專利名稱：一種干擾HBV基因的siRNA分子及其抗病毒應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種干擾HBV基因的SiRNA分子及其抗病毒應用。
背景技術：
肝炎，即肝臟炎癥，有多種致病因素-如病毒、細菌、寄生蟲、化學毒物、藥物和毒 物、酒精等，侵害肝臟，使得肝臟的細胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，它可以引起身體的 一系列不適癥狀，以及肝功能指標的異常。肝炎多數(shù)情況下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、 戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染導致的乙型肝炎，是一種嚴重威脅 全球人類健康的的傳染性疾病，也是最嚴重類型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死 于肝硬化和肝癌的風險極高。HBV屬嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，全基因組長約3. 2kb，為部分雙鏈環(huán)狀 DNA。其基因組共有四個開放閱讀框(Open Reading Frame，0RF)，編碼蛋白包括表面抗原 (S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界估計有20億人感染HBV，其中有3. 5億以上的人為慢 性乙肝感染者，估計每年有60萬人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，癥狀可 持續(xù)數(shù)周，包括皮膚和眼睛發(fā)黃(黃疸)，尿色深，極度疲勞，惡心，嘔吐和腹痛?；颊呖赡苄?要數(shù)月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也會造成慢性肝臟感染，以后可能發(fā)展成肝硬化 或肝癌。乙型肝炎病毒通過與受感染者的血液或其他體液(比如，精液和陰道分泌物)接 觸而在人與人之間傳播，傳播途徑與人類免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒 的傳染性比艾滋病毒強50-100倍，乙型肝炎病毒在體外可存活至少7天以上。在此期間， 如果病毒進入未感染者的身體，它依然可造成感染。病毒潛伏期平均達90天，但也可能為 大約30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可發(fā)現(xiàn)，持續(xù)時間差別很大。目前主要是通過嬰兒接種乙型肝炎疫苗來預防乙型肝炎的發(fā)生，但盡管如此，人 群HBV流行率仍然很高。目前主要治療慢性乙型肝炎的方法僅局限于抑制患者體內病毒基 因的表達和復制。如口服核苷類抗病毒藥-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的復制，但是停 藥后復發(fā)率高，長期應用則可導致病毒變異，在用藥6個月后發(fā)生由病毒聚合酶基因發(fā)生 變異引起的耐藥性，使得臨床抗病毒治療面臨極大的挑戰(zhàn)。近幾年來，隨著RNA干擾(RNAi)技術的迅猛發(fā)展，為疾病尤其是癌癥開辟了 全新的治療途徑，為科研工作者提供了一個全新的基因治療方法。該技術通過用小 干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾特定靶基因的表達，來達到治療疾病 的目的，是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的轉錄后基因沉默機制。其作用機制是核糖核 酸酶III家族的Dicer酶，與dsRNA結合，將其剪切成21_23nt及3’端突出的siRNA，隨后 siRNA與RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合到靶信使RNA(mRNA)上并將其切 斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應基因表達。RNAi已作為一種簡單有效的基因 敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。本發(fā)明提供了一種用RNAi技術來抗HBV的方法。應用RNA干擾技術，用靶向至 HBV基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉錄后進行干擾，從而有效抑制HBV的蛋白表達 和病毒復制，具有特異性強、高效、副作用小、可持續(xù)用藥的優(yōu)勢，且能彌補目前治療乙型肝 炎藥物的不足，在不久的將來可能成為一種新的治療乙型肝炎的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過siRNA全位點分子庫技術篩選出的高效靶向HBV 基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成正義鏈5，-GAUUGACGAUAAGGGAGANN-3，(SEQID NO 3)反義鏈5，-UCUCCCUUAUC⑶CAAUCNN-3，(SEQID NO 4)其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。換言之，該雙鏈siRNA分子的主干序列為正義鏈5，-GAUUGACGAUAAGGGAGA-3，(SEQID NO 5)反義鏈5，-UCUCCCUUAUC⑶CAAUC-3，(SEQID NO 6)在一個優(yōu)選的實施方式中，上述序列中3，端的“NN”是兩個脫氧胸腺嘧啶dTdT。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗HBV藥物中的應用。體外實驗證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的 mRNA結合，降解mRNA，從而干擾轉錄后翻譯過程，抑制HBV蛋白質翻譯和病毒復制，達到抗 HBV的治療目的。


圖1是抽提的HBV基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。M為Ikb plus DNA Ladder (標 準參照)。圖2A HBV聚合酶片段1瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為 1625bp。圖2B是HBV聚合酶片段2瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為 874bp。M 為 Ikb plus DNA Ladder (標準參照)。圖3是siRNA分子庫構建流程示意圖。圖4是TO-siRNA轉錄模板-Hl表達框結構示意圖。圖5是PCR制備的TO-siRNA轉錄模板-Hl表達框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。 圖中，M 為 Ikb plus DNA Ladder (標準參照)；1 為 HBV-22 ；2 為 HBV-676 ；3 為 HBV-877 ；4 為 HBV-638 ；5 為 HBV-1003 ；6 為 HBV-748 ；7 為 HBV-182 ；8 為 HBV-261 ；9 為陰性對照。圖6是表達框轉染細胞后實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA表達量柱形圖， 縱坐標表示HBV聚合酶基因mRNA表達水平；橫坐標表示處理實驗組，"Negative Control” 為陰性對照組。圖7是化學合成的siRNA轉染細胞后實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA 表達量柱形圖，縱坐標表示HBV聚合酶基因mRNA表達水平；橫坐標表示處理實驗組，“NegativeContro 1 ”為陰性對照組。
具體實施例方式本發(fā)明中諸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等術語可以互換，其表示的 意思和范圍相同。其中，siRNA序列可以是單鏈結構，也可以是雙鏈結構。本發(fā)明的siRNA分子來源于針對HBV聚合酶基因的功能保守區(qū)而制備的siRNA分 子庫，本發(fā)明所用siRNA全位點分子庫技術是百奧邁科生物技術有限公司的專利技術(中 國發(fā)明專利號為ZL 200710024217. 6，專利名稱PCR高通量構建siRNA全位點分子庫制備 方法)，其優(yōu)點在于所制備得到的siRNA隨機分布于HBV聚合酶基因區(qū)段，長度可控性分布 于18-25bp，可以提高有效靶位點的命中率。siRNA的制備可采用多種方法，比如化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈dsRNA、載 體表達siRNA、PCR合成siRNA表達元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間， 可以更好地獲得基因沉默效率。本發(fā)明的siRNA分子可以作為抗HBV藥物的有效成分。作為該siRNA分子的另一種表達形式，可將其制備成DNA表達框形式，比如:U6啟 動子-siRNA轉錄模板-Hl啟動子。簡言之，在下文中將“TO啟動子-siRNA轉錄模板-Hl啟動子”簡寫為“U6_siRNA 轉錄模板-Hl ”或“U6-siRNA-Hl ”，它們表示的意思和范圍相同。出于應用目的，可將siRNA分子、表達siRNA分子的DNA表達框、或者包含siRNA 分子表達框的質粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如病灶組織。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應疾病的給藥、并且恰當?shù)?保持siRNA分子的活性。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學可接受的輔助劑，只要其適合于相應 的給藥體系、并且恰當?shù)乇３謘iRNA分子的活性。為了實現(xiàn)本發(fā)明的設計思想并驗證篩選得到的siRNA的抗HBV效果，設計了如下
實驗方案(1)構建HBV聚合酶基因的siRNA分子庫，該分子庫中包含靶向至HBV聚合酶基因 的siRNA效應分子，長度分布于18-25bp。(2)制備具有相應效應的siRNA表達框，其結構為U6啟動子-siRNA轉錄模板-Hl 啟動子，使其更易于體外篩選。(3)運用實時定量PCR技術，檢測上述siRNA表達框在細胞中轉錄出的效應siRNA 分子對HBV聚合酶基因的抑制作用。(4)化學合成上述方法篩選得到的最優(yōu)靶點siRNA，在體外細胞實驗中進一步運 用實時定量PCR技術檢測HBV聚合酶基因的mRNA表達水平。下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進行限制。實施例1siRNA全位點分子庫的制備1.主要儀器、試劑和材料
1. 1儀器PCR儀(ABI公司)；電轉儀(Bio-Rad公司)；離心機(Eppendorf公司)， 長波長紫外燈等。1. 2材料和試劑!fepG22· 2. 15細胞(百奧邁科公司保存)；Ikb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；DNase I (Roche 公司)；MnCl2 (BBI 公司)；磷酸接頭 (Sigma-aldrich 公司)；ATP (BBI 公司)；BSA (NEB 公司)；BmsbI (NEB 公司)；T4DNA 連 接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生 工)；酚氯仿抽提試劑(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB公司)；EcoP15I (NEB公 司)；T4DNA聚合酶(NEB公司)；FokI酶(NEB公司)；SfiI酶(NEB公司)；感受態(tài)細胞 (invitrogen公司)；pU6Hl_GFP表達載體(NT Oimcs公司)。凝膠抽提試劑盒QIAEX II Gel ExtrationKit (QIAGEN公司)；質粒抽提試劑盒(百奧邁科公司)。其他生化試劑均購 jJ1 Sigma-aldrich ^w]。2. siRNA全位點分子庫的構建2. IHBV聚合酶基因的獲得從細胞H印G22. 2. 15的基因組DNA(如圖1所示) 中PCR擴增HBV聚合酶片段。！fepG22. 2. 15細胞含2個拷貝的HBV基因組，能穩(wěn)定分 泌HBsAg、HBeAg, HBcAg及Dane顆粒，并可檢測到細胞內HBV的DNA和RNA等中間復制 體(Sells etal. Proc Natl Acad Sci，1987 ;84 :1005_1009)，其含有 HBV 的血清亞型為 ayw(GenBankAccession number :U95551)，根據(jù) GenBank 報道的核酸序列設計 PCR 擴增引 物，分成兩個片段為HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，長度分別為1625bp (如圖2A 所示)和874bp (如圖2B所示)。引物序列如下


HBV聚合酶片段1上游引物5 HBV聚合酶片段1下游引物5 HBV聚合酶片段2上游引物5 HBV聚合酶片段2下游引物5 1)HBV聚合酶片段1序列
aattccacaa cctttcacca gctggtggct tcaatcttct
-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3‘ -TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3’ -ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3‘ -CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3‘t
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84
aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct ccagttcagg agcagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccttatcg cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt
6
3. 4結果分析用實時定量PCR 2_Δ ^t法分析實驗結果，并作出柱狀圖，如圖6所 示，結果顯示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-877的沉默效果達到70%。
權利要求
一種干擾HBV基因的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列結構正義鏈5’ GAUUGACGAUAAGGGAGANN 3’SEQ ID NO3，反義鏈5’ UCUCCCUUAUCGUCAAUCNN 3’SEQ ID NO4，其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。
2.如權利要求1所述的干擾HBV基因的siRNA分子，其特征在于，所述N為T。
3.權利要求1 2中任一項所述的siRNA分子在制備抗病毒藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的病毒為乙型肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干擾HBV基因的siRNA分子及其抗病毒應用。該siRNA分子正義鏈為SEQ ID NO3，反義鏈為SEQ ID NO4，其中，反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的mRNA結合，降解mRNA，從而干擾轉錄后翻譯過程，達到抗乙型肝炎病毒的目的。
文檔編號C12N15/113GK101979553SQ201010521948
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權日2010年10月28日
發(fā)明者M·格拉漢姆, 付博峻, 唐小軍, 孫云成, 朱遠源, 李鐵軍, 王晉康, 陸毅祥 申請人:百奧邁科生物技術有限公司