良膿鏈3求菌(5^e/;tococcMS308A3.13mg/1釀膿鏈J求菌77A3.13mg/128尿鏈球菌(5^/;tococc附/flec/"附)D6.25mg/1實施例16:抗病毒活性病毒只能在活細胞中繁殖。因此，病毒研究在細胞培養(yǎng)物中進行。選擇病毒是因為它們作為傳染物的重要性或其典型的生物化學或形態(tài)學結構。在96-孔微量滴定板中制備Labyhnthopeptin(III)的稀釋系列。根據(jù)感染性病毒添加Hela或Vero細胞，在24小時的孵育內得到匯合的單層。孵育3小時后，以下述濃度向細胞添加各病毒，所述濃度預期在2天內完全破壞細胞單層。將培養(yǎng)物在充氣的孵育箱(空氣中5%<:02)中于37。C下孵育。24小時后，通過顯微鏡檢查評價細胞培養(yǎng)物中測試化合物的最大耐受劑量(MTD)。將結果與非感染的組織對照和相應的感染對照比較編號宿主生物測試生物抑制[mg/lj1Vero細胞真菌病毒(RNA/流感A/Aichi)44.442Hela細胞單純皰瘆(DNA)，1(型)133.333Vero細胞單純皰瘆(DNA),2(型)VR73444.444Hela細胞腺病毒(DNA)，5"133.33實施例17:神經性疼痛活性在神經性疼痛的周圍神經損傷(sparednerveinjury,SNI)小鼠模型中研究Labyrinth叩eptin(III),從而證實對觸覺異常性疼痛的活性。在全身麻醉下，將成年雄性C57B6小鼠(22.7g士0.26SEM)中坐骨神經的兩個主要分支結扎并橫切，保持腓腸神經完整。用自動的vonFrey檢驗測定觸覺異常性疼痛使用清除穿刺針(dumpneedlestick)將后爪的跖部皮膚暴露于強度遞增至5g的壓力刺激。動物用縮回后爪來應答的力(以克計)用作觸覺異常性疼痛的讀數(shù)(read-out)。該研究在神經損傷后7天進行6個小時，并在24小時后額外測量。在神經^f黃切后兩天內，觸覺異常性疼痛發(fā)展完全并且在至少兩周內維持穩(wěn)定。作為單次應用(3mg/kg)靜脈施用化合物。選29擇l:1:18(乙醇Solutol:躊酸鹽緩沖的鹽水)的媒介物作為靜脈應用的媒介物。爪縮回閾值(PWT)測量已用于計算顯著的處理效應，并用于參考時間段(6小時)內的AUC計算和隨后的。/。益處計算。對統(tǒng)計分析而言，以兩種方式使用同側后爪的PWT值第一種基于特定時間(在24小時的周期內)的PWT值進行兩因素ANOVA,第二種對未轉化的5AUC值IAUCl-6小時|進行單因素ANOVA。下述實驗揭示了靜脈應用各化合物后1到6小時，與媒介物組的高度顯著的差異使用重復測量的兩因素方差分析(重復因子TIME,分析變量PWT)，隨后進行補償分析(因子GROUP對因子TIME各水平的效應(Winer分析)，分析變量PWT)，隨后進行因子TREATMENT對因子TIME各水平的鄧奈特檢驗(Dunnett'stest)(雙側比較vs水平VEHICLE)。該效應在應用后24小時消失。使用S|AUCl-6小時|值的單因素ANOVA分析揭示了p<0.0001的p值。鄧奈特分析對兩種化合物均給出顯著的處理效應。使用同側媒介物組(0%益處)的IAUCl-6小時|值和所有三組對側的所有IAUCl-6小時|值評價處理的益處百分比(100%益處=最大可能效應)。與這些界限相比，Labyrinthopeptin(ni)達到了97%的益處?？偠灾?，在神經性疼痛的SNI小鼠模型中，該化合物顯著地減輕了觸覺異常疼痛。實施例18:炎癥引發(fā)的疼痛活性在小鼠中角叉菜膠(CAR)誘導的后爪炎癥模型中研究Labyrinthopeptin(III)，從而驗證對熱痛覺過敏(thermalhyperalgesia)的活性，所述熱痛覺過敏是炎癥引發(fā)的疼痛的一種典型讀數(shù)。誘導后爪炎癥在輕微的全身異氟烷麻醉下，將20nl鹽水中的2。/oCAR(Sigma,Deisenhofen,德國)注射進雄性C57B6小鼠兩個后爪的跖面中。使用安裝了小型照相機的市售設備(PlantarTestUgoBasileBiologicalResearchApparatus,Comerio,Italy)將爪暴露于確定的溫度刺激下，測定爪縮回潛伏期(PWL)，所述照相機確保將紅外線熱準確置于目的后爪下。整個研究周期(6小時)內將小鼠保持在測試籠中。熱痛覺過敏的測量如果動物搖動其受影響的后爪，則測量后爪反射紅外光的持續(xù)時間的計時器由研究者開始和終止。設定16秒的斷開，以防止組織損傷。在CAR注射之前進行研究，并在注射之后進行6小時。以秒計的爪縮回潛伏期用作讀數(shù)，用于進一步的分析。選擇l:1:18(乙醇Solutol:磷酸鹽緩沖的鹽水)的媒介物用作靜脈應用的J某介物。爪縮回潛伏期(PWL)測量已用于計算顯著的處理效應，并用于參考時間段(6小時)內的AUC計算和隨后的。/。益處計算。對統(tǒng)計分析而言，以兩種方式使用兩只后爪的PWL值第一種基于特定時間(在6小時的周期內)的PWL值進行兩因素變量分析(ANOVA),第二種對未轉化的5AUC值IAUCl-6小時l進行單因素ANOVA。下述實驗揭示了靜脈應用兩種劑量后1到2小時，與媒介物組的高度顯著的差異使用重復測量的兩因素方差分析(重復因子TIME，分析變量PWL)，隨后進行補償分析(因子GROUP對因子TIME各水平的效應(Winer分才斤)，分析變量PWL)，隨后進4亍因子DOSAGE對因子TIME各水平的鄧奈特檢驗(雙側比較vs水平0=VEHICLE)。該效應在應用后4小時消失。使用8|AUCl-6小時l值的單因素ANOVA揭示了p0.0001的p值。鄧奈特分析對兩種劑量均給出顯著的處理效應。使用媒介物組(0%益處)的IAUCl-6小時|值和注射CAR前的所有IAUCl-6小時l值評價處理的益處百分比(6小時間的理論基線=最大可能效應=100%效應)。與這些界限相比，1mg/kg劑量組達到了37%的益處，且10mg/kg組達到了34%的益處?？偠灾?，該化合物在炎癥引發(fā)疼痛的CAR小鼠模型中顯著降低了熱痛覺過敏。3權利要求1.式(I)化合物，其中R1為H、C(O)-(C1-C6)烷基或C(O)-O-(C1-C6)烷基；R2為OH、NH2、NH-(C1-C6)烷基、NH-(C1-C4)亞烷基-苯基或NH-(C1-C4)亞烷基-吡啶基；R3和R4彼此獨立地為H或OH，或R3和R4一起為＝O；且m和n彼此獨立地為0、1或2；所述化合物為任何立體化學形式，或是任何比例的任何立體化學形式的混合物，或其生理學可耐受的鹽。2.根據(jù)權利要求l的式(I)化合物，其為式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.根據(jù)權利要求1或2的式(I)化合物，其中Rl為H。4.根據(jù)權利要求1或3的式(I)化合物，其中R2為OH。5.根據(jù)權利要求1或4的式(I)化合物，其中R3和R4為H或OH，其中如果R3為OH則R4為H,或如果R3為H則R4為OH，或R3和R4—起為-O。6.根據(jù)權利要求1到5中任一項的式(I)化合物，其中R3為OH且R4為H，或如果R3為H則R4為OH。7.根據(jù)權利要求1到6中任一項的式(I)化合物，其中m和n均為O,或m和n均為2，或m為0且n為2，或m為2且n為0。8.根據(jù)權利要求1到7中任一項的式(I)化合物，其中m和n均為0。9.根據(jù)權利要求1到8中任一項的式(I)化合物，其中Rl為H;R2為OH;R3和R4彼此獨立地為H或OH，其中如果R3為OH則R4為H,且如果R3為H則R4為OH;且m和n彼此獨立地為0、1或2。10.根據(jù)權利要求1到9中任一項的式(I)化合物，其中Rl為H;R2為OH;R3和R4彼此獨立地為H或OH，其中如果R3為OH則R4為H,且如果R3為H則R4為OH;且m和n均為0，或m和n均為2，或m為0且n為2，或m為2且n為0。11.根據(jù)權利要求1到10中任一項的式(I)化合物，其中Rl為H;R2為OH;R3和R4彼此獨立地為H或OH，其中如果R3為OH則R4為H，且如果R3為H則R4為OH;且m和n均為0。12.根據(jù)權利要求1到11中任一項的式(I)化合物，其為式(III)化合物13.從J"i7io附"fiTwYi"fl附幼Ze附/s(DSM6313)分離的化合物，其特征在于單種同位素中性分子量為1922.6872Da，且分子式為C85H11()N2。024S4。14.根據(jù)權利要求1到13中任一項的化合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療細菌感染、病毒感染和/或疼痛。15.藥物組合物，其包含至少一種根據(jù)權利要求1到13中任一項的式(I)化合物，和至少一種可藥用成分。16.用于制備根據(jù)權利要求1到13中任一項的式(I)化合物的方法，其包括a)在合適的條件下，在培養(yǎng)基中發(fā)酵菌林爿"/w0附flw"/w幼/ews^(DSM6313)，或其變體和/或突變體之一，直到培養(yǎng)基中產生一種或多種式(I)化合物，b)從培養(yǎng)基中分離式(I)化合物，和C)適當時將式(I)化合物衍生化，和/或適當時將其轉化為生理學可耐受的鹽。17.根據(jù)權利要求16的方法，其中化合物(I)為式(II)化合物。18.根據(jù)權利要求16或17中任一項的方法，其中化合物(I)為式(III)化合物。19.根據(jù)權利要求16到18中任一項的方法，其中m和n均為0，或m和n均為2，或m為0且n為2，或m為2且n為0。全文摘要本發(fā)明涉及獲自Actinomaduranamibiensis(DSM6313)的式(I)化合物，其用于治療細菌感染、病毒感染和/或疼痛的用途，和包含它的藥物組合物，所述式(I)中R3和R4獨立地為H或OH，且其中m和n彼此獨立地為0、1或2。式(I)化合物已被定義為Labyrinthopeptin，并由18個氨基酸的高度橋連的肽結構組成，所述肽結構含有羊毛硫氨酸樣殘基和α二取代的氨基酸類似物。該氨基酸序列為XDWXLWEXCXTGXLFAXC，其中兩個Cys殘基形成二硫鍵，且各X獨立地表示涉及橋連鍵的非天然氨基酸之一。文檔編號C07K14/36GK101522705SQ200780037217公開日2009年9月2日申請日期2007年9月25日優(yōu)先權日2006年10月6日發(fā)明者G·謝爾里克,G·賽博特,H·居林,H·霍夫曼,I·溫克勒,J·溫克,K·邁因德爾,L·托蒂,L·韋爾泰希,M·布倫斯特魯普,R·聚斯穆特申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司