專利名稱：一種抗RNA病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于RNA干擾技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗RNA病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
RNA類病毒種類很多，分布廣泛，水生和陸生動物以及人類均有感染。如對水生養(yǎng)殖蝦類造成嚴(yán)重威脅的桃拉病毒(TSV)、羅氏沼蝦諾達(dá)病毒(MrNV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)和對陸生動物包括人類危害巨大的流感病毒(Flu virus)、人甲型肝炎病毒(HAV)、艾滋病毒(HIV)，以及各種冠狀病毒如嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等。由于RNA病毒在RNA的復(fù)制過程中，其錯誤修復(fù)機(jī)制的酶的活性很低，幾乎是沒有的，所以其變異很快；而疫苗是要根據(jù)病毒的固定基因或蛋白進(jìn)行開發(fā)制作的，所以RNA病毒疫苗較難開發(fā)！RNA干擾技術(shù)，作為一種以短雙鏈RNA(SiRNA)代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，自2002年被《Science》評為年度10大突破以來，已經(jīng)被迅速而廣泛地應(yīng)用到了基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等熱門領(lǐng)域，并為疾病基因治療、抗病毒感染開辟了新的途徑。相對于傳統(tǒng)基因治療對基因水平上的敲除，整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡便，作用更迅速，效果更明顯，成為研究人員公認(rèn)的高效特異、經(jīng)濟(jì)便捷的研究工具，在細(xì)胞水平和動植物體內(nèi)均表現(xiàn)出高效特異的抗病毒能力。由于RNA干擾技術(shù)是轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，直接靶標(biāo)是病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，那么對于RNA病毒尤其是正鏈RNA病毒而言，RNA干擾技術(shù)就可直接降解病毒基因，因此RNAi技術(shù)對于RNA類病毒的防治而言無疑是一個(gè)上佳之選。許多研究結(jié)果也證實(shí)，RNA干擾技術(shù)抗病毒領(lǐng)域取得了預(yù)期的成果。但是，由于抗病毒用siRNA僅僅是21個(gè)堿基對的短小序列，根據(jù)常規(guī)的小RNA設(shè)計(jì)原則，多數(shù)病毒基因組將產(chǎn)生成百上千個(gè)候選siRNA。尤其是像冠狀病毒科成員那樣的基因組巨大的RNA病毒，根據(jù)常規(guī)設(shè)計(jì)原則將需要花費(fèi)大量的人力、物力，用來篩選在實(shí)際應(yīng)用中能高效抗病毒的siRNA(由于目標(biāo)RNA的空間結(jié)構(gòu)等原因，導(dǎo)致許多理論上符合“有效”原則的siRNA在實(shí)際應(yīng)用中無效或低效)。因此，如何有效縮小高效siRNA的篩選范圍一直是RNA干擾技術(shù)研究人員探究的熱點(diǎn)問題，也是關(guān)系到能否有效降低RNA干擾技術(shù)的研究與應(yīng)用成本，使其最終能在生產(chǎn)實(shí)踐中得到推廣、應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗RNA病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法，該方法設(shè)計(jì)的siRNA分子，將在保證獲得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅縮小RNA分子篩選范圍，顯著降低抗病毒研究和應(yīng)用成本，有利于RNA干擾技術(shù)在抗RNA病毒領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用。本發(fā)明中一種抗RNA類病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法，包括(I)在RNA病毒的基因組中選擇序列保守的病毒酶的編碼基因作為siRNA的靶標(biāo)；
(2)利用siRNA設(shè)計(jì)軟件生成抗RNA類病毒的小RNA分子；(3)根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則，篩選理論上高效的siRNA用于實(shí)驗(yàn)研究。所述步驟(I)中的序列保守的RNA病毒酶為RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)。所述步驟(3)中的小RNA分子的抗病毒應(yīng)用形式為，把小RNA分子構(gòu)建成含RNA聚合酶III啟動子U6的表達(dá)質(zhì)粒。表I是shRNA在TGEV不同結(jié)構(gòu)基因和RdRP基因上的靶向序列。其中，shPl和 shP2靶向TGEV RdRP基因，而shSl、shS2、shM、shNl和shN2分別靶向TGEV的不同結(jié)構(gòu)基因；shT靶向與TGEV基因沒有同源性的一段任意序列，用作顯示shRNA干擾特異性的對照。表I
shRNA靶向序列
shPl5--GTACTGGGATCGCACATAT-3 ’
shP2 5'-GGCAAGAGCTCGTACAGTA-3， shS I 5'-CCAGTGGAATCTC ATTGAA-3 ’shS25'-CTAGTTCTGACTTTGTTCA-3J
shM 5'-GAAGTTGAAAGCAAGTAGT-3， shNl 5'-CAAGAAGGATGACAGTGTA-3 ’ shN2 5'-GGATGACAGTGTAGAACAA-3， shT5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3，我們通過對RNA病毒一TGEV進(jìn)行細(xì)胞水平的RNA干擾研究發(fā)現(xiàn)，在分別靶向病毒RdRP基因和結(jié)構(gòu)蛋白基因的siRNA中，兩個(gè)靶向RdRP的小RNA表現(xiàn)出遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他siRNA的抗病毒效果。隨后在小型豬體內(nèi)水平進(jìn)行的抗病毒應(yīng)用研究，進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)siRNA分子抗病毒的高效性和特異性。有益效果本發(fā)明把siRNA的作用靶標(biāo)鎖定在RNA依賴的RNA聚合酶，有兩個(gè)意義(I)RdRP保守程度高，對于容易變異的RNA病毒而言很重要，因?yàn)楦鶕?jù)Genbank中的序列設(shè)計(jì)的siRNA，有可能靶向的病毒本身在該處出現(xiàn)了序列變異，而研究表明，即使I個(gè)堿基的變化都會導(dǎo)致siRNA的抗病毒效果大幅降低。(2)部分RNA病毒如冠狀病毒基因組巨大。以TGEV為例，得到的理論上“有效”的siRNA將大于1000個(gè)。如果把這些siRNA全部在細(xì)胞水平進(jìn)行篩選研究，無疑將耗費(fèi)大量的人力、物力。而根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的siRNA分子，將在保證獲得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅縮小RNA分子篩選范圍，顯著降低抗病毒研究和應(yīng)用成本，有利于RNA干擾技術(shù)在抗RNA病毒領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用。


圖I是CPE分析不同shRNA表達(dá)載體對TGEV的抑制作用。其中，m表示孔中部細(xì)胞，s表示孔邊緣細(xì)胞；normal是陰性對照(未處理的正常細(xì)胞)；mock是陽性對照(只感染TGEV);圖2是MTS法分析不同shRNA表達(dá)載體對ST細(xì)胞的保護(hù)作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。 實(shí)施例I 小RNA分子的設(shè)計(jì)與合成(I)分別選取TGEV結(jié)構(gòu)蛋白和RdRP的編碼基因；(2)利用軟件生成抗TGEV的siRNA分子。(3)按照已公布的小RNA序列設(shè)計(jì)規(guī)則，選擇理論上高效的siRNA分子，并構(gòu)建成發(fā)卡型小RNA(shRNA)分子(表I)。(4) shRNA分子插入載體構(gòu)建成含U6啟動子的質(zhì)粒表達(dá)載體。實(shí)施例2shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞(I) ST細(xì)胞(2-3 X IO4個(gè)/孔)接入48孔板于完全DMEM中培養(yǎng)；(2)向轉(zhuǎn)染試劑 TransFast transfection reagent 中加入 400 μ I 無 DNase 水，漩渦震蕩溶解，_20°C保存；(3)溶解質(zhì)粒DNA1. 2 μ g溶于300 μ I無血清無雙抗培養(yǎng)基中；(4)室溫溶化轉(zhuǎn)染試劑并渦旋，取3. 6 μ I加入DNA/DMEM混合物中，渦旋混勻；室溫孵育10-15分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；(5)移去ST細(xì)胞中的培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物100 μ I/孔，繼續(xù)于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育I小時(shí)；向ST細(xì)胞中加入400 μ I無雙抗完全培養(yǎng)基(含5% NBS);在37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)施例3TGEV感染ST細(xì)胞shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞28h后移去細(xì)胞培養(yǎng)基，按200CCID5(I的量接種TGEV。40h后，分析細(xì)胞病變、細(xì)胞毒性(MTS)或抽提病毒RNA做定量RT-PCR檢測。。實(shí)施例4細(xì)胞病變(CPE)分析因?yàn)門GEV復(fù)制增殖而導(dǎo)致的細(xì)胞病變非常典型，在普通顯微鏡下即可清楚顯示是否出現(xiàn)了細(xì)胞病變以及病變的程度。所以，在對細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體并感染TGEV后，我們即可通過對細(xì)胞病變的觀察，比較不同shRNA表達(dá)載體抑制病毒復(fù)制、抵抗細(xì)胞病變的能力。從圖I中，我們可以看出，在接毒40h后，靶向RdRP基因的shP2和shPl表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染孔未出現(xiàn)細(xì)胞病變或只在培養(yǎng)孔邊緣呈現(xiàn)微弱的疑似“病變”(說明=TGEV病變一般從孔邊緣開始向孔中部漫延)，而其他靶向TGEV結(jié)構(gòu)基因的shRNA干擾孔均出現(xiàn)了 TGEV特征性病變，只是病變程度不同。其中，shSl和shNl表達(dá)質(zhì)粒的抗病變能力稍強(qiáng)，只在孔的邊緣出現(xiàn)不同程度的病變，而shS2、shM和shN2干擾孔的病變程度較重，幾乎整孔細(xì)胞出現(xiàn)病變。而且，shS2和shN2干擾孔的病變與非特異干擾孔shT的情況接近。CPE分析結(jié)果表明，大多設(shè)計(jì)的shRNA均顯示了對TGEV在ST細(xì)胞中增殖的抑制作用，但是，靶向RdRP基因的shRNA對TGEV的抑制效果明顯好于靶向結(jié)構(gòu)基因的shRNA。實(shí)施例5
細(xì)胞毒性(MTS)試驗(yàn)ST細(xì)胞(1-1.5X104個(gè)/孔)按48孔板同樣的方法在96孔板進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒感染試驗(yàn)，每孔質(zhì)粒和病毒量分別為48孔板的一半。接毒36h后，按MTS試劑說明，向100μ I/孔培養(yǎng)基中加入20μ I/孔MTS后繼續(xù)在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。最后在492nm處測定各孔液體吸光值。通過MTS試驗(yàn)準(zhǔn)確測量TGEV感染后各干擾孔的活細(xì)胞數(shù)量，可以準(zhǔn)確顯示各shRNA表達(dá)載體對ST細(xì)胞的保護(hù)程度，反映各自抗TGEV感染的能力。圖2縱坐標(biāo)表示不同shRNA干擾孔的吸光值。我們可以清楚地看出，靶向病毒RdRP基因的兩個(gè)shRNA干擾孔的吸光值僅次于陰性對照(正常細(xì)胞)孔，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他shRNA干擾孔的值。也就是說，靶向病毒RdRP基因的兩個(gè)shRNA干擾孔中活細(xì)胞最多。顯而易見，各shRNA表達(dá)載體干擾孔中活細(xì)胞的數(shù)量關(guān)系與CPE分析的結(jié)果基本一致。CPE和MTS的分析結(jié)果均證明，靶向病毒RdRP基因的shRNA的抗病毒效果顯著好于靶向病毒結(jié)構(gòu)基因。
權(quán)利要求
1.一種抗RNA病毒SiRNA分子的設(shè)計(jì)方法，包括 (1)在RNA病毒的基因組中選擇序列保守的病毒酶的編碼基因作為siRNA的靶標(biāo)； (2)利用siRNA設(shè)計(jì)軟件生成抗RNA病毒的小RNA分子； (3)根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則，篩選理論上高效的siRNA用于實(shí)驗(yàn)研究。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗RNA病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法，其特征在于所述步驟(I)中的序列保守的RNA病毒酶為RNA依賴的RNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗RNA病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法，其特征在于所述步驟(3)中的小RNA分子的抗病毒應(yīng)用形式為把小RNA分子構(gòu)建成含RNA聚合酶III啟動子U6的表達(dá)質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗RNA類病毒siRNA分子的設(shè)計(jì)方法，包括(1)選擇RNA病毒內(nèi)部、序列保守的RNA依賴的RNA聚合酶作為siRNA的靶標(biāo)；(2)利用siRNA設(shè)計(jì)軟件生成抗RNA病毒的小RNA分子；(3)根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則，篩選理論上高效的siRNA用于實(shí)驗(yàn)研究；(4)小RNA分子的抗病毒應(yīng)用形式為含RNA聚合酶III啟動子U6的表達(dá)質(zhì)粒。運(yùn)用本方法選擇抗病毒靶標(biāo)序列可顯著提高獲得高效抗病毒小RNA分子的幾率，大幅縮小RNA干擾靶點(diǎn)的選擇范圍，提高工作效率，顯著降低RNA干擾技術(shù)研究和應(yīng)用成本。
文檔編號C12N15/113GK102643815SQ20121006323
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者華修國, 周俊芳, 崔立, 房文紅 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所