專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新型抗病毒分子drp的抗病毒作用、實(shí)施方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及死亡抵抗蛋白(Death Resistant Protein, DRP)在病毒感染性疾病中的效應(yīng)、作用機(jī)制、實(shí)施方法和用途。
背景技術(shù)：
病毒是由一種以核酸(核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA)為核心，以蛋白質(zhì) 為外殼(衣殼capsid)而組成的微小顆粒，其核酸可分為單股或雙股，線形或球形。病 毒是最小的生物病原體，從20nm到300nm不等其中最大的是痘類(lèi)病毒，例如痘苗病毒 為300nmX200nm，在普通光學(xué)顯微鏡下勉強(qiáng)可見(jiàn)；中等大小的如流行性感冒病毒，直徑為 80 IOOnm ；小型病毒如流行性乙型腦炎病毒，直徑為20nm，必須在電子顯微鏡下才能見(jiàn)到基礎(chǔ)病毒學(xué)，莽克強(qiáng)等著，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年第一版；分子病毒學(xué)，黃文林等著，人民 衛(wèi)生出版社，2001年第一版。隨著病毒學(xué)和免疫學(xué)研究的進(jìn)展，人們對(duì)病毒性疾病(Viral diseases)的認(rèn)識(shí)也 逐漸發(fā)展。最常用的病毒分類(lèi)方式是根據(jù)核酸的性質(zhì)(RNA或DNA)來(lái)對(duì)病毒進(jìn)行分類(lèi)，一 般將病毒分為DNA病毒和RNA病毒。常見(jiàn)的致病性DNA病毒主要有人乳頭狀瘤病毒(HPV)、 乙肝病毒(HBV)、EB病毒等，常見(jiàn)的致病性RNA病毒包括流行性出血熱病毒、人獲得性免疫 缺陷病毒(HIV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒以及流感病毒等基礎(chǔ)病毒學(xué)，莽克強(qiáng)等 著，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年第一版；分子病毒學(xué)，黃文林等著，人民衛(wèi)生出版社，2001年第 一版。病毒性疾病根據(jù)臨床表現(xiàn)及傳染方式，可以分為呼吸道病毒、蟲(chóng)媒病毒、出疹性病 毒、腸道病毒所致感染等。病毒性疾病往往引起比較嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，每每引起暴發(fā)流行。病毒感染后除了 短期內(nèi)引起感染所引起的局部炎癥外，長(zhǎng)期的病毒感染可以導(dǎo)致腫瘤以及器官功能衰竭等 嚴(yán)重的疾病，如HPV感染引起的宮頸癌、HBV感染引起的肝癌、肝硬化和肝功能衰竭、EB病毒 引起的鼻咽癌、HIV引起的免疫功能缺陷和卡波濟(jì)氏肉瘤、SARS引起的呼吸功能衰竭以及 流感病毒引起的呼吸功能障礙等基礎(chǔ)病毒學(xué)，莽克強(qiáng)等著，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年第一 版；分子病毒學(xué)，黃文林等著，人民衛(wèi)生出版社，2001年第一版。我國(guó)是一個(gè)病毒性疾病高發(fā)的大國(guó)，如我國(guó)HBV感染患者估計(jì)有感染者1. 2億，是 世界上最多的HBV大國(guó)；不能忘記的是2002年SARS在我國(guó)的大流行；另外，HIV以及可能 的流感病毒爆發(fā)也時(shí)刻威脅著國(guó)民的身體健康。每一種流行性病毒感染都可以造成極大的人體健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的損失，然而至今 對(duì)抗病毒尚無(wú)特效藥，臨床治療重點(diǎn)就在對(duì)癥和保守治療，因此病毒性疾病的發(fā)病的分子 和免疫學(xué)機(jī)理的研究和治療策略的研究具有重大的科學(xué)意義和顯示意義。干擾素(interferon，IFN)是一組體內(nèi)存在的、有廣泛生物活性的微量調(diào)節(jié)蛋白， 具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)活性，已被廣泛用于臨床。干擾素是病毒感染后宿 主細(xì)胞釋放的具有抗病毒特性的糖蛋白。根據(jù)其生物學(xué)、生物化學(xué)、基因特征及細(xì)胞來(lái)源， 可分為四種類(lèi)型，S卩α、β、Y、ω型干擾素，分別來(lái)源于白細(xì)胞(單核/巨噬細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(T-cell和滋養(yǎng)層細(xì)胞)。干擾素具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)3種功 能。其中α、β型IFN又稱(chēng)為I型干擾素，在病毒性疾病的治療中具有重要地位。干擾素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的治療，如帶狀皰疹、皰疹性口咽、小兒病毒性 肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS等，可以抑制病毒的復(fù)制并調(diào) 節(jié)病毒特異性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，是目前已經(jīng)得以證明并商業(yè)化應(yīng)用于臨床病毒性治療的有 效生物制劑。人們對(duì)于機(jī)體識(shí)別外來(lái)病毒的分子機(jī)制并不完全了解，但是隨著Toll樣分子 的發(fā)現(xiàn)，機(jī)體針對(duì)病毒所產(chǎn)生的IFN的產(chǎn)生機(jī)制和作用機(jī)制逐步得到了認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn) TLR3 主要識(shí)別病毒分子中雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)Takeuchi，0.等， Immunity. 1999 ；11 443-451 ；Ozinsky, A.等,Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ；97 13766-13771 ；Alexopoulou, L.等，Nature. 2001 ；413 :732_738；人類(lèi) TLR7 和 TLR8 基因 定位于染色體Xp22，識(shí)別病毒分子中的單鏈RNA(single-stranded RNA, ssRNAs)Heil， F.等，Science. 2004 ；303 1526-1529；人類(lèi)TLR9定位于染色體3ρ21· 3，識(shí)別細(xì)菌和病毒 DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核昔酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG 0DN) [Hemmi,H.等，Nature. 2000 ;408 :740_745。另外，病毒還可以通過(guò)TLR非依賴(lài)方式產(chǎn)生I 型干擾素Baccala，R.等，Nat. Med. 13，543-551 (2007)。其中，TLR3 可以通過(guò) TRIF-TBK1/ IKK ε -IRF3信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生；TLR7/8/9可以通過(guò)MyD88_IRF7信號(hào)通 路活化誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生；另外，一些進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒可以通過(guò)RIG-I/MDA-5介導(dǎo) 的TBK1/IKK ε -IRF3信號(hào)通路活化通過(guò)TLR非依賴(lài)方式誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生Baccala， R.等，Nat. Med. 13，543-551 (2007)。能否誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生以及能否抑制病毒的復(fù) 制和擴(kuò)增是檢驗(yàn)藥物治療病毒性疾病的非常有效的標(biāo)準(zhǔn)。死亡抵抗蛋白(DRP)是第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所于1998年利用大規(guī)模測(cè)序的 方法，從健康成年人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的cDNA文庫(kù)進(jìn)行基因表達(dá)分析后 于1998年發(fā)現(xiàn)的，并已經(jīng)在基因數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中登錄(GenBank No. AF077599)。DRP,又稱(chēng)Nrdpl、FLRF或者RBCC，已有研究表明DRP是E3泛素連接酶的一種， 可以泛素化并降解表皮生長(zhǎng)因子家族成員ErbB3和BRUCEAbdullah，J. Μ.等Blood Cells Mol. Dis. 27，320-333 (2001) ；Diamonti, Α. J.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 2866-2871(2002) ；Qiu, X. B.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99，14843-14848(2002) ；Qiu, X. B.等 EMBO J. 23，800-810(2004) ；Cao，Z.等 Mol. Cell Biol.27，2180-2188(2007) ；Yen, L.等Cancer Res. 66，11279-11286 (2006)。DRP是一個(gè)317個(gè)氨基酸組成的蛋白，包括4個(gè) 功能域RING finger功能域(l_57aa)，B_box功能域(2個(gè)TRAF樣鋅指功能域，58_134aa)， 卷曲螺旋(coiled-coil)功能域(CC，135_178aa)和 C 端的 ErbB3 結(jié)合區(qū)域(179_317aa)。雖然已有的研究揭示了 DRP/Nrdpl在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等方面的作用，但是對(duì) 于其免疫功能的研究還沒(méi)有。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)出一種可有效抵抗病毒感染、抑制炎性因子產(chǎn)生 的免疫學(xué)活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是提供了 DRP蛋白或其編碼序列在有效抵抗病毒感染、抑制病毒復(fù)制、促進(jìn)I型干擾素產(chǎn)生中的新用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了死亡抵抗蛋白及其編碼序列在制備用于預(yù)防或治 療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下組的一 種或多種因病毒感染引起的疾病和/或征狀病毒感染后的復(fù)制；病毒感染局部的細(xì)胞和 組織損傷；或病毒感染造成的器官功能損傷。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述病毒感染局部的細(xì)胞選自皮膚的上皮細(xì)胞、外周血的免疫 細(xì)胞、免疫器官中的免疫細(xì)胞以及實(shí)體器官的組成細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述病毒感染的組織選自皮膚、肝臟、腎臟、腦或肺臟。在另一優(yōu)選例中，所述病毒感染造成的器官功能損傷選自皮膚、肝臟、腎臟、腦或 肺臟的功能損傷。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀選自帶狀皰疹、皰疹性口 咽、小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引 起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán) 重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述死亡抵抗蛋白及其編碼序列誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生，從而 預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述I型干擾素選自IFN- α和IFN- β，優(yōu)選為IFN- β。在另一優(yōu)選例中，所述器官選自肝臟、脾臟、腦、腎臟或皮膚。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述死亡抵抗蛋白選自(a) SEQ ID NO 2 的氨基酸序列；(b)與SEQ ID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀 活性的蛋白；(c) (a)或(b)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有 預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。在一個(gè)優(yōu)選例中，死亡抵抗蛋白是天然純化的蛋白、化學(xué)合成的產(chǎn)物、或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生，優(yōu)選為人死亡抵抗蛋白。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述宿主選自細(xì)菌、酵母、高等動(dòng)物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述死亡抵抗蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病 和/或征狀的分子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂 質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、復(fù)制 缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
在一個(gè)優(yōu)選例中，在給予本發(fā)明的藥物組合物之前、同時(shí)或之后，給予具有預(yù)防或 治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)。所述具有預(yù)防或治療病毒感染相 關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)選自臨床常用抗病毒藥物，優(yōu)選為選自下組的一 種或多種抗甲型流感病毒表面M2受體、抗神經(jīng)氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫 酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及其編碼序列占藥 物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%o在一個(gè)優(yōu)選例中，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及其編碼序列占藥物組合物總 重量的1 95wt%，優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；(B)預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)；以及(C)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它 活性物質(zhì)選自臨床常用抗病毒藥物，優(yōu)選為選自下組的一種或多種包括抗甲型流感病 毒表面M2受體、抗神經(jīng)氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗 HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的 方法，所述方法包括給予需要預(yù)防或治療的對(duì)象有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀選自病毒感染后的復(fù)制；病 毒感染后的復(fù)制；病毒感染局部的細(xì)胞(皮膚的上皮細(xì)胞、外周血的免疫細(xì)胞、免疫器官中 的免疫細(xì)胞以及實(shí)體器官的組成細(xì)胞)和組織(包括皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺臟)損傷；病 毒感染造成的器官(包括皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺、脾臟)功能損傷。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀選自帶狀皰疹、皰疹性口 咽、小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳 頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸 綜合征病毒或流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述死亡抵抗蛋白及其編碼序列誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生，從而 預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述I型干擾素選自IFN-α和IFN-β，優(yōu)選為IFN-β。在另一優(yōu)選例中，所述器官選自皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺或脾臟。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。


圖1 :DRP真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264. 7細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的促 進(jìn)效果。其中，圖IA為定量RT-PCR分析結(jié)果；圖IB為ELISA分析結(jié)果(“**”，Ρ < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。
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圖2 穩(wěn)定干擾DRP在RAW264. 7細(xì)胞的表達(dá)對(duì)LPS、CpG、Poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β、 CXCLlO和CCL5產(chǎn)生的抑制效果。其中，圖2a為DRP干擾細(xì)胞系的鑒定；圖2b為定量RT-PCR 分析；圖2c為ELISA分析。“M”代表分子量標(biāo)記；“Ctrl RNAi"代表表達(dá)亂序?qū)φ崭蓴_ RNA (scrambled control RNA interference)的干擾載體；"DRP RNAi，，代表表達(dá) DRP 特異 性的干擾RNA的干擾載體。圖3 過(guò)表達(dá)DRP對(duì)VSV病毒在RAW264. 7細(xì)胞內(nèi)復(fù)制與擴(kuò)增的抑制效果。其中， 圖3a為培養(yǎng)上清的PFU分析；圖3b為RAW264. 7細(xì)胞的VSV L基因的定量RT-PCR分析 (“**”，P < 0. 01)。圖4 :DRP腺病毒靜脈注射對(duì)VSV病毒在肝臟的擴(kuò)增的抑制效果(“#”，P < 0. 01)。圖5 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)π∈髞?lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞IFN-β的產(chǎn)生的促進(jìn)效果。其中，圖 5a為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞DRP的表達(dá)鑒定；圖5b為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨 噬細(xì)胞IFN- β定量RT-PCR分析；圖5c為DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞IFN- β ELISA分 析("Dn-DRP"為功能缺陷型 DRP，‘‘*，，，P < 0. 05 ；“**，，，P < 0. 01)。圖6 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)π∈髞?lái)源腹腔巨噬細(xì)胞IFN-β和IRF3報(bào)告基因的活化的促進(jìn) 效果(“▲”，P > 0. 05 ；“*”，P < 0. 05 ;“**”，P < 0. 01 ；“***”，P < 0. 001)。圖7 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV病毒在腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增的抑制效果。其中， 圖7a為培養(yǎng)上清的PFU分析；圖7b為VSV L基因的定量RT-PCR分析(“#”，P < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。圖8 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV感染后血清中IFN-β的產(chǎn)生的促進(jìn)效果(“#”，Ρ < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。圖9 =DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV感染后所導(dǎo)致的肝臟損傷的抑制效果(“**”，Ρ < 0. 01)。圖10 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV感染后在肝臟的復(fù)制和擴(kuò)增的抑制效果(“**”，P < 0. 01)。實(shí)施方式本發(fā)明人通過(guò)大量的研究和動(dòng)物模型試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DRP在病毒感染性疾病中，具有 促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生、抑制病毒的復(fù)制以及病毒在體內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致的器官功能損傷的功 能。在此，基礎(chǔ)上本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，針對(duì)IFN調(diào)節(jié)相關(guān)基因進(jìn)行應(yīng)用研究是病毒分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué) 研究的熱點(diǎn)，將IFN促進(jìn)基因的核苷酸和蛋白質(zhì)應(yīng)用于病毒性疾病的預(yù)防和治療是人工干 預(yù)病毒性感染的有效技術(shù)，因此無(wú)論是在功能基因組研究，還是病毒相關(guān)地基因治療方面 均具有廣闊地應(yīng)用前景。發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DRP能夠促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生并抑制水皰性口炎病 毒(vesicular stomatitis virus, VSV)病毒在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增。在水泡口 炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)的感染模型中，觀察到DRP能夠顯著增高血清 中IFN-β的水平，抑制VSV在小鼠肝臟的復(fù)制，減輕VSV誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷，提示DRP可 能具備病毒性疾病的應(yīng)用前景。因此本發(fā)明還公開(kāi)了應(yīng)用該抗病毒分子于病毒感染性疾病 的預(yù)防和治療的方法和策略，特別是可用于病毒感染所導(dǎo)致的肝臟損傷。換言之，本發(fā)明針對(duì)具有抗病毒作用的新型抗病毒分子DRP，對(duì)免疫細(xì)胞中巨噬細(xì) 胞在微生物成分作用下的干擾素的產(chǎn)生進(jìn)行了研究，并且驗(yàn)證了應(yīng)用該分子的序列對(duì)病毒性疾病動(dòng)物模型的治療和保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)證明1)過(guò)表達(dá)DRP可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞系IFN-β 的產(chǎn)生；2)過(guò)表達(dá)DRP可以抑制巨噬細(xì)胞系中VSV病毒的復(fù)制和擴(kuò)增；3)DRP腺病毒靜脈 注射可以抑制VSV病毒在肝臟的擴(kuò)增；4)DRP轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞 IFN-β的產(chǎn)生；5)DRP轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞IFN-β和IRF3報(bào)告基因 的活化；6)DRP轉(zhuǎn)基因抑制VSV病毒在腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增；7)DRP轉(zhuǎn)基因可以促 進(jìn)VSV感染后血清中IFN-β的產(chǎn)生；8)DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制VSV感染后所導(dǎo)致的肝臟損傷； 9)DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制VSV感染后在肝臟的復(fù)制和擴(kuò)增。本發(fā)明針對(duì)DRP基因的不同的核苷酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用以促進(jìn)I型IFN的表達(dá)，抑 制病毒體內(nèi)外的復(fù)制和擴(kuò)增，降低病毒感染所造成的肝臟損傷。這些發(fā)明證實(shí)DRP的相關(guān) 產(chǎn)物可望成為治療和預(yù)防病毒性疾病的有效手段。DRP蛋白(多肽)如本文所用，術(shù)語(yǔ)“死亡抵抗蛋白(多肽)”、“DRP蛋白(多肽)”、“DRP”、“Nrdpl”、 “FLRF”或者“RBCC”可互換使用，是指SEQ ID NO 1的序列(即GenBank No. AF077599)所 編碼的蛋白質(zhì)或這些蛋白質(zhì)具有抗炎作用的變異或修飾形式。例如，所述DRP蛋白可選自 (a) SEQ ID NO 2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有抑制炎性因子的活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等動(dòng)物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本 發(fā)明中DRP蛋白或多肽優(yōu)選由人DRP基因或其同源基因或家族基因編碼。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50 個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè) 以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的DRP蛋白 質(zhì)或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有抑制炎性因子的活性。可采用輻射或暴露于誘變劑下來(lái)產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其它已知 的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽。可利用編碼所述蛋白質(zhì)或多肽的編 碼序列來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并觀察該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)炎癥的抗性是否有所改良來(lái)篩選和鑒別 所得蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。該術(shù)語(yǔ)還包括DRP蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與DRP蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及 利用抗DRP蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含DRP蛋白或 其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了 DRP蛋白的可溶性片段。通 常，該片段具有DRP蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較 佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨 基酸。
DRP蛋白編碼基因如本文所用，術(shù)語(yǔ)“DRP基因”或“DRP蛋白編碼序列”可互換使用，均是指一種編 碼本發(fā)明所述的DRP蛋白或多肽的序列，其可為SEQ ID NO :1的序列、在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達(dá)對(duì)炎性 因子的產(chǎn)生和影響具有一定的抑制作用。本發(fā)明的DRP基因可選自(i)SEQ ID N0:1的序 列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有抑制炎性因子活性的分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和 洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu) 選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的DRP基因核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放 閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備 的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò) 增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。應(yīng)理解，本發(fā)明的DRP基因優(yōu)選獲自人，獲自其它動(dòng)物的與人DRP基因高度同源 (如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更 優(yōu)選85 %以上如85 %、90 %、95 %、甚至98 %序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮 的等同范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。載體、宿主及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明還涉及包含DRP基因的載體，以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞， 以及通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得高表達(dá)DRP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列 可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的DRP蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼DRP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“載體”與“重組表達(dá)載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、 噬菌體、酵母質(zhì)粒、動(dòng)物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi) 復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟 動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含DRP編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯 控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體 還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中優(yōu)選使用PCDNA3. 1載體、 PIRES2-EGFP 載體、Adeno-X 表達(dá)系統(tǒng)和 pSilencer 2. l-U6_neo 干擾載體。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或 是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌， 鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；動(dòng)物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用大腸桿菌細(xì)菌細(xì) 胞或小鼠巨噬細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用 于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”、或“轉(zhuǎn)化動(dòng)物”可互換使用，均指通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)基因的 方法獲得的轉(zhuǎn)入本發(fā)明DRP基因并穩(wěn)定高表達(dá)DRP蛋白或多肽的細(xì)胞、器官、組織或個(gè)體。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
I=I O藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明的DRP蛋白 或其編碼序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實(shí)施方案中，所述藥物組合物可用于治療與現(xiàn)有技術(shù)中已知可治療或預(yù) 防病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀，例如病毒感染后的復(fù)制；病毒感染后的復(fù)制；病毒感染 局部的細(xì)胞(皮膚的上皮細(xì)胞、外周血的免疫細(xì)胞、免疫器官中的免疫細(xì)胞以及實(shí)體器官 的組成細(xì)胞)和組織(包括皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺臟)損傷；病毒感染造成的器官(包括 皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺、脾臟)功能損傷。在本發(fā)明中，所述病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀可選自帶狀皰疹、皰疹性口咽、 小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS。病毒感染可由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB 病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒、流感病毒。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和 “由……構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副 反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和 /或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》 (Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上 可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些 載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、潤(rùn)濕劑或乳 化劑、矯味劑、PH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的組合物中DRP蛋白或其編碼序列有效成分占組合物總重量的0. 001 99. 9wt% ；優(yōu)選為組合物總重量的1 95wt%，較優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。 余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次 服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中DRP 蛋白或其編碼序列的含量為0.01 2000mg/劑，優(yōu)選0. 1 1500mg/劑，更優(yōu)選1 lOOOmg/劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，每天施用1 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用1 3劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為1齊U。應(yīng)理解，所用DRP蛋白或其編碼序列的有效劑量可隨待施用或治療的對(duì)象的嚴(yán)重 程度而變化。具體情況根據(jù)對(duì)象的個(gè)體情況(例如對(duì)象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的 效果)來(lái)決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或 液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用(1)直接裸DNA或者蛋白質(zhì)注射 法；(2)將DRP的cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚L-賴(lài)氨酸復(fù)合物連接，以增強(qiáng)其 生物效應(yīng)；(3)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與帶正電荷的脂類(lèi)形成復(fù)合物，以克服磷酸骨架負(fù)電荷 所致的穿越細(xì)胞膜的困難；(4)用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)DNA、mRNA和蛋白質(zhì)后介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，既有利 于大分子的順利進(jìn)入又免受細(xì)胞外各種酶的水解作用；(5) cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與膽固醇 結(jié)合使其胞漿保持時(shí)間增加10倍；(6)用免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)可使其特異 性轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織和靶細(xì)胞；(7)將cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)體外轉(zhuǎn)染給轉(zhuǎn)載細(xì)胞(如成纖維細(xì) 胞)也可較好地將DRP相關(guān)藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)；(8)電打孔(electroporation)，即借助于 電流將cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)導(dǎo)入靶細(xì)胞。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和治療病毒感染性疾病的其它活性物 質(zhì)，所述的其它活性物質(zhì)選自下組臨床常用抗病毒藥物(包括抗甲型流感病毒表面M2受 體、抗神經(jīng)氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉(zhuǎn)錄 酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶、抗解旋酶)的一種或多種。本發(fā)明的DRP相關(guān)的核苷酸和蛋白質(zhì)藥物相互間可以聯(lián)合應(yīng)用，還可以與其它藥 物和治療手段聯(lián)合，用于病毒感染性疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明揭示了 DRP及其編碼序列的新功能，即有效促進(jìn)I型IFN的產(chǎn)生，抑制病 毒復(fù)制和擴(kuò)增，并保護(hù)機(jī)體器官的正常功能；2.本發(fā)明提供了 一種可有效促進(jìn)I型IFN的產(chǎn)生，抑制病毒復(fù)制和擴(kuò)增，并保護(hù)機(jī)體器官的正常功能的新型抗病毒感染性疾病藥物。 實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1 :DRP對(duì)巨噬細(xì)胞系RAW264. 7的IFN- P和干擾素誘導(dǎo)件基因的產(chǎn)牛的促 講作用首先采用pcDNA3. 1 (購(gòu)自Invitrogen公司)作為真核表達(dá)載體，將帶有BamHI/ Kpnl酶切位點(diǎn)的DRP的cDNA產(chǎn)物插入該載體的相應(yīng)位置，在E. Coli菌株DH_5 a內(nèi)擴(kuò) 增該載體，測(cè)序鑒定后純化得到DRP的真核表達(dá)載體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染試劑JetPei購(gòu)自 Polyplus公司)小鼠RAW264.7細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)，然后將所得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(1X105 個(gè)細(xì)胞/ml RPMI 1640培養(yǎng)基)，以lOOng/ml LPS(又稱(chēng)脂多糖，為T(mén)LR4的配體，購(gòu)自 Sigma公司)處理不同時(shí)間后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，制備cDNA用于定量RT-PCR(94°C， 30Sec ；58°C,30Sec ；72°C,30Sec ；共30循環(huán))檢測(cè)IFN_0mRNA水平；或者用培養(yǎng)上清通 過(guò)ELISA(所用試劑盒購(gòu)自R&D公司)檢測(cè)IFN-0蛋白水平。為了穩(wěn)定干擾DRP的表達(dá)， 我們采用了 pSilenCer2. l-U6-neo干擾載體(購(gòu)自Ambion公司)，將包含有DRP干擾序列 的合成的21核苷酸雙鏈片段(帶有BamHI/HINDIII酶切位點(diǎn))插入該載體，然后測(cè)序證 明序列正確性，純化后應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DRP干擾載體(轉(zhuǎn)染試劑JetPei購(gòu)自 Polyplus公司)至小鼠RAW264. 7細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)，然后將所得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(1 X 105個(gè) 細(xì)胞/ml RPMI 1640培養(yǎng)基)用100ng/ml LPS, 1 u M CpG 0DN(由上海生工合成，然后去內(nèi) 毒素純化),10u g/ml poly (I C) (p (I C)(購(gòu)自Sigma)，分別處理細(xì)胞，制備cDNA用于定量 RT-PCR(94°C，30Sec ；58°C，30Sec ；72°C，30Sec ；共 30 循環(huán))檢測(cè) IFN-3、CXCL10、CCL5mRNA 水平；或者用培養(yǎng)上清通過(guò)ELISA(所用試劑盒購(gòu)自R&D公司)檢測(cè)IFN-0、CXCL10、CCL5 蛋白水平。IFN- 3 mRNA的定量RT-PCR分析和IFN- 3的ELISA分析的結(jié)果分別如圖la和圖 lb所示。結(jié)果顯示DRP真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264. 7細(xì)胞促進(jìn)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的 IFN-3的產(chǎn)生。穩(wěn)定干擾DRP對(duì)RAW264. 7細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的抑制效果如圖2所示。結(jié)果顯示我 們所構(gòu)建的DRP干擾載體能夠明顯抑制DRP的表達(dá)(圖2a)，干擾DRP的表達(dá)后可以抑制 LPS、Poly (I:C)、CpG 誘導(dǎo)的 RAW264. 7 細(xì)胞 IFN-3、CXCL10、CCL5 的 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá) (圖 2b，c)。該結(jié)果表明DRP可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞系IFN-0的產(chǎn)生。實(shí)施例2 過(guò)表達(dá)DRP對(duì)VSV病毒在RAW264. 7細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與擴(kuò)增的抑制作用
將0. 1M0I的活VSV(武漢大學(xué)生命科學(xué)院舒紅兵教授惠贈(zèng))以及紫外線滅活的 VSV(VSV-UV)加入RAW264. 7細(xì)胞中，培養(yǎng)12小時(shí)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。其中，將細(xì)胞應(yīng)用 于VSV L基因的mRNA水平檢測(cè)，上清應(yīng)用于噬斑形成實(shí)驗(yàn)(PFU，參照文獻(xiàn)Xu，L. G.等.Mol. Cell. 19 :727-740(2005))。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DRP可以顯著抑制VSV病毒在 RAW264. 7細(xì)胞系內(nèi)的復(fù)制以及VSV病毒釋放到上清中。該結(jié)果表明過(guò)表達(dá)DRP可以抑制巨噬細(xì)胞系中VSV病毒的復(fù)制和擴(kuò)增。t施徹丨3 :DRP腺病毒靜脈灃射對(duì)VSV病毒在肝_的擴(kuò)1曾的抑制作用首先采用Adeno-X病毒載體系統(tǒng)(購(gòu)自Clontech公司)中的pShuttle2作為克 隆載體，在Sail和Xhol酶切位點(diǎn)間插入DRP的cDNA，在HEK293細(xì)胞中將穿梭質(zhì)粒與病毒 DNA進(jìn)行重組，并且擴(kuò)增后，用腺病毒純化試劑盒(購(gòu)自Clontech公司)。1 X 107PFU Ad-DRP 尾靜脈注射入小鼠(6周雄性SDF級(jí)C57BL6小鼠，購(gòu)自Sipper BK公司)，48h后腹腔內(nèi)注 射VSV病毒(5X106PFU/小鼠)。12或24h后收集小鼠肝臟，將裂解液應(yīng)用于噬斑形成實(shí) 驗(yàn)(PFU，參照文獻(xiàn) Ciavarra, R. P.等.Virology. 342 177-189 (2005)進(jìn)行)。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示Ad_DRP腺病毒在小鼠體內(nèi)的過(guò)表達(dá)可以顯著抑 制VSV病毒在小鼠肝臟的復(fù)制和擴(kuò)增。該結(jié)果表明DRP腺病毒靜脈注射可以抑制VSV病毒在肝臟的擴(kuò)增。實(shí)施例4 :DRP轉(zhuǎn)某因?qū)π∈髞?lái)源目復(fù)脖巨噬細(xì)胞』IFN- P的產(chǎn)牛的促講作用采用pIRES2-EGFP載體(來(lái)自于北京生物技術(shù)研究所所贈(zèng))作為表達(dá)載體，使用 Ub啟動(dòng)子，將DRP的編碼cDNA插入Bglll/Sall位點(diǎn)，通過(guò)顯微注射的方法將線性化后的 載體注射入小鼠卵子，移植入雌性C57BL6小鼠(所用小鼠同實(shí)施例2)子宮，然后檢測(cè)新生 鼠是否表達(dá)DRP (檢測(cè)鼠尾DNA中DRP的表達(dá))，建立轉(zhuǎn)基因小鼠。給DRP轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔 注射lml肉湯(購(gòu)自Sigma)，三天后以PBS沖洗腹腔獲得巨噬細(xì)胞。然后分別用lOOng/ml LPS, 1 u M CpG 0DN(由上海生工合成，然后去內(nèi)毒素純化)，10ii g/ml poly (I C) (p (I C) (購(gòu)自 Sigma)，1 u g/ml 肽聚糖 PGN(p印tidoglycan，購(gòu)自 Sigma), 20 u g/ml R837 (購(gòu)自 Invivogeng公司)處理腹腔巨噬細(xì)胞(1X105個(gè)細(xì)胞/ml RPMI 1640培養(yǎng)基)。2h后收集 細(xì)胞做定量RT_PCR(方法同實(shí)施例1)分析，4h后收集培養(yǎng)上清用于ELISA(所用試劑盒購(gòu) 自R&D公司)分析。DRP轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示我們所得小鼠鼠尾基因組DNA 中包含DRP序列，而且轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)DRP的mRNA和蛋白質(zhì)。DRP轉(zhuǎn)基 因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在受到TLR配體刺激后表達(dá)的IFN-0的mRNA和蛋白均明顯升高。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞IFN-0的產(chǎn)生。實(shí)施例5 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)π∈髞?lái)源腹腔巨噬細(xì)胞IFN-g和IRF3報(bào)告基因的活化的 促講作用用lml肉湯給DRP轉(zhuǎn)基因小鼠(所用小鼠同實(shí)施例4)腹腔注射，三天后以PBS沖 洗腹腔獲得巨噬細(xì)胞(方法同實(shí)施例4)。轉(zhuǎn)染IFN-0和IRF3報(bào)告基因(參考文獻(xiàn)An， H.等 Nat. Immunol. 9 :542_550 (2008)進(jìn)行)，然后用 100ng/ml LPS, 1 u MCpG 0DN, 10 u g/ ml poly(I:C) (p(I:C))處理腹腔巨噬細(xì)胞(1X105個(gè)細(xì)胞/mlRPMI 1640培養(yǎng)基，所采用 處理的試劑和方法同實(shí)施例1)，最后檢測(cè)熒光素酶(參考文獻(xiàn)An，H.等.Nat. Immunol. 9 542-550(2008)進(jìn)行)的含量。DRP轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IFN-3和IRF3報(bào)告基因的活化結(jié)果如圖6所示。結(jié) 果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在受到TLR配體(LPS和Poly (I:C))刺激后IFN-旦 和IRF3報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性均明顯升高。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞IFN-3和IRF3報(bào)告 基因的活化。t施例6 :DRP轉(zhuǎn)某因?qū)SV病毒在目復(fù)脖巨卩策細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)J曾的抑吿lK乍用用1ml肉湯給DRP轉(zhuǎn)基因小鼠(所用小鼠同實(shí)施例4)腹腔注射，三天后以 PBS沖洗腹腔獲得巨噬細(xì)胞(方法同實(shí)施例4)。將0. 1M0I的活VSV以及紫外線滅活的 VSV(VSV-UV)加入原代細(xì)胞，然后培養(yǎng)12小時(shí)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，其中細(xì)胞應(yīng)用于VSV L基因的mRNA水平檢測(cè)，上清應(yīng)用于噬斑形成實(shí)驗(yàn)(PFU)(方法同實(shí)施例2)。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示VSV病毒在DRP轉(zhuǎn)基因(Nrdpl)小鼠的腹腔巨 噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增相較于野生型(WT)小鼠組明顯受到抑制。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制VSV病毒在腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增。實(shí)施例7 :DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV感染后血清中IFN_ P的產(chǎn)牛的促講作用。向DRP轉(zhuǎn)基因小鼠(所用小鼠同實(shí)施例4)腹腔內(nèi)注射VSV病毒(5X 106PFU/小 鼠)。12、24或48h后收集小鼠血清，ELISA法檢測(cè)IFN-0 (方法同實(shí)施例1)的含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠血清中IFN-0的水平在VSV感 染后較野生型(WT)小鼠組顯著升高。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)VSV感染后血清中IFN-0的產(chǎn)生。實(shí)施例8 =DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV感染后所導(dǎo)致的肝臟損傷的抑制作用DRP轉(zhuǎn)基因小鼠(所用小鼠同實(shí)施例4)腹腔內(nèi)注射VSV病毒(5xl06PFU/小鼠)。 12、24或48h后收集小鼠血清，采用生化自動(dòng)分析儀(購(gòu)自SRL公司)檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨 酶(AST)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平。試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠血清中AST和ALT的水平在VSV 感染后較野生型(WT)小鼠組顯著降低。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制VSV感染后所導(dǎo)致的肝臟損傷。實(shí)施例9 =DRP轉(zhuǎn)基因?qū)SV感染后在肝臟的復(fù)制和擴(kuò)增的抑制作用DRP轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)注射VSV病毒(5X 106PFU/小鼠，方法同實(shí)施例7)。12、24 或48h后收集小鼠肝臟，將裂解液應(yīng)用于噬斑形成實(shí)驗(yàn)(PFU，方法同實(shí)施例3)。試驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。結(jié)果顯示DRP轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的VSV滴度在VSV感染后 較野生型(WT)小鼠組顯著降低。。該結(jié)果表明DRP轉(zhuǎn)基因可以抑制VSV感染后在肝臟的復(fù)制和擴(kuò)增。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110>中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
140157]<120> 一種新型抗病毒分子DRP的抗病毒作用、實(shí)施方法及用途0158]<130)0927400159]<160>20160]<170>PatentIn version 3.30161]<210>10162]<211>31290163]<212>DNA0164]<213> 智人(Homo sapiens)0165]<220>0166]<221>CDS0167]<222>(214).(1167)0168]<220>0169]<221>misc_feature0170]<222>(2703) (2703)0171]<223>n ==a,c，g，t或u0172]<400>10173]gggcgagtactcctgattgt gacatcacat tcatcccctgggcgatggagottgtcactg600174]ggaaggaata"teagtegga gaatagccaacaagatgggttactgggaga atctcttcag1200175]tggcactgag；ggaggcatc agggggttgg agccttgtga acagggaacc tgccccccaa1800176]cacttggaag^acctgggtt tcagtgatgagacatggggtatgatgtaacccgt2340177]Met Gly Tyr Asp Val Thr Arg0178]150179]ttccagggggatgttgacgaagatcttatetgccctatttgcagtgga2820180]PheGinGlyAspValAspGluAspLeulieCysProlieCysSerGly0181]1015200182]gtcttggaggagccagtacaggcacctcattgtgaacatgetttctgc3300183]ValLeuGluGluProValGinAlaProHisCysGluHisAlaPheCys0184]2530350185]aacgcctgcateacccagtggttctctcagcaacagacatgtccagtg3780186]AsnAlaCyslieThrGinTrpPheSerGinGinGinThrCysProVal0187]404550550188]gaccgtagtgttgtgacggtcgcccatctgcgcccagtaccteggate4260189]AspArgSerValValThrValAlaHisLeuArgProValProArglie0190]6065700191]atgeggaacatgttgteaaagctgcagattgcctgtgacaacgetgtg4740192]MetArgAsnMetLeuSerLysLeuGinlieAlaCysAspAsnAlaVal0193]7580850194]ttcggctgtagtgccgttgtceggcttgacaacctcatgtctcacctc5220195]PheGlyCysSerAlaValValArgLeuAspAsnLeuMetSerHisLeu
300305310cat ggc gtg gaa gag ata taa gagaactcga ctggctatca ggaagagatg1197His Gly Val Glu Glu lie315gaaatcagaaaatcccatcactccagcagctgggacctgagtcctacccaccattcttaa1257
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aa3129<210>2<211>317
Met Ala Cys Glu Asn Gin His Met Gly Asp290295Gly Leu Val Met lie Phe Ala His Gly Val305310
Asp Met Val Gin Glu Pro
300 Glu Glu lie 31權(quán)利要求
死亡抵抗蛋白及其編碼序列在制備用于預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下 組的一種或多種因病毒感染引起的疾病和/或征狀病毒感染后的復(fù)制；病毒感染局部的 細(xì)胞和組織損傷；或病毒感染造成的器官功能損傷。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種 病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷 病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述死亡抵抗蛋白選自(a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；(b)與SEQID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性 的蛋白；(c)(a)或(b)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有預(yù)防 或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述死亡抵抗蛋白的編碼基因選自(i)SEQID NO 1 的序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或 征狀的分子。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射 法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、 復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)。
7.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及 其編碼序列占藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%。
9.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；(B)預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)；以及(C)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.一種預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的方法，所述方法包括給予需要預(yù) 防或治療的對(duì)象有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型抗病毒分子DRP(死亡抵抗蛋白，Death Resistant Protein)的抗病毒作用、實(shí)施方法及用途。本發(fā)明提供這種分子在抗病毒感染過(guò)程中的應(yīng)用方法及相應(yīng)的免疫學(xué)原理。本發(fā)明公開(kāi)了這種分子在抗病毒感染中的用途和策略，特別是應(yīng)用于病毒感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明證實(shí)了這種分子可以促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生，并且對(duì)病毒感染機(jī)體后在機(jī)體內(nèi)部的復(fù)制有抑制作用，保護(hù)肝臟等臟器內(nèi)病毒復(fù)制導(dǎo)致的器官損傷。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101897950SQ20091005224
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者曹雪濤, 汪晨, 陳濤涌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)