專利名稱：：Melan-a肽類似物-病毒樣顆粒偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供用于增強針對MelanA肽類似物的免疫應(yīng)答的組合物和方法，該MelanA肽類似物通迚結(jié)合，優(yōu)選通過將免疫刺激物，特別是免疫刺激性核酸，更具體而言是含有至少一種非曱基化CpG序列的寡核苷酸，包裝到病毒樣顆粗(VLP)內(nèi)，而與病毒樣顆粒(VLP)偶聯(lián)、融合或以其他方式附著。本發(fā)明能用來誘發(fā)強烈、持續(xù)的T細(xì)胞應(yīng)答，尤其可用于腫瘤的治療。相關(guān)技術(shù)免疫系統(tǒng)的本質(zhì)建立在兩個不同的基礎(chǔ)支柱上一個是特異性或獲得性免疫，其特征在于相對較慢的應(yīng)答動力學(xué)和記憶能力；另一個是非特異性或先天免疫，其顯示快速的應(yīng)答動力學(xué)，但缺乏記憶。巳經(jīng)明確，單獨施用純化蛋白質(zhì)通常不足以引起強烈的免疫應(yīng)答；分離的抗原通常必須與被稱為佐劑的輔助物質(zhì)一起施用。施用的抗原在這些佐劑內(nèi)受到保護(hù)而免遭快速降解，佐劑導(dǎo)致長時間釋放低水平抗原。與分離的蛋白質(zhì)不同，在不用任何佐劑、有及沒有T細(xì)胞輔助的情況下，病毒能誘導(dǎo)快速、有效的免疫應(yīng)答(Bachmann&Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15:235-270(1997))。許多病毒展示一種準(zhǔn)晶體表面，其表面顯示規(guī)則的表位陣列，可有效地將表位特異性免疫球蛋白交聯(lián)在B細(xì)胞上(Bachmann&Zinkernagel,Immunol.Today17:553-558(1996))。病毒結(jié)構(gòu)甚至與自身免疫病中抗-抗體的產(chǎn)生有關(guān)，是對病原體的自然應(yīng)答的一部分(參見Fehr,T.,etal.，J.Exp.Med.185:1785-1792(1997))。因此，病毒顆粒上以有序且重復(fù)陣列組織起來的抗原具有高度的免疫原性，因為它們能夠直接激活B細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生，后者是免疫系統(tǒng)的另一個重要武器。作為抗原的病毒顆粒與其分離的成分相比表現(xiàn)出兩個優(yōu)點(1)由于具有高度重復(fù)的表面結(jié)構(gòu)，它們能夠直接激活B細(xì)胞，產(chǎn)生高抗體滴度和長期的B細(xì)胞記憶；(2)病毒顆粒，而不是可溶性蛋白質(zhì)，具有誘發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的能力，即使這些病毒是非感染性的且不使用佐劑。另外，例如在細(xì)菌和大多數(shù)非脊推動物中存在的富含非甲基化CG基序(CpG)的DNA，在體外及體內(nèi)對B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和其它APC都顯示強刺激活性。盡管細(xì)菌DNA在許多脊推動物種之間是免疫刺激性的，但是各自的CpG基序可能不同。實際上，刺激小鼠免疫細(xì)胞的CpG基序可能不一定刺激人免疫細(xì)胞，反之亦然。另外，免疫刺激性CpG-寡脫氧核苷酸也誘發(fā)嚴(yán)重的副作用，在小鼠中引起髓外血細(xì)胞形成伴脾大和淋巴結(jié)病(Sparwasseretal.,J.Immunol.(1999),162:2368-74和實施例18)。最近疫苗接種策略已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，但是現(xiàn)有策略仍然需要改進(jìn)。特別是，本領(lǐng)域仍然需要研制新的改進(jìn)的疫苗，該疫苗在不普遍激活A(yù)PC和其它細(xì)胞的情況下，與天然病原體一樣有效地引起強CTL免疫應(yīng)答和抗病原體保護(hù)。黑素瘤是黑色素細(xì)胞或黑色素細(xì)胞相關(guān)痣細(xì)胞引起的攻擊性且通常轉(zhuǎn)移性的肺瘤。黑素瘤占全部皮膚癌的約3%,對于婦女，世界說明書第3/176頁上黑素瘤的增長超過除肺癌以外的其它所有腫瘤。甚至在黑素瘤明顯位于皮膚上時，仍有高達(dá)30。/。的患者發(fā)展為全身轉(zhuǎn)移，并且大多數(shù)將死亡。在過去十年中，已經(jīng)發(fā)展了免疫治療和基因治療作為治療黑素瘤的新的、有前途的方法，例如，在使用或不使用佐劑的情況下用MelanA/MART-l肽治療黑素瘤患者。這些策略通常獲得有限的成功。而且，大多數(shù)研究不是用MHCI類多聚體直接測定離體CTL應(yīng)答，而是使用CTL培養(yǎng)物，并刺激它們幾周時間，之后才能夠最終測定MelanA特異性CTL應(yīng)答。通常，肽本身不是免疫原性的，具有極短的半衰期。另外一種免疫治療方法是向樹突細(xì)胞中加載MelanA/MART-1肽，或者用MelanA/MART-l-RNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，并且重新注射給患者。這種方法的缺點是要從每一個體患者中純化自體樹突細(xì)胞并將其與細(xì)胞因子在體外孵育數(shù)天。這是非常精細(xì)的，因為為了具有免疫原性而不是可使T細(xì)胞不再對肺瘤應(yīng)答的耐受原性，樹突細(xì)胞必須保持正確的成熟狀態(tài)。Dudley,M.E.(Science.2002Oct25;298(5594):850-4)的另外一種方法是從患者的自體腫瘤物質(zhì)中分離MelanA-特異性T細(xì)胞，體外培養(yǎng)和擴增，并且重新注射給供體。如上述方法一樣，需要為每名個體患者分別制備特異性的疫苗，因此不是最有效的治療方法。因此，對于癌癥，特別是黑素瘤的免疫治療新策略的發(fā)展而言，有效黑素瘤疫苗的表征至關(guān)重要。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下的發(fā)現(xiàn)特定人MelanA肽類似物當(dāng)結(jié)合到具有內(nèi)在重復(fù)組織結(jié)構(gòu)的核心顆粒時，特別是分別結(jié)合到包裝有免疫刺激物(ISS)如DNA寡核苷酸的病毒樣顆粒(VLP)和VLP亞單位時，是誘導(dǎo)特異性抗體的強免疫原。本發(fā)明進(jìn)一步基于以下的發(fā)現(xiàn)免疫刺激物如DNA寡核苷酸能夠包裝到VLP內(nèi)，使其免疫原性增強。出乎意料的是，VLP內(nèi)的核酸和寡核苷酸分別能夠用免疫刺激物和含有CpG基序的DNA-寡核苷酸來特異替換。令人吃驚的是，這些包裝的免疫刺激物，特別是免疫刺激性核酸，如含非曱基化CpG的寡核苷酸，保留了其免疫刺激能力，但是不會廣泛激活先天免疫系統(tǒng)。含有根據(jù)本發(fā)明的VLP和免疫刺激物，特別是CpG-VLP的組合物，免疫原性顯著強于不含CpG的對應(yīng)物，并且誘發(fā)更強的B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答。另外，針對VLP和MelanA肽類似物的T細(xì)胞應(yīng)答尤其集中于Thl型。因此，附著于載有CpG的VLP上的人MelanA肽類似物可能是用于對抗胂瘤的預(yù)防性或治療性接種的理想疫苗。本發(fā)明提供1.一種組合物，其包含(a)病毒一羊顆粒；和(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。2.根據(jù)第1項的組合物，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過至少一個共價鍵結(jié)合，其中優(yōu)選地，所述共價鍵是非肽鍵。3.根據(jù)第1項的組合物，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒融合。4.根據(jù)第1-3項中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物能夠允許與MHC分子有效結(jié)合。5.根據(jù)第1-4項中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物的特征在于，相對于相應(yīng)的正常MelanA肽，具有兩個、優(yōu)選一個氨基酸置換。6.根據(jù)第l-4項中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物受到保護(hù)而免遭蛋白酶或肽酶介導(dǎo)的降解。7.根據(jù)第1-4項中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物具有選自下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQIDNO:84);(b)MAGIGILTV(SEQIDNO:85);(c)EAMGIGILTV(SEQIDNO:86);Cd)ELAGIGILTV(SEQIDNO:50);0)EMAGIGILTV(SEQIDNO:87);(f)YAAGIGILTV(SEQIDNO:88);和(g)FAAGIGILTV(SEQIDNO:89)。8.根據(jù)第1-4項中任一項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQIDNO:50)組成。9.根據(jù)第1-8項中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒含有至少一個第一附著位點，并且其中所述抗原或抗原決定簇進(jìn)一步含有至少一個選自下列的第二附著位點(a)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(b)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒的結(jié)合是通過所述第一附著位點與所述第二附著位點之間的連接實現(xiàn)的，其中優(yōu)選地這種連接是通過至少一個非肽鍵。10.根據(jù)第9項的組合物，其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重復(fù)的抗原陣列。11.根據(jù)第9或10項的組合物，其中所述第一附著位點包含，或者優(yōu)選地由氨基或賴氨酸殘基組成。12.根據(jù)第9-11項中任一項的組合物，其中所述第二附著位點包含，或者優(yōu)選地由巰基或半胱氨酸殘基組成。13.根據(jù)第9-12項中任一項的組合物，其中所述第一附著位點是賴氨酸殘基，并且所述第二附著位點是半胱氨酸殘基。14.根據(jù)第9-13項中任一項的組合物，其中所述第一附著位點是氨基，并且所述第二附著位點是巰基。15.根據(jù)第9-14項中任一項的組合物，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有選自下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55);(b)CGGELAGIGILTV(SEQIDNO:57);(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:58);(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:59);(e)ELAGIGILTVGGC(SEQIDNO:60);(f)CSPKSLELAGIGILTV(SEQIDNO:92);和(g)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQIDNO:93)。16.根據(jù)第9-14項中任一項的組合物，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有氨基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55)。17.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒缺乏含脂蛋白的包膜。18.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒選自(a)乙型肝炎病毒的重組蛋白；(b)麻滲病毒的重組蛋白；(c)辛德畢斯病毒的重組蛋白；(d)輪狀病毒的重組蛋白；(e)口蹄疫病毒的重組蛋白；(f)逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組蛋白；(g)諾瓦克病毒的重組蛋白；(h)人乳頭瘤病毒的重組蛋白；(i)BK病毒的重組蛋白；(j)噬菌體的重組蛋白；(k)RNA噬菌體的重組蛋白；(l)Ty的重組蛋白；和8(m)(a)-(l)中任何一種重組蛋白的片段。19.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。20.才艮據(jù)第19項的組合物，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物與所述乙型肝炎病毒核心蛋白或所述BK病毒VP1蛋白的C端融合，優(yōu)選地通過連沖妻序列融合。21，根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段組成，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Q(3;(b)噬菌體R17;(c)噬菌體fr;(d)噬菌體GA;(e)噬菌體SP;(f)噬菌體MS2;(g)噬菌體M11;(h)噬菌體MX1;(i)噬菌體NL95;(j)噬菌體f2;(k)噬菌體PP7;和(1)噬菌體AP205。22.才艮據(jù)前述任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由噬菌體Q(3或噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。23.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述免疫刺激物是toll樣受體激活物或細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)物，其中優(yōu)選地該Toll樣受體激活物選自，或基本由下列成分組成(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并會啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有機分子；(i)含非曱基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一種物質(zhì)的任意混合物。24.第23項的組合物，其中所述免疫刺激性核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)核糖核酸；(b)脫氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一種核酸的任意混合物。25.第24項的組合物，其中所述核糖核酸是poly-(I:C)或其衍生物。26.第24項的組合物，其中所述脫氧核糖核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)含非曱基化CpG的寡核苷酸；和(b)不含非曱基化CpG基序的寡核苷酸。27.第l-24和26項中任一項的組合物，其中所述免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸。28.第27項的組合物，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸包含序列5,X1X2CGX3X43,,其中XpX2、X3和X4是任一種核苷酸。29.第28項的組合物，其中所述核苷酸X^X2、X3和X4中的至少一個含有磷酸骨架的修飾。30.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述含非甲基化CpG的寡核苦酸，包含、或者基本由、或者由回文序列組成。31.第27項的組合物，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由選自下列的序列組成(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQIDNO:35);(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQIDNO:37);(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQIDNO:39);(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:41);和(e)如表2所述的"dsCyCpG-253"(SEQIDNO:49)，其中優(yōu)選地，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。32.第27項的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:41)組成。33.才艮據(jù)前述任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述免疫刺激性核酸，更優(yōu)選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。34.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒非共價結(jié)合。35.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述含非甲基化CpG的寡核苦酸，與所述病毒樣顆粒非共價結(jié)合。36.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述免疫刺激性核酸，更優(yōu)選所述含非曱基化CpG的寡核香酸，含有約6個至約100,000個核苷酸，優(yōu)選約6個至約2000個核苷酸，更優(yōu)選約20個至約500個核苷酸，更優(yōu)選約20個至約100個核苷酸。37.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述免疫刺激性核酸，更優(yōu)選所述含非曱基化CpG的寡核苷酸，選自(a)重組寡核苷酸；(b)基因組寡核苷酸；(c)合成寡核苷酸；(d)質(zhì)粒衍生的寡核苷酸；(e)單鏈寡核苷酸；和(f)雙鏈寡核苷酸。38.第30項的組合物，其中所述回文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQIDNO:l)組成。39.第38項的組合物，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少3個、至多IO個鳥苷，并且其中所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。40.第38項的組合物，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少4個、至多IO個鳥苷，并且其中所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。41.第38項的組合物，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少5個、至多IO個鳥苷，并且其中所述回文序列在其3，端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。42.第38項的組合物，其中所述含非曱基化CpG的寡核普酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:2);(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:3);(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:4);(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:5);(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQIDNO:6);(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:7);(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQIDNO:8);9);和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:41)。43.第27或38項的組合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:41的核酸序列。44.根據(jù)前述任一項的組合物，其中所述抗原包含細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接結(jié)合或者通過連接序列結(jié)合，并且其中優(yōu)選地所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位是病毒或腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。45.第44項的組合物，其中所述抗原包含至少一種細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位和至少一種Th細(xì)胞表位的組合，并且其中所述組合是MelanA1-118A/L(SEQIDNO:94)。46.—種增強動物中免疫應(yīng)答的方法，包括向該動物中導(dǎo)入一種組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。47.第46項的方法，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過至少一個共價鍵結(jié)合，其中所述共價鍵是非肽鍵。48.第46項的方法，其中所述至少一種抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒融合。49.第46-48項中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物能夠允許與MHC分子有效結(jié)合。50.第46-49項中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物的特征在于，相對于相應(yīng)的正常MelanA肽有兩個，優(yōu)選一個氨基酸置換。51.第46-50項中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物受到保護(hù)而免遭蛋白酶或肽酶介導(dǎo)的降解。52.第46-51項中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物具有選自下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQIDNO:84);(b)MAGIGILTV(SEQIDNO:85);(c)EAMGIGILTV(SEQIDNO:86);(d)ELAGIGILTV(SEQIDNO:50);(e)EMAGIGILTV(SEQIDNO:87);(f)YAAGIGILTV(SEQIDNO:88);和(g)FAAGIGILTV(SEQIDNO:89)。53.第46-51項中任一項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQIDNO:50)組成。54.第46-53項中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒含有至少一個第一附著位點，并且其中所述抗原或抗原決定簇進(jìn)一步含有至少一個選自下列的第二附著位點(a)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(b)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒的結(jié)合是通過所述第一附著位點與所述第二附著位點之間的連接實現(xiàn)的，其中優(yōu)選地這種連接是通過至少一個非肽鍵。55.第54項的方法，其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重復(fù)的抗原陣列。56.第54或55項的方法，其中所述第一附著位點包含，或者優(yōu)選地由氨基或賴氨酸殘基組成。57.根據(jù)第54-56項中任一項的方法，其中所述第二附著位點包含，或者優(yōu)選地由巰基或半胱氨酸殘基組成。58.根據(jù)第54-57項中任一項的方法，其中所述第一附著位點是賴氨酸殘基，并且所述第二附著位點是半胱氨酸殘基。59.根據(jù)第54-58項中任一項的方法，其中所述第一附著位點是氨基，并且所述第二附著位點是巰基。60.根據(jù)第54-59項中任一項的方法，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有選自下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55);(b)CGGELAGIGILTV(SEQIDNO:57);(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:58);Cd)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:59);和(e)ELAGIGILTVGGC(SEQIDNO:60);(f)CSPKSLELAGIGILTV(SEQIDNO:92);和(g)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQIDNO:93)。61.根據(jù)第54-59項中任一項的方法，其中帶有所述第二附著位點的所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有氨基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55)。62.根據(jù)第46-61項中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒選自(a)乙型肝炎病毒的重組蛋白；(b)麻滲病毒的重組蛋白；(c)辛德畢斯病毒的重組蛋白；(d)輪狀病毒的重組蛋白；(e)口蹄疫病毒的重組蛋白；(f)逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組蛋白；(g)諾瓦克病毒的重組蛋白；15(h)人乳頭瘤病毒的重組蛋白；(i)BK病毒的重組蛋白；(j)噬菌體的重組蛋白；(k)RNA噬菌體的重組蛋白；(l)Ty的重組蛋白；和(m)(a)-(l)中任何一種重組蛋白的片段。63.根據(jù)第46-62項中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。64.根據(jù)第63項的方法，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物與所述乙型肝炎病毒核心蛋白或所述BK病毒VP1蛋白的C端融合，優(yōu)選地通過連4妻序列融合。65.根據(jù)第46-64項中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的重組蛋白或其片段，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體QP;(b)噬菌體R17;(c)噬菌體fr;(d)嗟菌體GA;(e)噬菌體SP;(f)噬菌體MS2;(g)噬菌體M11;(h)噬菌體MX1;(i)噬菌體NL95;(j)噬菌體f2;(k)噬菌體PP7;和(1)噬菌體AP205。66.根據(jù)第46-65項中任一項的方法，其中所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由噬菌體Q(3或噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。67.根據(jù)第46-66項中任一項的方法，其中所述免疫刺激物是toll樣受體激活物或細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)物，其中優(yōu)選地該Toll樣受體激活物選自，或基本由下列成分組成(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪哇并會啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有機分子；(i)含非曱基化CpG的寡核苷酸；和①(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一種物質(zhì)的4壬意混合物。68.第67項的方法，其中所述免疫刺激性核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)核糖核酸；(b)脫氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一種核酸的任意混合物。69.第68項的方法，其中所述核糖核酸是poly-(I:C)或其衍生物。70.第68項的方法，其中所述脫氧核糖核酸選自，或者基本由下列成分組成(a)含非曱基化CpG的寡核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。71.第46-68和70項中任一項的方法，其中所述免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸。72.第71項的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有序列5U2CGX3X43，，其中X^X2、X3和X4是任一種核苷酸。73.第72項的方法，其中所述核苷酸Xi、X2、X3和X4中的至少一個含有磷酸骨架的修飾。74.根據(jù)第46-73項中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含、或者基本由、或者由回文序列組成。75.第71項的方法，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由選自下列的序列組成(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQIDNO:35);(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQIDNO:37);(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQIDNO:39);(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:41);和(e)如表2所述的"dsCyCpG-253"(SEQIDNO:49);其中優(yōu)選地，所述含非曱基化CpG的寡核苷酸含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。76.第71項的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是回文的，并且其中優(yōu)選地，所述含非曱基化CpG的回文寡核苷酸包含，或者由序歹UGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:41)組成。77.根據(jù)第46-76項中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述免疫刺激性核酸，更優(yōu)選所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有一個或多個磷酸骨架的硫代磷酸修飾，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每個磷酸部分是一個硫代磷酸修飾。78.根據(jù)第46-77項中任一項的方法，其中所述免疫刺激物，優(yōu)選所述含非曱基化CpG的寡核苷酸，與所述病毒樣顆粒非共價結(jié)合。79.根據(jù)第46-78項中任一項的方法，其中所述免疫刺激物，優(yōu)選所述含非曱基化CpG的寡核苷酸，被所述病毒樣顆粒包裝，優(yōu)選i也包封。80.根據(jù)第46-79項中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述免疫刺激性核酸，更優(yōu)選所述含非曱基化CpG的寡核苷酸，含有約6個至約100,000個核苷酸，并且優(yōu)選地，其中所述免疫刺激性核酸，優(yōu)選所述含非曱基化CpG的寡核苷酸，含有20至100個核普酸。81.根據(jù)第46-80項中任一項的方法，其中所述至少一種免疫刺激物，優(yōu)選所述免疫刺激性核酸，更優(yōu)選所述含非甲基化CpG的寡核苦酸，選自(a)重組寡核苷酸；(b)基因組寡核苷酸；(c)合成寡核苷酸；(d)質(zhì)粒衍生的寡核苷酸；(e)單鏈寡核苷酸；和(f)雙鏈寡核苷酸。82.第74項的方法，其中所述回文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQIDNO:l)組成。83.第82項的方法，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少3個、至多IO個鳥苷，并且其中所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。84.第82項的方法，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少4個、至多IO個鳥苷，并且其中所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。85.第82項的方法，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少5個、至多IO個鳥苷，并且其中所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。86.第82項的方法，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:2);19(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:3);(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:4);(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:5);(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQIDNO:6);①GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:7);(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQIDNO:8);Ch)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQIDNO:9);和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:41)。87.第71或82項的方法，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:41的核酸序列。88.第46-87項中任一項的方法，其中所述抗原包含細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接連接或者通過連接序列連接，并且其中優(yōu)選地所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位是病毒或腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。89.第46-87項中任一項的方法，其中所述免疫應(yīng)答是增強的B細(xì)胞應(yīng)答或增強的T細(xì)胞應(yīng)答，其中優(yōu)選地所述T細(xì)胞應(yīng)答是CTL應(yīng)答或Th細(xì)胞應(yīng)答，并且其中更優(yōu)選地所述Th細(xì)胞應(yīng)答是Thl細(xì)胞應(yīng)答。90.第46-89項中任一項的方法，其中所述動物是哺乳動物，并且其中優(yōu)選地所述哺乳動物是人。91.第46-90項中任一項的方法，其中所述組合物經(jīng)皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或直接導(dǎo)入淋巴結(jié)內(nèi)而導(dǎo)入所述動物內(nèi)。92.—種疫苗，其含有免疫有效量的第1-45項中任一項的組合物以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，并且其中優(yōu)選地所述疫苗進(jìn)一步含有佐劑。93.—種免疫或治療動物的方法，包括對該動物施用免疫有效量的第92項的疫苗。94.第93項的方法，其中所述動物是哺乳動物，并且其中優(yōu)選地所述哺乳動物是人。95.—種免疫或治療動物的方法，包括通過施用免疫有效量的第92項的疫苗，而在所述動物中引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。96.第95項的方法，其進(jìn)一步包括加強所述動物中的免疫應(yīng)答的步驟，其中優(yōu)選地，這種加強是通過施用免疫有效量的第92項的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現(xiàn)的，其中更優(yōu)選地，所述異種疫苗是DNA疫苗。97.—種免疫或治療動物的方法，包括在所述動物中引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答和加強所述動物中的T細(xì)胞應(yīng)答的步驟，其中這種加強是通過施用免疫有效量的第92項的疫苗來實現(xiàn)的。98.第97項的方法，其中所述引發(fā)是通過施用免疫有效量的第92項的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現(xiàn)的，其中更優(yōu)選地，所述異種疫苗是DNA疫苗。在第一個實施方案中，本發(fā)明提供一般且優(yōu)選地用于增強動物中的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含病毒樣顆粒，免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，更優(yōu)選含非曱基化CpG的寡核苷酸，和至少一種抗原或抗原決定簇，其中所述免疫刺激物、核酸或寡核苷酸與病毒樣顆粒偶聯(lián)、融合或以其他方式附著，或被病毒樣顆粒包封，即與之結(jié)合，并且其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，免疫刺激性核酸，特別是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通過磷酸骨架的硫代磷酸修飾而穩(wěn)定化。在另一個優(yōu)選實施方案中，免疫刺激性核酸，特別是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通過消化VLP內(nèi)的RNA同時添加含有所選CpG的DNA寡核香酸，而被包裝到VLP內(nèi)。在一個同樣優(yōu)選的實施方案中，可將VLP解裝配，之后在CpG存在下重裝配。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激性核酸不含CpG基序，但是顯示免疫刺激活性。這些核酸在WO01/22972中有描述。其中所述的所有序列都在此引用作為參考。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。同樣優(yōu)選地，病毒樣顆粒不含脂蛋白包膜。優(yōu)選地，重組病毒樣顆粒包含或者由下列成分組成乙型肝炎病毒、BK病毒或其它人多瘤病毒、麻滲病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒或人乳頭瘤病毒、RNA-噬菌體、QP-噬菌體、GA-噬菌體、fr-噬菌體和Ty的重組蛋白。在一個具體實施方案中，病毒樣顆粒包含或者由一種或多種不同的乙型肝炎病毒核心(衣殼)蛋白(HBcAg)組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含RNA-噬菌體的重組蛋白或其片段。優(yōu)選的RNA-噬菌體是QP-噬菌體、AP205-噬菌體、GA-噬菌體、fr-噬菌體。在一個具體實施方案中，抗原包含或者由細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位組成。在一個相關(guān)實施方案中，病毒樣顆粒包含乙型肝炎病毒核心蛋白，細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位與該乙型肝炎病毒核心蛋白的C端融合。在一個實施方案中，它們通過亮氨酸連接序列融合。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述抗原是適于誘發(fā)針對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種增強人或其它動物種中的免疫應(yīng)答的方法，包括向該動物體內(nèi)導(dǎo)入一種組合物，該組合物包含病毒樣顆粒，免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，更優(yōu)選含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一種抗原或抗原決定簇，其中該免疫刺激物，優(yōu)選核酸，更優(yōu)選寡核苷酸，與該病毒樣顆粒結(jié)合(即偶聯(lián)、附著或包封)，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，并且其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物與所述病毒樣顆粒結(jié)合。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述組合物通過皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)或直接導(dǎo)入淋巴結(jié)內(nèi)而導(dǎo)入動物體內(nèi)。在一個同樣優(yōu)選的實施方案中，在希望對其接種的腫瘤或局部病毒灶附近局部施用這種免疫增強組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，所述免疫應(yīng)答是T細(xì)胞應(yīng)答，并且針對抗原的T細(xì)胞應(yīng)答增強。在一個具體實施方案中，該T細(xì)胞應(yīng)答是細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，并且針對MelanA肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答增強。本發(fā)明也涉及一種疫苗，其包含免疫有效量的本發(fā)明的免疫增強組合物，以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。在一個優(yōu)選實施方案中，該疫苗進(jìn)一步包含至少一種佐劑。本發(fā)明還提供一種免疫和/或治療動物的方法，包括對動物施以免疫有效量的本發(fā)明公開的疫苗。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，含有免疫刺激物的VLP，優(yōu)選含有免疫刺激性核酸的VLP,更優(yōu)選含有非甲基化CpG的寡核苷酸VLP,用于接種動物，一般且優(yōu)選地接種人，以分別對抗黑素瘤或MelanA肽。這種修飾過的VLP—般且優(yōu)選地可以用來針對胂瘤接種。這種接種可以是用于預(yù)防或治療目的，或者同時用于這兩種目的。注射途徑優(yōu)選的是皮下或肌肉內(nèi)途徑，但是也可以通過真皮內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)或直接導(dǎo)入淋巴結(jié)內(nèi)來給予含CpG的VLP。在一個同樣優(yōu)選的實施方案中，在希望對其接種的胂瘤或局部病毒灶附近局部施用與含CpG的MelanA肽類似物偶聯(lián)的或游離的VLP。應(yīng)當(dāng)理解，以上的概述和下面的詳述只是代表性和說明性的，旨在進(jìn)一步說明要求保護(hù)的本發(fā)明。附圖簡述圖1顯示Qb-MelanAVLP的SDS-PAGE分析。如實施例20所述，MelanA-肽與QbVLP偶聯(lián)。終產(chǎn)物與樣品緩沖液混合，在還原條件下在16。/。Novex⑧Tris-甘氨酸凝膠上分離，125V,1.5小時。通過將凝膠浸泡在考馬斯藍(lán)溶液中染色分離的蛋白質(zhì)。用50%曱醇，8%乙酸洗滌凝膠除去背景染色。分子量標(biāo)準(zhǔn)(P77085,NewEnglandBioLabsBeverly,USA)用作Qb-MelanA遷移速度的參照(泳道1)。加樣14嗎單獨的Qb(泳道2)或SMPH書t化的Qb(泳道3),用來與下列8各種終產(chǎn)物比較Qb-MelanA16-35(泳道4)、Qb-MelanA16-35A/L(泳道5)、Qb-MelanA26-35(泳道6)和Qb-MelanA26-35A/L(泳道7)。圖2A顯示ISS處理的人PBMC的上清液中釋放的IFNoc。PBMC從血沉棕黃層獲得，并且與5倍稀釋的所示ISS—起孵育18小時。術(shù)語G10用于指寡核苷酸G10-PO，術(shù)語G3用于指寡核苷酸G3-6。收集上清液，使用PBLBiomedicalLaboratories提供的一組抗體，通過ELISA測定IFNoc。圖2B顯示用ISS處理的人CD8+PBMC上CD69的上調(diào)。PBMC從血沉棕黃層獲得，并且與5倍稀釋的所示ISS—起孵育18小時。洗滌細(xì)胞，與抗CD8-FITC、抗CD19-PE和抗CD69-APC(均獲自BDPharMingen)在水上孵育20分鐘。洗滌后，使用CellQuest軟件在FACSCalibur上分析細(xì)胞。圖3顯示痘苗保護(hù)試驗中用包裝有poly(I:C)、G3-6或G6的Qbx33免疫小鼠后的病毒滴度。C57B16小鼠通過注射以下成分免疫100|ugQbx33,100|ag包裝有poly(I:C)并與p33偶聯(lián)的QbVLP(Qb-pIC-33，也被稱為QbxZnxpolylCxp33GGC),90|Lig包裝有G3-6的Qbx33(Qbx33/G3-6),或90嗎包裝有G6的Qbx33(Qbx33/G6)。8天后，用1.5xl(^噬斑形成單位的攜帶LCMV-p33表位的痘苗病毒攻擊小鼠。5天后，殺死小鼠，取出卵巢。由卵巢制備單細(xì)胞懸液，以連續(xù)稀釋加至BCS40細(xì)胞中。1天后，細(xì)胞層用含有50%乙醇、2%甲醛、0.8%NaCl和0.5%結(jié)晶紫的溶液染色，并計數(shù)病毒嗟斑。發(fā)明詳述除非另外定義，此處使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管在本發(fā)明的實施與試驗中可以使用與此處所述相似或相當(dāng)?shù)娜魏尾牧吓c方法，但是下文描述了優(yōu)選的材料與方法。1.定義氨基酸接頭本說明書中的"氨基酸接頭"，也被稱為"接頭"，用來連接抗原或抗原決定簇和第二附著位點，或者更優(yōu)選地，該接頭已經(jīng)包含或含有第二附著位點，該附著位點一般(但不是一定)是一個氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。然而，如此處所用的術(shù)語"氨基酸接頭"并非意味著這種氨基酸接頭只由氨基酸殘基組成，盡管由氨基酸殘基組成的氨基酸接頭是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。氨基酸接頭的氨基酸殘基優(yōu)選地由本領(lǐng)域公知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸、所有L-或所有D-氨基酸或其混合物組成。然而，本發(fā)明也包括含有帶巰基或半胱氨酸殘基的分子的氨基酸接頭。該分子優(yōu)選地含有Cl-C6烷基、環(huán)烷基(C5,C6)、芳基或雜芳基部分。然而，除了氨基酸接頭外，本發(fā)明范圍內(nèi)也包括優(yōu)選含有Cl-C6烷基、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分且不含任何氨基酸的接頭?？乖蚩乖瓫Q定簇或任選地第二附著位點與氨基酸接頭的連接優(yōu)選地是通過至少一個共價鍵，更優(yōu)選地是通過至少一個肽鍵。動物如此處所用的術(shù)語"動物，，包括，例如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠、小鼠、哺乳動物、鳥類、爬行動物、魚、昆蟲和錄。蛛類動物?？贵w如此處所用的術(shù)語"抗體"是指能夠結(jié)合表位或抗原決定簇的分子。該術(shù)語包括整個抗體及其抗原結(jié)合性片段，包括單鏈抗體。最優(yōu)選地，這些抗體是人抗原結(jié)合性抗體片段，包括但不限于Fab、Fab，和F(ab，)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv),以及包含Vl或Vh域的片段。這些抗體可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選地，這些抗體是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的抗體。如此處所用的"人"抗體包括含有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，包括分離自人免疫球蛋白文庫的抗體，或者來自不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白而表達(dá)一種或多種人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的抗體，如Kucherlapati等人申請的美國專利No.5,939,598所述?？乖绱颂幩玫男g(shù)語"抗原"是指如果被MHC分子呈遞時能夠:帔抗體或T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的分子。如此處所用的術(shù)語"抗原"25也包括T細(xì)胞表位。抗原還能夠被免疫系統(tǒng)識別，以及/或者能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有或連接于T輔助細(xì)胞表位(Th細(xì)胞表位)，并且包含于佐劑中。一個抗原可能包含一個或多個表位(B和T表位)。上述特異性反應(yīng)是指抗原優(yōu)選地通常以高選拷:性方式與其相應(yīng)的抗體或TCR反應(yīng)，而不與可能由其它抗原誘導(dǎo)的許多其它抗體或TCR反應(yīng)。如此處所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混合物。如此處所用的"腫瘤抗原"是指與腫瘤或癌癥相關(guān)并且能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的化合物，如肽。特別是，該化合物在MHC分子中呈遞時能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。腫瘤抗原能夠由癌細(xì)胞通過如下方法制備制備癌細(xì)胞的粗提物，如Cohenetal.,CancerResearch,54:1055(1994)所述；部分純化抗原；利用重組技術(shù)或從頭合成已知抗原。腫瘤抗原包括是整個腫瘤或癌癥多肽或是其抗原性部分的抗原。這些抗原可以分離或者重組制備或通過本領(lǐng)域公知的其它任何方法制備。癌癥或腫瘤包括但不限于膽管癌；腦癌；乳腺癌；宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；胃癌；上皮內(nèi)癌；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小細(xì)胞和非小細(xì)胞癌)；黑素瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤；皮膚癌；睪丸癌；曱狀腺癌；腎癌，以及其它癌和肉瘤?？乖瓫Q定簇如此處所用的術(shù)語"抗原決定簇"是指可被B或T淋巴細(xì)胞特異性識別的抗原的部分。B淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體響應(yīng)外源抗原決定簇，而T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的介質(zhì)。因此，抗原決定簇或表位是可被抗體識別或者(在MHC中)可被T細(xì)胞受體識別的抗原的那些部分。抗原呈遞細(xì)胞如此處所用的術(shù)語"抗原呈遞細(xì)胞"是指具有免疫刺激能力的一群不均一的白細(xì)胞或骨髓來源的細(xì)胞。例如，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生可與MHC分子結(jié)合而能夠被T細(xì)胞識別的肽。該術(shù)語與術(shù)語"佐細(xì)胞"同義，包括如朗罕氏細(xì)胞、交確晉突細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。在某些條件下，上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其它非骨髓來源的細(xì)胞也可以作為抗原呈遞細(xì)胞。連接(association):如此處所用的術(shù)語"連接"當(dāng)用于第一和第二附著位點時，是指第一附著位點與第二附著位點優(yōu)選地通過至少一個非肽鍵的結(jié)合。連接的性質(zhì)可以是共價、離子、疏水、極性的或其任意組合，優(yōu)選地，連接的性質(zhì)是共價的，更優(yōu)選地，連接是通過至少一個，優(yōu)選一個非肽鍵。如此處所用的術(shù)語"連接"當(dāng)用于第一和第二附著位點時，不僅包括第一附著位點和第二附著位點直接結(jié)合或連接形成本發(fā)明的組合物，另外且優(yōu)選地，還包括第一附著位點和第二附著位點間接連接或結(jié)合產(chǎn)生本發(fā)明的組合物，一般且優(yōu)選地使用異雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行這種間接連接或結(jié)合。第一附著位點如此處所用的短語"第一附著位點"是指通常且優(yōu)選地包含于病毒樣顆粒內(nèi)的非天然或天然來源的一種組件，通常且優(yōu)選地包含于本發(fā)明的MelanA肽類似物內(nèi)的第二附著位點可與之連接。第一附著位點可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯曱基磺酰氟)或其組合，或其化學(xué)反應(yīng)基。第一附著位點通常且優(yōu)選地位于病毒樣顆粒的表面上。病毒樣顆粒表面上存在多個第一附著位點，一般呈重復(fù)構(gòu)型。優(yōu)選地，第一附著位點是氨基酸或其化學(xué)反應(yīng)基。第二附著位點如此處所用的短語"第二附著位點"是指與本發(fā)明的MelanA肽類似物連接，通常且優(yōu)選地包含于后者之內(nèi)的組件，位于病毒樣顆粒表面上的第一附著位點可與之連接。本發(fā)明的MelanA肽類似物的第二附著位點可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯曱基磺酰氟)或其組合，或其化學(xué)反應(yīng)基。本發(fā)明的MelanA肽類似物上存在至少一個第二附著位點。因此，術(shù)語"具有至少一個第二附著位點的MelanA肽類似物"是指至少含有本發(fā)明的MelanA肽類似物和該第二附著位點的抗原或抗原性構(gòu)建體。然而，特別是對于非天然來源的第二附著位點，(即本發(fā)明的MelanA肽類似物內(nèi)非天然存在)的第二附著位點，這些抗原或抗原性構(gòu)建體含有"氨基酸接頭"。結(jié)合(bound):如此處所用的術(shù)語"結(jié)合"是指這樣的結(jié)合它可以是共價的，例如通過化學(xué)偶聯(lián)，或者是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。共價鍵可能是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等。術(shù)語"結(jié)合"比諸如"偶聯(lián)"、"融合"、"連接"和"附著"的術(shù)語更廣義，并且包括后面這些。而且，對于與病毒樣顆粒結(jié)合的免疫刺激物，術(shù)語"結(jié)合"也包括免疫刺激物的包封或部分包封。因此，對于與病毒樣顆粒結(jié)合的免疫刺激物，術(shù)語"結(jié)合"比"i者如"偶聯(lián)"、"融合"、"包封"、"包裝"和"附著"的術(shù)語更廣義，并且包括后面這些。例如，免疫刺激物，如含非曱基化CpG的寡核苷酸，可以被VLP包封，而不存在實際上的結(jié)合，不管是共價的還是非共價的。外殼蛋白如此處所用的術(shù)語"外殼蛋白"是指能夠摻入噬菌體或RNA-噬菌體的衣殼裝配體內(nèi)的噬菌體或RNA-噬菌體的蛋白質(zhì)。然而，當(dāng)指RNA-噬菌體的外殼蛋白基因的具體基因產(chǎn)物時，使用術(shù)語"CP"。例如，RNA-噬菌體QP的外殼蛋白基因的具體基因產(chǎn)物被稱為"Q|3CP"，而噬菌體Q(3的"外殼蛋白"包含"Q卩CP"以及A1蛋白。噬菌體Q(3的衣殼主要由QPCP組成，含有少量Al蛋白。同樣，VLPQ(3外殼蛋白主要含有Q(3CP,以及少量A1蛋白。偶聯(lián)如此處所用的術(shù)語"偶聯(lián)"是指通過共價鍵或通過非共價相互作用而附著。對于抗原與病毒樣顆粒的偶聯(lián)，術(shù)語"偶聯(lián)"優(yōu)選地指通過共價鍵附著。此外，對于抗原與病毒樣顆粒的偶聯(lián)，術(shù)語"偶聯(lián)"優(yōu)選地指通過至少一個非肽鍵分別連接和附著。本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的偶聯(lián)生物活性物質(zhì)的任何方法都可用于本發(fā)明。融合如此處所用的術(shù)語"融合"是指不同來源的氨基酸序列通過其編碼核苷酸序列的框內(nèi)組合而組合在一條多肽鏈中。除了與末端之一融合外，術(shù)語"融合"顯然還包括內(nèi)部融合，即不同來源的序列插入一條多肽鏈內(nèi)。CpG:如此處所用的術(shù)語"CpG"是指含有至少一個非曱基化胞嘧啶、鳥噪呤二核香酸序列的寡核普酸(例如"CpGDNA"或含有胞嘧啶及隨后的鳥噪呤、并通過磷酸酯鍵連接的DNA)，它能刺激/激活脊推動物細(xì)力包，例如對該細(xì)胞具有促細(xì)胞分裂作用，或i秀導(dǎo)或提高該細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。例如，CpG可用于激活B細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，如單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及T細(xì)胞。CpG也可包括核苦酸類似物，如含有磷酸硫酯鍵的類似物，并且可以是雙鏈或單鏈的。通常雙鏈分子在體內(nèi)更穩(wěn)定，而單鏈分子免疫活性更高。表位如此處所用的術(shù)語"表位"是指在動物、優(yōu)選哺乳動物、最優(yōu)選在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽的部分。如此處所用的"免疫原性表位"被定義為通過本領(lǐng)域公知的任何方法測定，能夠在動物中引發(fā)抗體應(yīng)答或誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的多肽的一部分(參見，例如Geysenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002(1983))。如此處所用的術(shù)語"抗原性表位"被定義為蛋白質(zhì)的一部分，通過本領(lǐng)域/>知的任何方法測定，抗體能夠?qū)⑺目乖c該部分免疫特異性結(jié)合。免疫特異性結(jié)合不包括非特異性結(jié)合，但是不一定排除與其它抗原的交叉反應(yīng)性。抗原性表位不需要必須是免疫原性的?？乖员砦灰部梢允荰細(xì)胞表位，在這種情況下它們能被MHC分子內(nèi)的T細(xì)胞受體免疫特異性地結(jié)合。一個表位可以以該表位特有的空間構(gòu)象包含3個氨基酸。一個表位通常由至少約5個這樣的氨基酸組成，更常見地由至少約8-10個這樣的氨基酸組成。如果表位是一種有機分子，它可以象硝基苯基一樣小。優(yōu)選的表位是本發(fā)明的MelanA-肽類似物。免疫應(yīng)答如此處所用的術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞激活或增殖的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)月包免疫應(yīng)答。然而，在某些情況下，免疫應(yīng)答可能是低強度的，只有在使用至少一種本發(fā)明的物質(zhì)時才能檢測到。"免疫原性的"是指一種試劑，它用來刺激活生物的免疫系統(tǒng)，使得免疫系統(tǒng)的一種或多種功能增強，并且針對該免疫原性試劑。"免疫原性多肽"是這樣一種多肽，無論它是單獨的還是與載體相連接，使用還是不使用佐劑，它都能引發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。免疫如此處所用的術(shù)語"免疫"或相關(guān)術(shù)語是指提供產(chǎn)生針對耙抗原或表位的實質(zhì)性免疫應(yīng)答(包括抗體和/或細(xì)胞免疫，如效應(yīng)CTL)的能力。這些術(shù)語不要求產(chǎn)生完全免疫，而是產(chǎn)生實質(zhì)性高于基線的免疫應(yīng)答。例如，如果在使用本發(fā)明的方法后哺乳動物產(chǎn)生針對靶抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答，則可認(rèn)為該動物針對該靶抗原進(jìn)行了免疫。免疫刺激性核酸如此處所用的術(shù)語免疫刺激性核酸是指能夠誘發(fā)和/或增強免疫應(yīng)答的核酸。如此處所用的免疫刺激性核酸包括核糖核酸，特別是脫氧核糖核酸。優(yōu)選地，免疫刺激性核酸包含至少一個CpG基序，如CG二核苷酸，其中C未甲基化。CG二核苷酸可以是回文序列的一部分，或者可以包含于一種非回文序列內(nèi)。如上所述的不含CpG基序的免疫刺激性核酸包括，例如，缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有帶有曱基化CG二核苷酸的CG基序的核酸。如此處所用的術(shù)語"免疫刺激性核酸"也指含有修飾堿基如4-溴-胞嘧啶的核酸。免疫刺激物如此處所用的術(shù)語"免疫刺激物"是指能夠誘發(fā)和/或增強免疫應(yīng)答的物質(zhì)。如此處所用的免疫刺激物包括但不限于toll樣受體激活物和誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的物質(zhì)。Toll樣受體激活物包括但不限于免疫刺激性核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激性有機物，如紫杉醇。如此處所用的術(shù)語"天然人MelanA肽"或"正常人MelanA肽"是指包含、或者基本由、或者由下列氨基酸序列組成的肽代表正常人MelanA蛋白質(zhì)序列氨基酸位點26-35的氨基酸序列EAAGIGILTV(SEQIDNO:78),或代表正常人MelanA蛋白質(zhì)序列氨基酸位點27-35的AAGIGILTV(SEQIDNO:79)。如此處所用的術(shù)語"MelanA肽類似物"或"人MelanA肽類似物"或"人黑素瘤MelanA肽類似物"被定義為相應(yīng)正常MelanA肽的氨基酸序列改變了至少一個氨基酸或氨基酸衍生物的肽，其中這種改變可包括氨基酸置換和/或缺失和/或插入或其組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如此處所用的術(shù)語"MelanA肽類似物";波定義為相應(yīng)正常MelanA肽的氨基酸序列(SEQIDNO:91)改變了三個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選一個氨基酸或氨基酸衍生物的肽，其中這種改變可包括氨基酸置換和/或缺失和/或插入或其組合。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，如此處所用的術(shù)語"MelanA肽類似物"纟皮定義為相應(yīng)正常MelanA肽的氨基酸序列改變?nèi)齻€、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選一個氨基酸或氨基酸衍生物的肽，其中這種改變可包括氨基酸置換和/或缺失和/或插入或其組合，并且其中這種改變位于正常人MelanA蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:91)的位點26、27、28和/或35處，并且其中這種改變優(yōu)選地是氨基酸置換。術(shù)語"MelanA肽類似物"、"人MelanA肽類似物，，、"人黑素瘤MelanA肽類似物，，和"人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物"可以互換^使用。天然來源如此處所用的術(shù)語"天然來源"是指其全部或部分不是合成的，而是天然存在或產(chǎn)生的。非天然的如此處所用時，該術(shù)語通常是指并非來自天然，更具體而言，該術(shù)語是指來自人工。非天然來源如此處所用的術(shù)語"非天然來源，，通常是指合成的或者并非來自天然；更具體而言，該術(shù)語是指來自人工。有序且重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列如此處所用的術(shù)語"有序且重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列"通常是指抗原或抗原決定簇的重復(fù)粒一般且優(yōu)選地均勻空間排列。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種重復(fù)模式可以是一種幾何模式。合適的有序且重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列的典型和優(yōu)選實例具有嚴(yán)格重復(fù)的抗原或抗原決定簇類結(jié)晶排列，優(yōu)選間隔0.5-30納米，更優(yōu)選3-15納米，更優(yōu)選3-8納米。寡核苷酸如此處所用的術(shù)語"寡核苷酸"或"寡聚體"是指一種核酸序列，其包含2個或更多的核苷酸，通常至少約6個核苷酸到約100,000個核香酸，優(yōu)選約6個到約2000個核苷酸，更優(yōu)選約6個到約300個核苷酸，更優(yōu)選約20個到約300個核香酸，更優(yōu)選地約20個到約IOO個核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"或"寡聚體"也指包含超過100個到約2000個核苷酸、優(yōu)選超過100個到約1000個核苷酸、更優(yōu)選超過100個到約500個核苷酸的核酸序列。"寡核苷酸"通常也指任何一種聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，它可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。"寡核苷酸"包括但不限于單鏈和雙鏈DNA,是單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，是單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物的RNA，包含DNA和RNA的雜合分子，其中的DNA和RNA可以是單鏈的，或者更一般而言是雙鏈的，或是單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。另外，"寡核苦酸，，還指包含RNA或DNA或既含RNA又含DNA的三鏈區(qū)。此外，寡核苷酸也可以是合成的、基因組的或重組的，例如X-DNA、粘粒DNA、人工細(xì)菌染色體、酵母人工染色體和絲狀噬菌體，如M13。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸是合成寡核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"也包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA，和為了穩(wěn)定性或其它原因而含有修飾骨架的DNA或RNA。例如，合適的核苷酸修飾/類似物包括肽核酸、肌苷、三苯曱基堿基、硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、5-硝基吲哚脫氧呋喃核糖基、5-甲基脫氧月包嘧啶和5,6-二氫-5,6-二羥基脫氧胸苷。已經(jīng)對DNA和RNA進(jìn)行了多種修飾；因此，"寡核苷酸"包括在自然界中常見的多核苷酸的化學(xué)、酶或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞特有的DNA和RNA的化學(xué)形式。其它核苷酸類似物/修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。包裝如此處所用的術(shù)語"包裝"是指免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，與VLP有關(guān)的狀態(tài)。如此處所用的術(shù)語"包裝"包括結(jié)合，其可以是共價的，例如化學(xué)偶聯(lián)，或者是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。共價鍵可以是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亞胺、碳-硫鍵如硫醚鍵、碳-磷鍵等。該術(shù)語也包括物質(zhì)的包封或部分包封。術(shù)語"包裝"包括如"偶聯(lián)"、"包封"和"附著"等術(shù)語。32例如，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苦酸可以被VLP包封，而不需存在實際上的結(jié)合，不管是共價的還是非共價的。具體而言，在優(yōu)選實施方案中，如果免疫刺激性核酸是免疫刺激物，則術(shù)語"包裝"是指處于包裝狀態(tài)的免疫刺激性核酸不能被DNase或RNase水解。在優(yōu)選實施方案中，免疫刺激性核酸包裝于VLP衣殼內(nèi)，最優(yōu)選地以非共價方式包裝。本發(fā)明的組合物可選地可以與藥學(xué)可4妄受的載體組合。如此處所用的術(shù)語"藥學(xué)可接受的載體"是指適于對人或其它動物施用的一種或多種相容的固體或液體填料、稀釋劑或封裝物。術(shù)語"載體"是指天然或合成的有機或無機成分，活性成分與之結(jié)合而利于應(yīng)用。肽如此處所用的術(shù)語"肽"，特別是對于人黑素瘤MelanA肽或正常人MelanA肽來說，是指由單體(氨基酸)通過酰胺鍵(也被稱為肽鍵)通常且優(yōu)選地線性連接組成的分子。它是指氨基酸分子鏈，而不是指特定長度的產(chǎn)物。有機分子如此處所用的術(shù)語"有機分子，，是指天然或合成來源的任何化學(xué)實體。具體而言，如此處所用的術(shù)語"有機分子，，包括例如選自下列的任何一種分子天然或合成來源的核苷酸、脂類、碳水化合物、多糖、脂多糖、類固醇、生物堿、辟和脂肪酸。術(shù)語"有機分子"具體包括諸如煙堿、可卡因、海洛因的分子或濫用藥品中所含的其它藥理學(xué)活性分子。有機分子通常含有或經(jīng)修飾后含有使它能夠與根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒偶聯(lián)、結(jié)合或以其它方法附著的化學(xué)官能團(tuán)。多肽如此處所用的術(shù)語"多肽"是指由單體(氨基酸)通過酰胺鍵(也被稱為肽鍵)線性連接組成的分子，是指氨基酸分子鏈，而不是指特定長度的產(chǎn)物。因此，多肽的定義內(nèi)包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。該術(shù)語也指多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。重組或衍生的多肽不一定由指定的核酸序列翻譯而來。也可以用任何方法產(chǎn)生，包括化學(xué)合成。"增強"免疫應(yīng)答的物質(zhì)是指這樣一種物質(zhì)與不添加該物質(zhì)時測得的同一免疫應(yīng)答相比，添加該物質(zhì)時觀察到更高或增強或偏離的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，"增強"免疫應(yīng)答的物質(zhì)在此是指(i)與不添加該物質(zhì)時測得的MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的頻率相比，MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的頻率提高的物質(zhì)，或(ii)與不添加該物質(zhì)時測得的MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的功能性相比，MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的功能性偏離，優(yōu)選提高的物質(zhì)，或(iii)與不添加該物質(zhì)時測得的MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的增殖、凋亡或?qū)δ[瘤組織的尋耙(homing)相比，MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的表型偏離，例如產(chǎn)生的T細(xì)胞能夠提高增殖、減少凋亡或更有效;也對肺瘤組織尋革巴的物質(zhì)。MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤體或多聚體染色來測定，優(yōu)選如Speiser,DE.etal.EurJImmunol.2002Vol.32,731-741所述的四聚體染色，而MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的功能性通過細(xì)胞因子釋放來測定，如細(xì)胞內(nèi)染色、細(xì)胞因子捕獲測定、Elispot、ELISA,優(yōu)選如Speiser,DE.etal.EurJImmunol.2002,Vol.32,731-741所述的Elispot。而且，MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的功能性也可以通過在如Valmori，D.etal.J.Immunol.1998,161，6956-6962所述的鉻或銪釋放試驗中測定MelanA-特異的，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異的或人黑素瘤MelanA肽類似物特異的溶細(xì)胞性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答來測定。MelanA-特異性，優(yōu)選地天然人MelanA肽特異性或人黑素瘤MelanA肽類似物特異性T細(xì)胞的表型利用針對諸如細(xì)胞激活標(biāo)記、細(xì)胞分化標(biāo)記、尋靶標(biāo)記、趨化因子和細(xì)胞因子受體、共刺激受體、死亡受體、殺傷激活或抑制受體、整聯(lián)蛋白等細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗體、抗凋亡蛋白的表達(dá)和衰老標(biāo)記的缺乏來測定，優(yōu)選利用如Speiser，DE.etal.EurJImmunol.2002,Vol.32,731-741所述的細(xì)月包激活標(biāo)i己。有效量如此處所用的術(shù)語"有效量"是指達(dá)到希望的生物學(xué)效應(yīng)所必需的量或足以達(dá)到希望的生物學(xué)效應(yīng)的量。組合物的有效量是能夠達(dá)到這種選擇的結(jié)果的量，此含量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)確定。例如，治療免疫系統(tǒng)缺陷的有效量是引起免疫系統(tǒng)激活、從而在接觸抗原后產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答所必需的量。該術(shù)語也與"足量"同義。用于任何特定用途的有效量可能根據(jù)如下因素而變化所治療的疾病或狀況、施用的具體組合物、患者個頭和/或疾病或狀況的嚴(yán)重程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)經(jīng)驗確定本發(fā)明的具體組合物的有效量，而不需要過多的實驗。自身抗原如此處所用的術(shù)語"自身抗原"是指由宿主基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)，宿主基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)生的產(chǎn)物被定義為自身的。優(yōu)選地，如此處所用的術(shù)語"自身抗原，，是指人基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)，人基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)生的產(chǎn)物被定義為自身的。本發(fā)明的含有自身抗原的組合物、藥物組合物和疫苗當(dāng)對宿主施用時尤其能夠打破對自身抗原的耐受。在上下文中，"打破對自身抗原的耐受"是指當(dāng)對宿主施用本發(fā)明的含有自身抗原的組合物、藥物組合物和疫苗時，如此處所定義的增強對自身抗原特異的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地增強B或T細(xì)胞應(yīng)答。另外，由兩種或幾種自身分子組合產(chǎn)生的或者代表自身分子一部分的蛋白質(zhì)，以及含有高度同源性(>95%,優(yōu)選>97%,更優(yōu)選>99%)的上述兩種自身分子的蛋白質(zhì)，也可以被認(rèn)為是自身的。治療(treatment):如此處所用的術(shù)語"治療"是指預(yù)防和/或治療。例如，當(dāng)用于傳染病時，該術(shù)語是指提高受試者對病原體感染的抗性，35或者換句話說，降低受試者感染病原體或表現(xiàn)感染所致病癥的可能性的預(yù)防性處理，以及患者感染后的抗感染治療，例如減輕或消除感染或阻止其惡化。疫苗如此處所用的術(shù)語"疫苗"是指含有本發(fā)明的組合物，并且是能夠?qū)游锸┯玫男问降闹苿?。一般而言，疫苗包含常用的鹽水或緩沖水溶液介質(zhì)，本發(fā)明的組合物懸浮或溶解于其中。以這種形式，本發(fā)明的組合物能夠方便地用來預(yù)防、改善或治療疾病。在導(dǎo)入宿主后，疫苗能夠引起免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹突細(xì)胞的激活和/或其它細(xì)胞應(yīng)答?？蛇x地，本發(fā)明的疫苗還包含佐劑，與本發(fā)明的化合物相比，佐劑可能占一小部分或大部分。如此處所用的術(shù)語"佐劑"是指免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產(chǎn)生一種儲存站(depot)的物質(zhì)，與本發(fā)明的疫苗組合時能夠產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答。有多種佐劑可以使用。實例包括弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁和修飾的胞壁酰二肽。如此處所用的術(shù)語"佐劑"也指通常特異性的免疫應(yīng)答刺激劑，當(dāng)與本發(fā)明的疫苗組合時能夠產(chǎn)生更強且通常特異性的免疫應(yīng)答。實例包括但不限于GM-CSF、IL-2、IL-12、IFNa。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道更多的例子。病毒樣顆粒如此處所用時的術(shù)語"病毒樣顆粒"是指類似于病毒顆粒但是未證明其具有致病性的結(jié)構(gòu)。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒不攜帶編碼病毒樣顆粒蛋白質(zhì)的遺傳信息。病毒樣顆粒通常缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。病毒樣顆粒通常也能通過異源表達(dá)大量生產(chǎn)，且易于純化。某些病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核酸。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復(fù)制性和非感染性的，因為它缺乏病毒基因組的全部或一部分，特別是病毒基因組的復(fù)制性和傳染性部分。根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核酸。根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒的一個典型且優(yōu)選的實施方案是病毒衣殼，如相應(yīng)病毒、噬菌體或RNA-噬菌體的病毒衣殼。術(shù)語"病毒衣殼，，或"衣殼，，在此可以互換使用，是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體。一般且優(yōu)選地，病毒蛋白質(zhì)亞單位分別裝配為病毒衣殼和衣殼，它具有固有重復(fù)組織的結(jié)構(gòu)，其中這種結(jié)構(gòu)一般是球形或管狀。例如，RNA-噬菌體或HBcAg的衣殼是二十面體對稱的球形。如此處所用的術(shù)語"衣殼樣結(jié)構(gòu)，，是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體，它類似于如上所述的衣殼形態(tài)，但是不同于典型的對稱裝配體，而保持足夠程度的秩序和重復(fù)性。噬菌體的病毒樣顆粒如此處所用的術(shù)語"噬菌體的病毒樣顆粒"是指類似于噬菌體結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒，它是非復(fù)制性和非感染性的，至少缺乏編碼噬菌體復(fù)制機制的基因，一般也缺乏編碼負(fù)責(zé)病毒附著于或進(jìn)入宿主的蛋白質(zhì)的基因。然而，該定義也應(yīng)當(dāng)包括其中上述基因仍然存在但是無活性的噬菌體病毒樣顆粒，于是也產(chǎn)生非復(fù)制性和非感染性的噬菌體病毒樣顆粒。RNA噬菌體外殼蛋白的VLP:由RNA噬菌體外殼蛋白的180個亞單位自裝配而成、可選地含有宿主RNA的衣殼結(jié)構(gòu)，被稱為"RNA噬菌體外殼蛋白的VLP"。一個具體例子是Qf3外殼蛋白的VLP。在此具體情況中，QP外殼蛋白的VLP可能僅僅由QPCP亞單位(SEQID:NoIO)裝配而成，該Q(3CP亞單位通過表達(dá)含有如TAA終止密碼子的Q(3CP基因產(chǎn)生，該終止密碼子通過抑制阻止較長Al蛋白的表達(dá)，參見Kozlovska,T.M.etal"Intervirology39:9-15(1996))，或者在衣殼裝配體中還含有Al蛋白亞單位(SEQID:No11)。通讀過程效率低，導(dǎo)致在VLP中只有極少量的Al蛋白。曾經(jīng)用包裝的ISS和偶聯(lián)的抗原的不同組合進(jìn)行了大量實施例。當(dāng)使用僅由Q(3CP亞單位裝配成的QP外殼蛋白的VLP或在衣殼中還含有Al蛋白亞單位的QP外殼蛋白的VLP時，未觀察到偶聯(lián)效率和包裝的差異。而且，也未觀察到這些QPVLP制劑之間有免疫應(yīng)答的差異。因此，為了清楚起見，在實施例描述中，術(shù)語"QPVLP，，用于僅由Q|3CP亞單位裝配成的Q(3外殼蛋白的VLP或在衣殼中還含有Al蛋白亞單位的Q(3外殼蛋白的VLP。如此處所用的術(shù)語"病毒顆粒"是指病毒的形態(tài)學(xué)形狀。某些病毒類型含有被蛋白質(zhì)衣殼圍繞的基因組；其它一些具有附加結(jié)構(gòu)(例如37無包膜病毒顆粒由圍繞并保護(hù)病毒基因組的蛋白質(zhì)衣殼組成。包膜病毒也具有圍繞病毒遺傳物質(zhì)的衣殼結(jié)構(gòu)，另外還有圍繞該衣殼的脂雙層包膜。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，VLP沒有脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，VLP完全不含包膜。一種術(shù)語"一種"在本公開內(nèi)容中使用時，除非另外說明，是指"至少一種"或"一種或一種以上"。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，本發(fā)明的某些實施方案涉及重組核酸技術(shù)的應(yīng)用，如克隆、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA和RNA的純化、重組蛋白在原核和真核細(xì)胞中的表達(dá)等。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，在出版的實驗室方法手冊中常見(例如，Sambrook，J.etal.,eds.,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,2nd.edition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHabor,N.Y.(1989);A應(yīng)bel,F.etal.，eds.，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnH.Wiley&Sons,Inc.(1997))。應(yīng)用組織培養(yǎng)細(xì)胞系進(jìn)行的基本實驗室技術(shù)(Celis，J.，ed.,CELLBIOLOGY,AcademicPress,2ndedition,(1998))和基于抗體的技術(shù)(Harlow,E.andLane,D.,"Antibodies:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHabor，N.Y.(1988);Deutscher,M.P.,"GuidetoProteinPurification,"Meth.Enzymol.128，AcademicPressSanDiego(1990);Scopes,R.K.,"ProteinPurificationPrinciplesandPractice,"3rded.,Springer-Verlag,NewYork(1994))在文獻(xiàn)中也有大量描述，這些文獻(xiàn)均在此引用作為參考。2.增強免疫應(yīng)答的組合物和方法本發(fā)明提供增強動物對一種或多種抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含、或者基本由、或者由下列成分組成病毒樣顆粒，至少一種免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，更優(yōu)選含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一種抗原或抗原決定簇，其中該免疫刺激物、免疫刺激性核酸或寡核苷酸與該病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。而且，本發(fā)明能夠使技術(shù)人員方便地構(gòu)建這種組合物，以用于多種治療和/或預(yù)防目的，包括例如癌癥的預(yù)防和/或治療。本申請書中的病毒樣顆粒是指類似于病毒顆粒但是沒有致病性的結(jié)構(gòu)。病毒樣顆粒通常缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。另夕卜，病毒樣顆粒也能夠通過異源表達(dá)大量產(chǎn)生，并且易于純化。在一個優(yōu)選實施方案中，所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用重組DNA技術(shù)和可公開獲得的病毒編碼序列制備VLP。例如，為了使用可購得的桿狀病毒載體在桿狀病毒表達(dá)載體中表達(dá)，可以將病毒包膜或核心蛋白的編碼序列構(gòu)建在病毒啟動子的調(diào)節(jié)控制下，并對序列進(jìn)行適當(dāng)修飾，以使編碼序列與調(diào)節(jié)序列功能連接。例如，也可以為了在細(xì)菌表達(dá)載體中表達(dá)而構(gòu)建病毒包膜或核心蛋白的編碼序列。VLP的例子包括但不限于乙型肝炎病毒、麻瘆病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、諾瓦克病毒的衣殼蛋白，逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl，乙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、人多瘤病毒、BK病毒(BKV)、RNA噬菌體、Ty、fr-噬菌體、GA-噬菌體、AP205-噬菌體、特別是Q(3-噬菌體的表面蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的VLP不限于任何一種具體形式。該顆粒能夠化學(xué)合成或通過生物學(xué)方法制備，可以是天然的或非天然的。例如，這種實施方案包括病毒樣顆粒或其重組形式。在一個更特別的實施方案中，VLP可以包含或者由下列成分組成輪狀病毒的重組多肽；諾瓦克病毒的重組多肽；曱病毒的重組多肽；可形成細(xì)菌菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的重組蛋白；口蹄疫病毒的重組多肽；麻滲病毒的重組多肽；辛德畢斯病毒的重組多肽；逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組多肽；乙型肝炎病毒的重組多肽(例如HBcAg);煙草花葉病毒的重組多肽；禽獸棚病毒的重組多肽；人乳頭瘤病毒的重組多肽；多瘤病毒的重組多肽，特別是人多瘤病毒的重組多肽，特別是BK病毒的重組多肽；噬菌體的重組多肽，RNA噬菌體的重組多肽；Ty的重組多肽；fr-噬菌體的重組多肽，GA-噬菌體的重組多肽，AP205-噬菌體的重組多肽，特別是QP-噬菌體的重組多肽。該病毒樣顆粒還可以包含或者由這些多肽的一個或多個片段以及這些多肽的變體組成。多肽的變體與其野生型對應(yīng)物在氨基酸水平上可以例如至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同。在一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由、或者由RNA-噬菌體的重組蛋白或其片段組成。優(yōu)選地，RNA-噬菌體選自a)噬菌體Q(3;b)噬菌體R17;c)噬菌體fr;d)噬菌體GA;e)噬菌體SP;f)噬菌體MS2;g)噬菌體Mll;h)噬菌體MX1;i)噬菌體NL95;k)噬菌體f2;1)噬菌體PP7;和m)噬菌體AP205。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA-噬菌體Q卩或RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，重組蛋白包含、或基本由、或由RNA噬菌體的外殼蛋白組成。因此，形成衣殼或VLP的RNA-噬菌體外殼蛋白，或者適于自裝配為衣殼或VLP的噬菌體外殼蛋白的片段，是本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。例如，噬菌體Q(3外殼蛋白能夠在大腸桿菌中重組表達(dá)。而且，這些蛋白質(zhì)在表達(dá)后自發(fā)構(gòu)成衣殼。另外，這些衣殼也能形成具有固有重復(fù)組織的結(jié)構(gòu)。能夠用來制備本發(fā)明的組合物的噬菌體外殼蛋白的具體優(yōu)選實例包括如下RNA噬菌體的外殼蛋白噬菌體QP(SEQIDNO:10;PIR數(shù)據(jù)庫，登錄號VCBPQ(3,指Q(3CP，和SEQIDNO:11;登錄號AAA16663,指Q(3A1蛋白)，噬菌體R17(PIR登錄號VCBPR7)，噬菌體fr(SEQIDNO:13;PIR登錄號VCBPFR),噬菌體GA(SEQIDNO:14;GenBank登錄號NP-040754),噬菌體SP(GenBank登錄號CAA30374,指SPCP,和登錄號NP—695026,指SPA1蛋白)，噬菌體MS2(PIR登錄號VCBPM2),噬菌體Mil(GenBank登錄號AAC06250),噬菌體MX1(GenBank登錄號AAC14699)，謹(jǐn)菌體NL95(GenBank登錄號AAC14704),噬菌體f2(GenBank登錄號P03611),噬菌體PP7(SEQIDNO:19)和噬菌體AP205(SEQIDNO:31)。此外，噬菌體Qp的Al蛋白或從C端丟失多達(dá)100、150或180個氨基酸的C端截短形式也可以摻入到QP外殼蛋白的衣殼裝配體中。為了確保衣殼形成，衣殼裝配體中QPAl蛋白相對于Q|3CP的百分比通常受到限制。噬菌體外殼蛋白的其它一些具體實例在WO02/056905的第45和46頁有描述，該專利在此引用作為參考。RNA噬菌體，特別是本發(fā)明的QP的進(jìn)一步優(yōu)選的病毒樣顆粒在WO02/056905中公開，該專利在此全文引用作為參考。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、基本由、或由RNA噬菌體的突變外殼蛋白、優(yōu)選上述RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成。在另一個優(yōu)選實施方案中，RNA噬菌體的突變外殼蛋白已通過置換除去至少一個賴氨酸殘基、或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾；此外，RNA噬菌體的突變外殼蛋白也可以通過刪除至少一個賴氨酸殘基、或通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而修飾。至少一個賴氨酸殘基的缺失、置換或添加能夠改變偶聯(lián)的程度，即RNA噬菌體VLP每個亞單位上的人黑素瘤MelanA肽類似物的量，以匹配并適應(yīng)疫苗的需要。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，每個亞單位上平均有至少1.0個人黑素瘤MelanA肽類似物與RNA噬菌體的VLP連接。該值計算為RNA噬菌體VLP的所有亞單位或單體的平均值。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2.0個人黑素瘤MelanA肽類似物與RNA噬菌體的VLP連接，計算為RNA噬菌體VLP的所有亞單位或單體的偶聯(lián)平均值。在另一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體Qj3的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、或基本由、或由下列成分組成具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的外殼蛋白，或具有SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的氨基酸序列的外殼蛋白的混合物，或SEQIDNO:11的突變體，其中N端甲硫氨酸優(yōu)選地纟皮切除。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由、或由QP的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、或基本由、或由突變QP外殼蛋白組成。在另一個優(yōu)選實施方案中，這些突變外殼蛋白通過置換去除至少一個賴氨酸殘基或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而^皮修飾。此外，這些突變外殼蛋白也可以通過刪除至少一個賴氨酸殘基或通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾。有4個賴氨酸殘基暴露于QP外殼蛋白的衣殼表面。本發(fā)明也可以使用以精氨酸置換暴露賴氨酸殘基的Q|3突變體。因此在本發(fā)明的實施中可以-使用下列Q|3外殼蛋白突變體和突變QPVLP:"Qp-240"(Lysl3-Arg;SEQIDNO:20),"Q(3-243"(Asn10-Lys;SEQIDNO:21)，"QP陽250"(Lys2-Arg,Lysl3-Arg;SEQIDNO:22),"QP-251"(SEQIDNO:23)和"QP-259"(Lys2國Arg,Lysl6-Arg;SEQIDNO:24)。因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由、或由突變Q|3外殼蛋白的重組蛋白組成，包括具有選自下列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)a)SEQIDNO:20的氨基酸序列；b)SEQIDNO:21的氨基酸序列；c)SEQIDNO:22的氨基酸序列；d)SEQIDNO:23的氨基酸序列；e)SEQIDNO:24的氨基酸序列。上述Q(3外殼蛋白、突變Q(3外殼蛋白VLP和衣殼的構(gòu)建、表達(dá)和純化分別在WO02/056905中公開。具體參照上述申請的實施例18。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由Q(3的重組蛋白或其片段組成，其中該重組蛋白包含、基本由、或由上述Q(3突變體之一和相應(yīng)Al蛋白的混合物組成。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或42基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。AP205基因組由成熟蛋白、外殼蛋白、復(fù)制酶和在有關(guān)噬菌體中不存在的兩個開放閱讀框組成；一種裂解基因和開放閱讀框在成熟基因的翻譯中起作用(Klovins,J.,etal.，J.Gen.Virol.83:1523-33(2002》。AP205外殼蛋白能夠由質(zhì)粒pAP283-58(SEQIDNO:30)表達(dá)，該質(zhì)粒是pQblO(Kozlovska,T.M.,etal.,Gene137:133-37(1993))的衍生物，含有一個AP205核糖體結(jié)合位點。此外，也可以將AP205外殼蛋白克隆到pQbl85內(nèi)，使之位于載體中核糖體結(jié)合位點的下游。這兩種方法都導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)和衣殼的形成，如WO04/007538所述，在此完整引用作為參考。載體pQb10和pQbl85是由pGEM載體衍生的載體，克隆的基因在這些載體中的表達(dá)受trp啟動子控制(Kozlovska,T.M.,etal.,Gene137:133-37(1993))。質(zhì)粒pAP283-58(SEQIDNO:30)在如下序列中包含一個推斷的AP205核糖體結(jié)合位點，該序列位于AP205外殼蛋白的Xbal位點下游和ATG起始密碼子的直接上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT^MaAAAATCACatg(SEQIDNO:30的堿基77-133)。載體pQbl85在Xbal位點下游和起始密碼子上游包含一個SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQIDNO:61),SD序列以下劃線標(biāo)出)。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段組成。本發(fā)明的這一優(yōu)選實施方案因而包含可構(gòu)成衣殼的AP205外殼蛋白。這些蛋白質(zhì)是重組表達(dá)的或是從天然來源制備的。電子顯微鏡檢查(EM)和免疫擴散證實，在細(xì)菌中產(chǎn)生的AP205外殼蛋白自發(fā)形成衣殼。在EM中可見，AP205外殼蛋白(SEQIDNO:31)形成的衣殼與AP205RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼的結(jié)構(gòu)特征幾乎無法辨別。AP205VLP具有高度免疫原性，能夠與抗原和/或抗原決定簇連接，而產(chǎn)生以重復(fù)方式定向展示抗原和/或抗原決定簇的疫苗構(gòu)建體。能夠產(chǎn)生針對這樣展示的抗原的高滴度，這表明結(jié)合的抗原和/或抗原43決定簇能夠與抗體分子相互作用，并且具有免疫原性。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段組成。AP205VLP的可裝配突變形式，包括氨基酸5處的脯氨酸被置換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白(SEQIDNO:32),也可以在本發(fā)明的實施中使用，并且產(chǎn)生本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。這些VLP、來自天然來源的AP205VLP或AP205病毒顆粒可以與抗原結(jié)合，而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的有序且重復(fù)的抗原陣列。AP205P5-T突變外殼蛋白能夠由質(zhì)粒pAP281-32(SEQIDNO:33)表達(dá)，該質(zhì)粒由pQbl85直4妄衍生而來，其中含有突變AP205外殼蛋白基因代替Q(3外殼蛋白基因。用表達(dá)AP205外殼蛋白的載體轉(zhuǎn)染用來表達(dá)AP205外殼蛋白的大腸桿菌。分別表達(dá)外殼蛋白和突變外殼蛋白、導(dǎo)致自裝配為VLP的方法在WO04/007538中描述，在此完整引用作為參考。合適的大腸桿菌抹包括但不限于大腸桿菌K802、JM109、RR1。合適的載體和菌抹及其組合可以通過如下方法確定通過SDS-PAGE分別檢測外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達(dá)，并且可選地首先通過凝膠過濾純化衣殼，隨后通過免疫擴散試驗(Ouchterlony試驗)或電子顯微鏡檢查(Kozlovska，T.M.etal.，Gene137:133-137(1993))對其進(jìn)行檢測，來檢測衣殼的形成和裝配。由載體pAP283-58和pAP281-32表達(dá)的AP205外殼蛋白由于在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中加工，可能缺乏起始甲硫氨酸。AP205VLP的切割、未切割形式或其混合物是本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段和RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段的混合物組成。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或重組突變外殼蛋白的片段組成。在本發(fā)明的實施中也可以使用能夠分別裝配為VLP和衣殼的重組AP205外殼蛋白片段?？梢酝ㄟ^內(nèi)部刪除或分別在外殼蛋白和突變外殼蛋白的末端刪除而產(chǎn)生這些片段。向外殼蛋白和突變外殼蛋白序列中插入抗原序列或抗原序列與外殼蛋白和突變外殼蛋白序列融合(與VLP裝配相容)，是本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案，分別產(chǎn)生嵌合AP205外殼蛋白和顆粒。插入、缺失以及與外殼蛋白序列融合的結(jié)果，以及是否與VLP裝配相容，能夠通過電子顯微鏡檢查來確定。由上述AP205外殼蛋白、外殼蛋白片段和嵌合外殼蛋白形成的顆粒能夠分離為純化形式，分離方法是組合使用通過沉淀的分級分離步驟和通過凝月交過濾的純化步驟，例如使用SepharoseCL-4B、SepharoseCL-2B、SepharoseCL-6B柱及其組合，如WO04/007538所述，在此完整引用作為參考。分離病毒樣顆粒的其它方法在本領(lǐng)域公知，可以用來分離噬菌體AP205的病毒樣顆粒(VLP)。例如，美國專利No.4,918，166描述了利用超速離心分離酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty的VLP,在此完整引用作為參考。幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)測，(Golmohammadi,R.etal.,Structure4:543-554(1996))。利用這些信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地鑒定表面暴露的殘基，從而能夠修飾噬菌體外殼蛋白，使得能夠插入一個或多個反應(yīng)性氨基酸殘基。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地產(chǎn)生并鑒定能夠在本發(fā)明實施中使用的噬菌體包被蛋白的修飾形式。因此，也可以用形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)變體(例如噬菌體QP、噬菌體R17、噬菌體fr、噬菌體GA、噬菌體SP和噬菌體MS2的外殼蛋白)制備本發(fā)明的組合物和疫苗組合物。WO02/056905在第50頁第33行到第52頁第29行描述了修飾的RNA噬菌體以及形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)變體和N端和C端截短突變體的其它可的方法。因此，本發(fā)明包括由可形成衣殼或VLP的蛋白質(zhì)制備的組合物和疫苗組合物，由各種蛋白質(zhì)亞單位和VLP或衣殼制備這些組合物的方法，制備這些蛋白質(zhì)亞單位的方法，編碼這些亞單位的核酸分子，和利用本發(fā)明的這些組合物接種和/或在個體中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，VLP缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，VLP完全不含包膜。缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜，特別是完全缺少包膜，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和組成更加明確的病毒樣顆粒。這些更加明確的病毒樣顆粒可以使副作用減至最小。而且，缺少含脂蛋白的包膜，或者特別是完全缺少包膜，使得病毒樣顆粒內(nèi)摻入潛在毒性分子和熱原的可能性消失或減至最小。在一個實施方案中，本發(fā)明提供含有病毒樣顆粒的本發(fā)明的疫苗組合物，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。優(yōu)選地，該病毒樣顆粒包含、或基本由、或由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段，優(yōu)選RNA噬菌體外殼蛋白組成。此外，本發(fā)明的疫苗組合物的病毒樣顆粒的重組蛋白包含、或基本由、或者由RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中該RNA噬菌體選自(a)噬菌體Q(3;(b)噬菌體R17;(c)噬菌體fr;(d)噬菌體GA;(e)噬菌體SP;(f)噬菌體MS2;(g)謹(jǐn)菌體M11;(h)噬菌體MXl;(i)噬菌體NL95;(k)噬菌體f2;(l)噬菌體PP7;和(m)噬菌體AP205。在一個優(yōu)選實施方案中，所述RNA噬菌體的突變外殼蛋白已經(jīng)通過除去、或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述RNA噬菌體的突變外殼蛋白已通過刪除至少一個賴氨酸殘基、或通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而修飾。在一個優(yōu)選實施方案中，該病毒樣顆粒包含RNA噬菌體QP、RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白或其片段。如前所述，本發(fā)明包括病毒樣顆?；蚱渲亟M形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何制備這些顆粒并將其與抗原附著。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案在實施例部分描述。在一個實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由、或由BK病毒(BKV)的重組蛋白或其片段組成，其中所述重組蛋白包含、或基本由、或由具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的蛋白質(zhì)組成。BK病毒(BKV)是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，屬于乳多空病毒科多瘤病毒亞科。VP1是BKV的主要的衣殼蛋白。VP1含有362個氨基酸(SEQIDNO:12,GeneBank登錄號AAA46882),大小為42kDa。當(dāng)在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞或酵母中產(chǎn)生時，VP1自發(fā)形成衣殼結(jié)構(gòu)(SalunkeD.M.，etal.,Cell46(6):895-904(1986);Sasnauskas，K.,etal.,Biol.Chem.380(3):381-6(1999);Sas廳skas，K.,etal.，3rdInternationalWorkshop"Virus-likeparticlesasvaccines"Berlin,September26-29(2001);Touze,A"etal.，JGenVirol.82(Pt12):3005-9(2001)。該衣殼被組織為72VP1五聚體，形成二十面體結(jié)構(gòu)。衣殼的直徑約為45nm。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物中使用的顆粒由修飾后除去或減少了游離半胱氨酸殘基數(shù)量的乙型肝炎衣殼(核心)蛋白(HBcAg)或HBcAg片段構(gòu)成。Zhou等人(J.Virol.66:5393-5398(1992))證實，修飾后除去天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg保留結(jié)合并形成多聚體結(jié)構(gòu)的能力。因此，適于在本發(fā)明的組合物中使用的核心顆粒包括那些包含修飾HBcAg或其片段的顆粒，其中一個或多個天然存在的半胱氨酸殘基已被刪除或被替換為另一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。HBcAg是通過加工乙型肝炎核心抗原前體蛋白產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。HBcAg的一些同種型已經(jīng)被鑒定，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地獲得其氨基酸序列。例如，具有SEQIDNO:16所示氨基酸序列的HBcAg蛋白長度為185個氨基酸，是通過加工212個氨基酸的乙型肝炎核心抗原前體蛋白而產(chǎn)生的。這種加工導(dǎo)致從乙型肝炎核心抗原前體蛋白的N端除去29個氨基酸。類似地，長度為185個氨基酸的HBcAg蛋白通過加工214個氨基酸的乙型肝炎核心抗原前體蛋白而產(chǎn)生。在優(yōu)選實施方案中，用HBcAg的加工形式(即已經(jīng)除去乙型肝炎核心抗原前體蛋白的N端前導(dǎo)序列的HBcAg)制備本發(fā)明的疫苗組合物。另夕卜，在不發(fā)生加工的條件下制備HBcAg時，HBcAg通常以"加47工的"形式表達(dá)。例如，細(xì)菌系統(tǒng)，如大腸桿菌，通常不會除去在真核細(xì)胞中正常表達(dá)的蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列，也被稱為"信號肽"。因此，當(dāng)利用將蛋白質(zhì)表達(dá)定向于細(xì)胞質(zhì)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生本發(fā)明的HBcAg時，這些蛋白質(zhì)通常表達(dá)為不含乙型肝炎核心抗原前體蛋白N端前導(dǎo)序列的形式?？捎糜诒景l(fā)明的乙型肝炎病毒樣顆粒的制備在下列專利中公開，例如WO00/32227、特別是其實施例17-19和21-24，以及WO01/85208、特別是其實施例17-19、21-24、31和41，和WO02/056905。最后一個申請中具體參照實施例23、24、31和51。全部這三篇文獻(xiàn)在此均明確引用作為參考。本發(fā)明也包括經(jīng)修飾后缺失或置換了一個或多個其它半胱氨酸殘基的HBcAg變體。因此，本發(fā)明的疫苗組合物包括包含如下HBcAg的組合物，其中SEQIDNO:16所示氨基酸序列中不含的半胱氨酸殘基已經(jīng);故刪除。本領(lǐng)域公知，游離半胱氨酸殘基可能參與一些化學(xué)副反應(yīng)。這些副反應(yīng)包括二硫交換，與例如在與其它物質(zhì)聯(lián)合治療中注射或形成的化學(xué)物質(zhì)或代謝物反應(yīng)，或暴露于紫外線后的直接氧化以及與核苷酸的反應(yīng)。因而可能產(chǎn)生毒性加合物，特別是考慮到HBcAg具有結(jié)合核酸的強烈傾向。毒性加合物將會以多種形式分布，它們單個可能以低濃度存在，但在一起時則達(dá)到毒性水平。如上所述，在疫苗組合物中使用經(jīng)修飾除去天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg的一個優(yōu)點是，當(dāng)抗原或抗原決定簇附著時，毒性物質(zhì)能夠結(jié)合的位點在數(shù)量上減少或者完全消失。適用于實施本發(fā)明的一些天然存在的HBcAg變體已經(jīng)^皮鑒定。例如，Yuan等人(J.Virol.73:10122-10128(1999))描述了在對應(yīng)于SEQIDNO:25位點97的位點處異亮氨酸殘基被置換為亮氨酸殘基或苯丙氨酸殘基的變體。一些HBcAg變體以及幾種乙型肝炎核心抗原前體變體的氨基酸序列公開于GenBank報告AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301(SEQIDNO:26)、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520(SEQIDNO:27)、P03153、AF110999和M95589,其公開內(nèi)容均在此引用作為參考。上述乙型肝炎核心抗原前體變體的序列進(jìn)一步7>開在WO01/85208中，申請WO01/85208的SEQIDNOs:89-138中。這些HBcAg變體在氨基酸序列的多個位點處不同，包括對應(yīng)于SEQIDNO:28中位點12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183處氨基酸殘基的氨基酸殘基。WO01/98333、WO00/177158和WO00/214478中描述了適于在本發(fā)明的組合物中使用、并且可以根據(jù)本說明書公開內(nèi)容進(jìn)一步修飾的其它HBcAg變體。適用于本發(fā)明的HBcAg可以來源于任何生物，只要它們能夠包封或偶聯(lián)或附著于、特別是能夠包裝含非曱基化CpG的寡核苷酸，并i秀發(fā)免疫應(yīng)答。如上所述，一般將加工的HbcAg(即缺乏前導(dǎo)序列的)用于本發(fā)明的疫苗組合物中。本發(fā)明包括使用上述變異HBcAg的疫苗組合物，以及應(yīng)用這些組合物的方法。本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)一步包括能夠連接形成二聚或多聚結(jié)構(gòu)的其它HBcAg變體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括如下疫苗組合物，其包含HBcAg多肽，該HBcAg多肽包含或由與任何一種野生型氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列組成，以及必要時加工除去N端前導(dǎo)序列的這些蛋白質(zhì)的形式。一種多肽的氨基酸序列是否具有與野生型氨基酸序列之一或其亞部分至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列，可以利用公知的計算才幾程序如Bestfit程序來常^見確定。當(dāng)利用Bestfit或其它任何序列比對程序來確定一種具體序列與參照氨基酸序列是否如95%相同時，參數(shù)設(shè)置為使得在參照氨基酸序列的全長上計算百分同一性，并且允許同源性缺口達(dá)參照序列中氨基酸殘基總數(shù)的5%。上述HBcAg變體和前體的氨基酸序列纟皮此相對相似。因此，HBcAg變體中位于對應(yīng)于SEQIDNO:28特定位點的位點處的氨基酸殘基，是指SEQIDNO:28所示氨基酸序列中該位點處的氨基酸殘基。在感染哺乳動物的乙型肝炎病毒之間，這些HBcAg變體之間的同源性絕大部分足夠高，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員不難檢查如SEQIDNO:28所示的氨基酸序列，以及特定HBcAg變體的氨基酸序列，并確定"相應(yīng)的"氨基酸殘基。此外，SEQIDNO:27所示HBcAg氨基酸序列，其顯示來源于感染土撥鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，與含有SEQIDNO:28所示氨基酸序列的HBcAg有足夠的同源性，顯然在SEQIDNO:27中，相當(dāng)于在SEQIDNO:28的氨基酸殘基155與156之間插入了3個氨基酸殘基。本發(fā)明也包括包含感染鳥類的乙型肝炎病毒HBcAg變體的疫苗組合物，以及包含這些HBcAg變體的片段的疫苗組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，在添加到本發(fā)明的疫苗組合物中之前，這些多肽中天然存在的1、2、3個或更多的半胱氨酸殘基可以被置換為另一種氨基酸殘基或者缺失。如上所述，去除游離半胱氨酸殘基減少了毒性成分能夠與HBcAg結(jié)合的位點數(shù)，也除去了該HBcAg或相鄰HBcAg分子的賴氨酸和半胱氨酸殘基交聯(lián)的位點。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，乙型肝炎病毒衣殼蛋白的一個或多個半胱氨酸殘基缺失或被替換為另一種氨基酸殘基。HBcAg-Lys變體的表達(dá)與純化在WO02/056905的實施例24中有描述，不含游離半胱氨酸殘基且含有插入的賴氨酸殘基的HBcAg的構(gòu)建在WO02/056905的實施例31中有描述。在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物和疫苗組合物分別含有已經(jīng)除去C端區(qū)(例如SEQIDNO:28的氨基酸殘基145-185或150-185)的HBcAg。適于在本發(fā)明的實施中使用的其它修飾HBcAg包括C端截短突變體。合適的截短突變體包括已經(jīng)從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35個氨基酸的HBcAg。適于在本發(fā)明的實施中使用的HBcAg還包括N端截短突變體。合適的截短突變體包括已經(jīng)從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸的修飾HBcAg。適于在本發(fā)明的實施中使用的HBcAg還包括N端和C端截短突變體。合適的截短突變體包括已經(jīng)從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸并且從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35個氨基酸的HBcAg。本發(fā)明還包括分別包含HBcAg多肽的組合物和疫苗組合物，該多肽包含、或基本由、或由與上述截短突變體至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的某些實施方案中，向HBcAg多肽內(nèi)引入賴氨酸殘基，以介導(dǎo)本發(fā)明的MelanA肽類似物與HBcAg的VLP的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，用一種HBcAg制備本發(fā)明的組合物，該HBcAg包含或由SEQIDNO:28的氨基酸1-144或1-149、1-185組成，對其進(jìn)行修飾使得對應(yīng)于位點79和80的氨基酸被置換為含Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽(SEQIDNO:18),產(chǎn)生含有SEQIDNO:29所示序列的HBcAg多肽。這些組合物尤其可用于抗原決定簇與HBcAg的VLP相偶聯(lián)的實施方案中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，SEQIDNO:28的位點48和107處的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸。本發(fā)明還包括包含相應(yīng)多肽的組合物，該多肽含有上述任何一種乙型肝炎核心抗原前體變體所示的氨基酸序列，還含有上述氨基酸改變。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括能夠連接形成衣殼或VLP并且含有上述氨基酸改變的其它HBcAg變體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括如下組合物和疫苗組合物，它們分別包含HBcAg多肽，該HBcAg多肽包含或由與任何一種野生型氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列組成，以及必要時加工除去N端前導(dǎo)序列和通過上述氨基酸改變51修飾的這些蛋白質(zhì)的變化形式。本發(fā)明的組合物或疫苗組合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由氨基酸序列不同的多種HBcAg組成。例如，可以制備包含"野生型"HBcAg和一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)改變(例如缺失、插入或置換)的修飾HBcAg的疫苗組合物。本發(fā)明優(yōu)選的疫苗組合物是呈現(xiàn)高度有序且重復(fù)的抗原陣列的組合物，其中所述抗原是人黑素瘤MelanA肽類似物。如上所述，本發(fā)明部分基于以下的意外發(fā)現(xiàn)免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，更優(yōu)選DNA寡核苷酸，或者poly(I:C),能夠包裝到VLP內(nèi)。出乎意料的是，VLP內(nèi)的核酸可被特異性地置換為免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，更優(yōu)選含有CpG基序或poly(I:C)的DNA-寡核香酸。例如，CpG-VLP比不含CpG的對應(yīng)物免疫原性更高、引發(fā)特異性更高的效應(yīng)，并且誘發(fā)增強的B和T細(xì)胞應(yīng)答。針對與VLP偶聯(lián)、融合或以其他方式附著的抗原的免疫應(yīng)答與針對VLP本身的免疫應(yīng)答相似地增強。另外，針對VLP和抗原兩者的T細(xì)胞應(yīng)答都特別集中在Thl型。而且，包裝的核酸和CpG分別受到保護(hù)而免遭降解，即它們更加穩(wěn)定。而且，來自先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的非特異性激活被大大降低。先天免疫系統(tǒng)能夠識別微生物病原體所共有的固定分子模式。最近的研究揭示，這種識別是誘發(fā)有效免疫應(yīng)答的一個關(guān)鍵步驟。微生物產(chǎn)物增強免疫應(yīng)答的主要機制是刺激APC,特別是樹突細(xì)胞，從而產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，并且表達(dá)高水平的T細(xì)胞共同刺激分子。這些激活的樹突細(xì)胞隨后啟動初次T細(xì)胞應(yīng)答，并且決定T細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)功能的類型。兩類核酸，即l)含有免疫刺激序列、特別是特定側(cè)翼堿基內(nèi)的非曱基化CpG二核苷酸(稱為CpG基序)的細(xì)菌DNA,2)由多種病毒類型合成的雙鏈RNA,是能增強免疫應(yīng)答的微生物成分的重要成員。合成雙鏈(ds)RNA，如聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyl:C),能夠誘導(dǎo)樹突細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子并表達(dá)高水平的共刺激分子。52Tokunaga和Yamamoto等人的一系列研究表明，細(xì)菌DNA或合成寡脫氧核苷酸誘導(dǎo)人PBMC和小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素(IFN)(Yamamotoetal.，SpringerSeminImmunopathol.22:11-19綜述)。最初合成PolyI:C作為I型IFN的一種強誘導(dǎo)劑，但它也能誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子如IL-12。優(yōu)選的核糖核酸包括聚肌苷酸-聚胞苷酸雙鏈RNA(polyI:C)。核糖核酸及其修飾及其制備方法在Levy,H.B.(MethodsEnzymol.1981,78:242-251)、DeClercq,E(MethodsEnzymol.1981，78:227-236)和To畫ce,P.F.(MethodsEnzymol1981;78:326-331)以及其中的參考文獻(xiàn)中有描述。進(jìn)一步優(yōu)選的核糖核酸包括肌苷酸和胞苷酸的多核苷酸，如兩條鏈形成雙鏈RNA的poly(IC)。核糖核酸可以乂人生物中分離。核糖核酸也包括其它合成核糖核酸，特別是合成的poly(I:C)寡核苷酸，它們通過磷酸二酯骨架的修飾、特別是通過硫代磷酸修飾而對核酸酶具有抗性。在另一個實施方案中，用脫氧核糖代替poly(I:C)的核糖骨架。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解合成寡核苷酸的合成方法。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，包括可激活toll樣受體(TLR)的分子。迄今為止已知10種人toll樣受體。它們被多種配體激活。TLR2被肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸和酵母聚糖和巨噬細(xì)胞活化脂肽MALP-2激活；TLR3被雙鏈RNA如poly(I:C)激活；TLR4被脂多糖、脂磷壁酸和紫杉醇和熱休克蛋白如熱休克蛋白HSP-60和Gp96激活；TLR5被纟田菌鞭毛、特別是鞭毛蛋白激活；TLR6被肽聚糖激活；TLR7被咪喹莫特和咪唑并喹啉化合物如R418、羅唑利賓和溴匹立明激活；TLR9被細(xì)菌DNA、特別是CpGDNA激活。TLR1、TLR8和TLR10的配體迄今為止還不清楚。然而，最近的報告表明，相同的受體能夠與不同的配體反應(yīng)，并且存在其它受體。以上所列配體并非窮舉，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它配體。優(yōu)選地，含非曱基化CpG的寡核苷酸包含序列5'X1X2CGX3X43',其中XI、X2、X3、X4是任意一種核苷酸。另外，該寡核苷酸可以包含約6個到約100,000個核香酸，優(yōu)選約6個到約2000個核普酸，更優(yōu)選約20個到約2000個核苷酸，更優(yōu)選地包含約20個到約300個核香酸。另外，該寡核香酸也可以包含超過100個到約2000個核苷酸，優(yōu)選超過100個到約1000個核苷酸，更優(yōu)選超過100個到約500個核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，含CpG的寡核苷酸在磷酸骨架上含有一個或多個硫代磷酸修飾。例如，本發(fā)明的范圍內(nèi)包括其中有一個或多個磷酸骨架修飾或者全部磷酸骨架都被修飾的含CpG的寡核香酸，以及其中一個、多個或全部核苷酸磷酸骨架修飾為硫代磷酸修飾的含CpG的寡核苷酸。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，核苷酸X1、X2、X3和X4至少之一含有磷酸骨架修飾。在本發(fā)明的另外一個非常優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:2);在此一般縮寫為G3-6),(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:3);在此一般縮寫為G4-6),(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:4);在此一般縮寫為G5-6),(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:5);在此一般縮寫為G6-6),(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQIDNO:6);在此一般縮寫為G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQIDNO:7);在此一般縮寫為G8-8),(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQIDNO:8);在此一般縮寫為G9-9),(h)此一般縮寫為G6),(i)tccatgacgttcctgaataat((SEQIDNO:34);在此一般縮寫為CyCpGpt),(j)TCCATGACGTTCCTGAATAAT((SEQIDNO:35);在此一般縮寫為CyCpG),(k)tccatgacgttcctgacgtt((SEQIDNO:36);在此一般縮寫為B畫CpGpt),(1)TCCATGACGTTCCTGACGTT((SEQIDNO:37);在此一般縮寫為B-CpG),(m)ggggtcaacgttgaggggg((SEQIDNO:38);在此一般縮寫為NKCpGpt),(n)GGGGTCAACGTTGAGGGGG((SEQIDNO:39);在此一4殳縮寫為NKCpG)，(o)attattcaggaacgtcatgga((SEQIDNO:40);在此一般縮寫為CyCpG-rev-pt),(p)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQIDNO:41);在此一般縮寫為gl0gacga-PO(GIO-PO))，(q)gggggggggggacgatcgtcgggggggggg((SEQIDNO:42》在此一般縮寫為glOgacga畫PS(G10-PS)),(r)CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT((SEQIDNO:43);在此一般縮寫為(CpG)20OpA),(s)TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCG((SEQIDNO:44);在此一般縮寫為Cy(CpG)20),(t)TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCATGTCAAAGACAGCAT((SEQIDNO:45);在此一^殳縮寫為Cy(CpG)20-OpA),(u)((SEQIDNO:46);在此一般縮寫為CyOpA),(v)CATGACGTTCCTGAATAAT((SEQIDNO:47);在此一4殳縮寫為CyCyCy)，(w)CATGACGTTTGAATAATT((SEQIDNO:48);在此一般縮寫為Cyl50-1),和(x)CTAGAACTAGTGGATCAAAATTCCAATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC(SEQIDNO:49),在此一般縮寫為dsCyCpG-253(互補鏈未示出)。上述SEQIDNO:34至SEQIDNO:49序列中的小寫字母表示通過硫代磷酸酯鍵連接的脫氧核苷酸，而大寫字母表示通過磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸。在本發(fā)明的再一個非常優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核香酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核香酸具有核酸序歹寸GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQIDNO:41);在此一4殳縮寫為gl0gacga-PO或GIO-PO)。含CpG的寡核苷酸也可以是重組的、基因組的、合成的、cDNA、質(zhì)粒衍生的和單《連或雙鏈的。為在本發(fā)明中應(yīng)用，可以利用本領(lǐng)域7^知的多種方法之一從頭合成核酸。例如，P-氰乙基亞磷酰胺法(Beaucage,S丄.andCaruthers，M.H.,Tet.Let.22:1859(1981);核苷H-磷酸法(Gareggetal"Tet.Let.27:4051-4054(1986);Froehleretal"Nucl.Acid.Res.14:5399-5407(1986);Gareggetal.,Tet.Let.27:4055-4058(1986);Gaffneyetal"Tet.Let.29:2619-2622(1988))。這些化學(xué)法可以用可購得的多種自動寡核香酸合成儀進(jìn)行。此外，CpG也可以在質(zhì)粒中大規(guī)4莫產(chǎn)生(參見Sambrook,T.etal.,《分子克隆實驗室手冊》，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989),它在對受試者施用后降解為寡核苷酸?？梢岳靡阎夹g(shù)，如使用限制性內(nèi)切酶、外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶，由現(xiàn)有的核酸序列(例如基因組或cDNA序列)制備寡核苷酸。免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非曱基化CpG的寡核苷酸，可以用本領(lǐng)域已知的任何一種方法與VLP結(jié)合，只要該組合物能夠增強動物中的免疫應(yīng)答。例如，寡核苷酸可以共價或非共價結(jié)合。另外，VLP也可以完全或部分地包封免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非曱基化CpG的寡核苷酸。優(yōu)選地，免疫刺激性核酸以及含非曱基化CpG的寡核苷酸能夠結(jié)合于VLP位點，如寡核香酸結(jié)合位點(天然或非天然存在的)、DNA結(jié)合位點或RNA結(jié)合位點。在另一個實施方案中，VLP位點包含富含精氨酸的重復(fù)序列或富含賴氨酸的重復(fù)序列。本發(fā)明組合物的一個具體用途是為了增強對抗原的特異性免疫應(yīng)答而激活樹突細(xì)胞?？梢杂秒x體(exvivo)或體內(nèi)技術(shù)增強免疫應(yīng)答。離體技術(shù)可以用于自體或異源細(xì)胞，但優(yōu)選地用于自體細(xì)胞。在優(yōu)選實施方案中，樹突細(xì)胞從外周血或骨髓中分離，但是也可以從任何樹突細(xì)胞來源中分離。為了癌癥免疫治療而對樹突細(xì)胞的離體操作在本領(lǐng)域的幾篇參考文獻(xiàn)中已有描述，包括Engleman,E.G.,Cytotechnology25:1(1997);VanSchooten，W.etal"MolecularMedicineToday,June,255(1997》Steinman,R.M.，ExperimentalHematology24:849(1996);Gluckman,J.C.,Cytokines,CellularandMolecularTherapy3:187(1997)。也可以利用體內(nèi)方法將樹突細(xì)胞接觸本發(fā)明的組合物。為了實現(xiàn)這一點，將CpG與可選地偶聯(lián)、融合或以其他方式附著到抗原上的VLP組合，直接給予需要免疫治療的患者。在一些實施方案中，優(yōu)選地在胂瘤局部區(qū)域施用VLP/CpG，這可以用本領(lǐng)域公知的任何一種方法來實現(xiàn)，例如直接向腫瘤內(nèi)注射。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是提供用于增強動物中的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或所述抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，并且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸，57其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1),并且其中所述回文序列在其3'端和5'端側(cè)翼為兩個以上、11個以下的鳥苷，或者更優(yōu)選8-10個鳥苷，或者最優(yōu)選10個鳥苷。我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的免疫刺激物，即含非曱基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1)，并且其中所述回文序列在其3'端和5'端側(cè)翼為兩個以上、11個以下的鳥苷，更優(yōu)選8-10個鳥苷，或者最優(yōu)選10個鳥苷，在體外刺激免疫細(xì)胞方面特別有效。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述回文序列是、或者包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQIDNO:l)組成，其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少3個、至多IO個鳥苷，并且所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥香。在另一個實施方案中，所述回文序列在其5，端側(cè)翼為至少3個、至多IO個鳥苷，并且所述回文序列在其3，端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:2);在此一般縮寫為G3-6),(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:3);在此一般縮寫為G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:4);在此一般縮寫為G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:5);在此一4殳縮寫為G6-6),(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQIDNO:6);在此一般縮寫為G7-7),(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQIDNO:7);在此一般縮寫為G8畫8)，⑧GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQIDNO:8);在此一般縮寫為G9-9)，(h)此一般縮寫為G6)，和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQIDNO:41);在此一般縮寫為G10-PO)。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核普酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1),并且其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少4個、至多IO個鳥苷，并且所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:3);在此一般縮寫為G4誦6)，(b)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:4);在此一般縮寫為G5-6),(c)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:5);在此一般縮寫為G6-6),(d)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQIDNO:6);在此一般縮寫為G7-7),(e)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQIDNO:7);在此一般縮寫為G8-8),(f)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQIDNO:8);在此一般縮寫為G9-9);和(g)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQIDNO:41);在此一般縮寫為GIO-PO)。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1),并且其中所述回文序列在其5'端側(cè)翼為至少5個、至多8個鳥苷，并且所述回文序列在其3'端側(cè)翼為至少6個、至多IO個鳥苷。實驗數(shù)據(jù)表明，對于本發(fā)明優(yōu)選的免疫刺激物，即側(cè)翼為鳥苷、含非甲基化CpG的回文寡核苷酸，其中該回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1),并且該回文序列在其3'端和5'端側(cè)為不到11個或不到IO個鳥苷，如果回文序列側(cè)翼的鳥苷較少，則更容易被包裝到VLP內(nèi)。然而，減少回文序列側(cè)翼的鳥苷數(shù)量會降低對血細(xì)胞的體外刺激。因此，可包裝性的代價是本發(fā)明所述免疫刺激物的生物活性降低。因此優(yōu)選實施方案是可包裝性與生物活性之間的折衷。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸具有選自下列的核酸序列(a)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:4),在此一般縮寫為G5-6);(b)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQIDNO:5),在此一般縮寫為G6-6);(c)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQIDNO:6)，在此一般縮寫為G7-7);(d)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQIDNO:7),在此一般縮寫為G8-8);和(e)在此一般縮寫為GIO-PO)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQIDNO:7的核酸序列，即該免疫刺激物是G8-8,或者具有SEQIDNO:41的核酸序列，即該免疫刺激物是G10-PO。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物是下述含非曱基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非曱基化CpG的寡核苷酸具有SEQIDNO:41的核酸序列，即該免疫刺激物是G10-PO。因此，60在一個非常優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種增強動物中免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，并且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述免疫刺激物是含非曱基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1),并且其中所述回文序列在其3'端和5'端側(cè)翼為10個鳥普。如上所述，用來包裝到VLP內(nèi)的最佳序列是可包裝性與生物活性之間的折衷?？紤]到這一點，G8-8免疫刺激物是優(yōu)選的，G10-PO免疫刺激物是本發(fā)明的非常優(yōu)選的實施方案，因為它們具有高度的生物活性，同時仍然可以相當(dāng)好i也被包裝。本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含與病毒樣顆粒結(jié)合的本發(fā)明的人黑素瘤MelanA肽類似物。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，至少一個MelanA肽類似物與該病毒樣顆粒融合。如上所述，VLP—4殳由至少一種可裝配為VLP的亞單位組成。因此，在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，MelanA肽類似物與病毒樣顆粒的或能夠摻入VLP內(nèi)的蛋白質(zhì)的至少一個亞單位融合，產(chǎn)生嵌合的VLP-亞單位-抗原融合體。MelanA肽類似物的融合可以如下實現(xiàn)插入VLP亞單位序列內(nèi)，或與VLP亞單位或能夠摻入VLP內(nèi)的蛋白質(zhì)的N端或C端融合。在下文中，當(dāng)提到肽與VLP亞單位的融合蛋白時，包括該肽與亞單位序列任一端的融合或向亞單位序列內(nèi)的內(nèi)部插入。也可以通過向VLP亞單位變體內(nèi)插入MelanA肽類似物序列實現(xiàn)融合，其中亞單位序列的一部分缺失，故被稱為截短突變體。截短突變體可以在N端或C端或內(nèi)部缺失VLP亞單位的部分序列。例如，氨基酸殘基79-81缺失的特定VLPHBcAg是含有內(nèi)部缺失的截短突變體。抗原或抗原決定簇與截短突變體VLP-亞單位的N端或C端的融合也產(chǎn)生本發(fā)明的實施方案。同樣，表位向VLP亞單位序列內(nèi)的融合也可以通過置換來實現(xiàn)，例如對于特定VLPHBcAg，用外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所說的融合可以如下實現(xiàn)向VLP亞單位的序列中插入MelanA肽類似物序列，用MelanA肽類似物置換VLP亞單位序列的一部分，或者利用缺失、置換或插入的組合。嵌合MelanA肽類似物-VLP亞單位通常能夠自裝配為VLP。展示與亞單位融合的表位的VLP在此也被稱為嵌合VLP。如上所述，病毒樣顆粒包含或者由至少一種VLP亞單位組成。在本發(fā)明的另一實施方案中，病毒樣顆粒包含或由嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位(即不與抗原融合的VLP亞單位)的混合物組成，產(chǎn)生所謂的鑲嵌顆粒。這可能有利于確保VLP的形成和裝配。在這些實施方案中，嵌合VLP-亞單位的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95%或更高。為了與VLP亞單位序列的任一端融合，或者為了向VLP亞單位序列內(nèi)部插入這種肽序列，可以向肽或表位序列的4壬一端添加側(cè)翼氨基酸殘基。在添加到待融合肽上的側(cè)翼序列中，甘氨酸和絲氨酸殘基是特別有用的氨基酸。甘氨酸殘基提供額外的柔性，這可降低外源序列與VLP亞單位序列融合中潛在的去穩(wěn)定作用。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，VLP是一種乙型肝炎核心抗原VLP。與HBcAgN端的融合蛋白(Neyrinck,S.etal.,NatureMed.5:1157-1163(1999))或向所謂的主要免疫顯性區(qū)(MIR)中的插入已經(jīng)有描述(Pumpens，P.andGrens，E.，Intervirology44:98-114(2001)，WO01/98333),也是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。在MIR中存在缺失的天然存在的HBcAg變體也已經(jīng)有描述(Pumpens，P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001)，在此完整引用作為參考)，與N端或C端的融合，以及與野生型HBcAg相比在對應(yīng)于缺失位點的MIR位點處的插入，也是本發(fā)明的實施方案。與C端的融合也已經(jīng)有描述(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001))。本領(lǐng)域4支術(shù)人員可以容易地找到如何利用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建融合蛋白的指南(Sambrook,J.etal.，eds.，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHabor,N.Y.(1989);Hoetal.,Gene77:51(1989))。編碼HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表達(dá)HBcAg和HBcAg融合蛋白的載體和質(zhì)粒已經(jīng)有描述(Pumpens,P.&Grens，E.,Intervirology44:98-114(2001),Neyrinck,S.etal.,NatureMed.5:1157-1163(1999))，可以在本發(fā)明的實施中使用。優(yōu)化自裝配效率和展示欲插入HBcAgMIR內(nèi)的表位的一個重要因素是插入位點的選擇，以及插入時將要從MIR內(nèi)HBcAg序列上刪除的氨基酸數(shù)量(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001);EP421635;U.S.6,231,864),或者換句話說，HBcAg的哪些氨基酸將被置換為新的表位。例如，已經(jīng)報道了用外源表位置換HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001);EP421635;US6,231,864)。HBcAg含有一個長精氨酸尾(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001))，該精氨酸尾不是衣殼裝配所必需的，并能夠結(jié)合核酸(Pumpens,P.andGrens，E.,Intervirology44:98-114(2001))。包含或缺乏該精氨酸尾的HBcAg都是本發(fā)明的實施方案。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP。RNA噬菌體的主要外殼蛋白在細(xì)菌、特別是在大腸桿菌中表達(dá)后自發(fā)裝配為VLP?？捎脕碇苽浔景l(fā)明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體例子包括諸如噬菌體Q(3(SEQIDNO:10,PIR數(shù)據(jù)庫，登錄號VCBPQ(3，指QPCP;和SEQIDNO:11,登錄號AAA16663,指QPAl蛋白)和噬菌體fr(SEQIDNO:13,PIR登錄號VCBPFR)的RNA噬菌體的外殼蛋白。在另一個優(yōu)選實施方案中，至少一個MelanA肽類似物與一個Q|3外殼蛋白融合。已經(jīng)描述了如下融合蛋白構(gòu)建體，其中表位與Q卩Al蛋白截短形式的C端融合，或插入Al蛋白內(nèi)(Kozlovska,T.M.etal.,Intervirology,39:9-15(1996))。Al蛋白是通過UGA終止密碼子處的抑制產(chǎn)生的，長度為329個氨基酸，或者如果考慮N端甲硫氨酸的切63除，為328個氨基酸。丙氨酸(Q(3CP基因編碼的第二個氨基酸)之前N端甲硫氨酸的切除在大腸桿菌中常常發(fā)生，QP外殼蛋白的N端就是如此。位于UGA琥珀密碼子3'方向的Al基因的一部分編碼長度為195個氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位點72與73之間插入至少一個MelanA肽類似物產(chǎn)生了本發(fā)明另外的實施方案(Kozlovska，T.M.etal.,Intervirology39:9-15(1996))。MelanA肽類似物在C端截短的Q|3Al蛋白C端處的融合產(chǎn)生了本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology39:9-15(1996))描述了表位在位點19處截短的QPCP延伸的C端處融合的QpAl蛋白融合。如Kozlovska等人(Intervirology39:9-15(1996))所述，展示融合表位的顆粒的裝配可能需要存在Al蛋白-MelanA-肽類似物融合蛋白和野生型CP，以形成鑲嵌顆粒。然而，本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括下述實施方案其包含4叉由與至少一個MelanA-肽類似物融合的VLP亞單位組成的病毒樣顆粒，特別是RNA噬菌體QP外殼蛋白的VLP。鑲嵌顆粒的制備可以用數(shù)種方法實現(xiàn)。Kozlovska,etal.,Intervirology39:9-15(1996)描述了3種方法，它們均可在本發(fā)明的實施中使用。第一種方法，通過在大腸桿菌菌抹中表達(dá)在CP與CP延伸之間含有一個UGA終止密碼子的編碼QPA1融合蛋白的質(zhì)粒，介導(dǎo)融合表位在VLP上的有效展示，該大腸桿菌菌抹攜帶編碼克隆UGA抑制性tRNA的質(zhì)粒，使UGA密碼子翻譯為Trp(pISM3001質(zhì)粒(SmileyB.K.，etal.，Gene134:33-40(1993))。另一種方法，將CP基因終止密碼子修飾為UAA,并與表達(dá)Al蛋白-抗原融合體的第二種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。該第二種質(zhì)粒編碼不同的抗生素抗性，并且其復(fù)制起點與第一種質(zhì)粒相容(Kozlovska,T.M.，etal"Intervirology39:9-15(1996))。第三種方法，CP和Al蛋白-抗原融合體以雙順反子的形式編碼，與啟動子如Trp啟動子有效連接，如Kozlovska,etal.,Intervirology39:9-15(1996)的圖1所示。在另外一個實施方案中，MelanA肽類似物插入在frCP的氨基酸2與3之間(切割的CP的編號，其中N端曱硫氨酸已經(jīng)切除)，從而產(chǎn)生MelanA肽類似物-frCP融合蛋白。用于構(gòu)建和表達(dá)可自裝配為VLP的frCP融合蛋白并且可用于本發(fā)明實施的載體和表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)有報道(PushkoP.,etal.,Prot.Eng.6:883-891(1993))。在一個具體實施方案中，MelanA肽類似物序列插入在frCP缺失變體內(nèi)氨基酸2之后，該變體中frCP的殘基3和4缺失。表位在RNA噬菌體MS-2外殼蛋白的N端突起P-發(fā)夾中的融合，以及隨后融合表位在RNA噬菌體MS-2的自裝配VLP上的呈遞，也已經(jīng)有描述(WO92/13081)，本發(fā)明的MelanA肽類似物通過插入或置換到MS-2RNA噬菌體的外殼蛋白內(nèi)的融合也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的MelanA肽類似物與乳頭瘤病毒的衣殼蛋白融合。在一個更特別的實施方案中，本發(fā)明的MelanA肽類似物與1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)的主要衣殼蛋白LI融合。用于構(gòu)建及在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)BPV-1融合蛋白的載體和表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)有描述(Chackerian,B.etal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2373-2378(1999),WO00/23955)。用本發(fā)明的MelanA肽類似物置換BLV-1LI的氨基酸130-136產(chǎn)生BPV-1Ll-MelanA肽類似物融合蛋白，這是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。在桿狀病毒載體中的克隆以及在桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中的表達(dá)已經(jīng)有描述，可在本發(fā)明的實施中使用(Chackerian,B.etal"Proc.Natl,Acad.Sci.USA96:2373-2378(1999)，WO00/23955)。展示融合的本發(fā)明MelanA肽類似物的裝配顆?？梢杂枚喾N方法進(jìn)行純化，如凝膠過濾或蔗糖梯度超速離心(Chackerian,B.etal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2373-2378(1999)，WO00/23955)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的MelanA肽類似物與能夠摻入TyVLP內(nèi)的Ty蛋白融合。在一個更特別的實施方案中，本發(fā)明的MelanA肽類似物與TYA基因編碼的pl或衣殼蛋白融合(Roth，J.F.,Yeast16:785-795(2000))。酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tyl、2、3、4已經(jīng)從釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae)中分離，而逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tfl已經(jīng)從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombae)中分離(Boeke,J.D.andSandmeyer,S.B.,"YeastTransposableelements,"inThemolecularandCellularBiologyoftheYeastSaccharomyces:Genomedynamics,ProteinSynthesis,andEnergetics,p.193,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1991))。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tyl和2與才直物和動物因子的copia類別有關(guān)，而Ty3屬于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的gypsy家族，它與植物和動物逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)。在Tyl逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中，pi蛋白(也稱為Gag或衣殼蛋白)的長度為440個氨基酸。pi在VLP的成熟過程中在位點408處被切割，產(chǎn)生p2蛋白，p2蛋白是VLP的必要組分。與pi融合的融合蛋白和用于在酵母中表達(dá)該融合蛋白的載體已經(jīng)有描述(Adams,S.E.，etal.，Nature329:68-70(1987))。例如，通過向pMA5620質(zhì)粒的BamHI位點內(nèi)插入編碼MelanA肽類似物的序列，本發(fā)明的MelanA肽類似物可與pi融合。將編碼外源表位的序列克隆到pMA5620載體內(nèi)導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)，該融合蛋白包含Tyl-15的pl的氨基酸l-381，其C端與外源表位的N端融合。同樣，本發(fā)明的MelanA肽類似物的N端融合，或向pi序列內(nèi)的內(nèi)部插入，或pi序列一部分的置換，也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體而言，將本發(fā)明的MelanA肽類似物插入Ty序列內(nèi)Ty蛋白pi的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之間(EP0677111)產(chǎn)生本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。適用于本發(fā)明的MelanA或MelanA肽類似物融合的其它VLP有，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒(W09630523)、HIV2Gag(Kang，Y.C.,etal.,Biol.Chem.380:353-364(1999))、豇豆花葉病毒(Taylor,K.M.,etal"Biol.Chem.380:387-392(1999》、細(xì)小病毒VP2VLP(Rueda，P.,etal"Virology263:89-99(1999))、HBsAg(US4,722,840,EP0020416B1)。適于實施本發(fā)明的嵌合VLP的實例也包括Intervirology39:1(1996)中所描述的那些。預(yù)計可用于本發(fā)明的VLP的其它實例有HPV-1、HPV-6、HPV-ll、HPV畫16、HPV陽18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIVGAG、煙草花葉病毒。也制備了SV40、多瘤病毒、腺病毒、單純皰滲病毒、輪狀病毒和諾瓦克病毒的病毒樣顆粒，這些VLP的嵌合VLP也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如上所述，包含通過插入病毒樣顆粒構(gòu)建單體序列內(nèi)而與病毒樣顆粒融合的抗原的實施方案，也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。有些情況下，抗原可以插入到包含缺失的病毒樣顆粒構(gòu)建單體形式中。在這些情況下，如果沒有插入抗原，病毒樣顆粒構(gòu)建單體可能不能形成病毒樣結(jié)構(gòu)。有時，可以應(yīng)用重組DNA技術(shù)使異源蛋白質(zhì)與VLP蛋白相融合(Kratz,P.A.,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:1915(1999))。例如，本發(fā)明包括與本發(fā)明的抗原(或其部分，優(yōu)選至少10、20或50個氨基酸)重組融合或化學(xué)偶聯(lián)(包括共價和非共價偶聯(lián))的VLP，產(chǎn)生融合蛋白或偶聯(lián)物。這種融合不一定必須是直接融合，也可以通過接頭序列發(fā)生。更一般而言，當(dāng)使用與病毒樣顆粒融合、偶聯(lián)或以其它方式附著的表位作為根據(jù)本發(fā)明的抗原時，一般在該表位的一端或兩端添加間隔或接頭序列。這些接頭序列優(yōu)選地包含可被蛋白酶體、內(nèi)體的蛋白酶或細(xì)胞的其它嚢狀區(qū)室識別的序列。一種偶聯(lián)方法是通過肽鍵偶聯(lián)，其中偶聯(lián)物可以是連續(xù)的多肽，即融合蛋白。對于根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白，不同的肽或多肽在框內(nèi)彼此連接，形成一條連續(xù)多肽。因此，該融合蛋白的第一部分包含抗原或免疫原，該融合蛋白的第二部分在第一部分的N端或C端包含VLP?；蛘撸景l(fā)明也可以向VLP的內(nèi)部插入，在抗原兩端任選地帶有連接序列。當(dāng)用HBcAg作為VLP時，優(yōu)選地抗原與HBcAg顆粒的C端連接。展示C端融合MHCI類限制的、來源于淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)糖蛋白的肽p33的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)可能是并且通常用作模型抗原(HBcAg-p33)。長度為185個氨基酸的野生型HBc蛋白裝配為高度結(jié)構(gòu)化的顆粒，該顆粒由180個亞單位組成，表現(xiàn)為幾何二十面體。文獻(xiàn)中很好地證明了HBcAg和其它VLP在不同位點處接納相對較大的外源序列插入，而保留形成結(jié)構(gòu)化衣殼的能力的這種柔性。這使得HBcVLP成為設(shè)計非復(fù)制性疫苗的有力候選者?？梢韵蛉诤系鞍椎目乖c配體之間插入一個柔性的接頭序列(例67如，含聚甘氨酸/聚絲氨酸的序列，如[Gly4Ser]2(Hustonetal.,Meth.Enzymol203:46-88(1991)))。也可以構(gòu)建融合蛋白使之含有一個"表位標(biāo)簽"，該標(biāo)簽使融合蛋白能夠結(jié)合一種抗體(例如單克隆抗體)，例如用于標(biāo)記或純化目的。表位標(biāo)簽的一個實例是Glu-Glu-Phe三肽，它可尋皮單克隆抗體YL1/2識別。列的嵌合DNA。例如，該DNA可以在桿狀病毒轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞中、在酵母或在細(xì)菌中表達(dá)。對表達(dá)系統(tǒng)沒有任何限制，常規(guī)應(yīng)用可以有大量選擇。優(yōu)選使用允許蛋白質(zhì)大量表達(dá)的系統(tǒng)。由于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的效率高，通常優(yōu)選該系統(tǒng)。適合在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的一個實例是Clarkeetal.,J.Gen.Virol.71:1109-1117(1990);Borisovaetal.,J.Virol.67:3696-3701(1993);Studieretal.,MethodsEnzymol.185:60-89(1990)所述的系統(tǒng)。合適的酵母表達(dá)系統(tǒng)的一個例子是Emr.MethodsEnzymol.185:231-3(1990)所述的系統(tǒng)；以前用于制備衣殼蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)也是適用的?？梢允褂媒M成型或誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。通過對可以使用的表達(dá)系統(tǒng)的選擇和可能的修飾，可能控制所獲蛋白質(zhì)的形式。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，希望增強對其免疫應(yīng)答的抗原與乙型肝炎病毒衣殼(核心)蛋白(HBcAg)在框內(nèi)偶聯(lián)、融合或以其它方式附著。然而，本領(lǐng)域所有人員都應(yīng)當(dāng)清楚，在本發(fā)明的融合蛋白構(gòu)建體中也可以^使用其它病毒樣顆粒。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一種MelanA肽類似物通過至少一個共價4建與病毒樣顆粒結(jié)合。優(yōu)選地，至少一種MelanA肽類似物通過至少一個共價4建與病毒樣顆粒結(jié)合，該共價鍵是非肽鍵，分別產(chǎn)生有序且重復(fù)的陣列和MelanA肽類似物-VLP偶聯(lián)物。這種MelanA肽類似物陣列和偶聯(lián)物一般且優(yōu)選地分別具有重復(fù)且有序的結(jié)構(gòu)，因為至少一種MelanA肽類似物以定向方式與VLP結(jié)合。優(yōu)選地，等于及超過120個、更優(yōu)選等于及超過180個、更優(yōu)選超過270個、更優(yōu)選等于及超過360個本發(fā)明的MelanA肽與VLP結(jié)合。所述至少一種MelanA肽類似物與VLP的定向及明確的結(jié)合和附著確保了重復(fù)且有序的MelanA肽類似物-VLP陣列和偶聯(lián)物的分別形成，這在下文中將是顯而易見的。而且，VLP固有的典型高度重復(fù)且組織化的結(jié)構(gòu)有助于以高度有序且重復(fù)的方式展示MelanA肽類似物，分別產(chǎn)生高度組織化且重復(fù)的MelanA肽類似物-VLP陣列和偶聯(lián)物。因此，本發(fā)明優(yōu)選的偶聯(lián)物和陣列與現(xiàn)有技術(shù)中偶聯(lián)物的不同在于高度組織化的結(jié)構(gòu)、大小和抗原在陣列表面上的重復(fù)性。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案還允許該顆粒在保證VLP正確折疊和裝配的表達(dá)宿主中表達(dá)，然后抗原，即至少一種本發(fā)明的MelanA肽類似物，進(jìn)一步與之偶聯(lián)。法。如上所述，在本發(fā)明的一個方面，通過化學(xué)交聯(lián)，一般且優(yōu)選地通過使用異雙功能交聯(lián)劑，將至少一種本發(fā)明的MelanA肽類似物與VLP結(jié)合。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知。在優(yōu)選實施方案中，異雙功能交聯(lián)劑含有能夠與優(yōu)選的第一附著位點(即VLP或至少一個VLP亞單位的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基)反應(yīng)的一個官能團(tuán)，和能夠與優(yōu)選的第二附著位點(即與本發(fā)明的MelanA肽類似物融合的、并且可選地也可通過還原用于反應(yīng)的半胱氨酸殘基)反應(yīng)的另一個官能團(tuán)。該方法的第一步，一般被稱為衍生化，是VLP與交聯(lián)劑反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物是活化的VLP,也被稱為活化載體。第二步，使用常用方法如凝膠過濾或透析除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。第三步，本發(fā)明的MelanA肽類似物與活化的VLP反應(yīng)，該步驟一般被稱為偶聯(lián)步驟。未反應(yīng)的MelanA肽類似物可選地可在第四步除去，例如通過透析。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知。其中包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo畫MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo畫SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可從PierceChemicalCompany(Rockford,IL,USA)獲得的其它交聯(lián)劑，其含有一個對氨基有反應(yīng)性的官能團(tuán)和一個對半胱氨酸殘基有反應(yīng)性的官能團(tuán)。上述交聯(lián)劑均導(dǎo)致硫醚鍵的形成。適用于實施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑的特征在于偶聯(lián)時在MelanA肽類似物與VLP之間引入二硫鍵。屬于這一類的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交聯(lián)劑書亍化VLP的程度可受不同實驗條件的影響，如反應(yīng)雙方各自的濃度、一種試劑相對于另一種的過量、pH、溫度和離子強度。偶聯(lián)程度，即每個VLP亞單位上抗原或抗原決定簇的量，可通過改變上述實驗條件來調(diào)節(jié)，以滿足疫苗的要求。抗原或抗原決定簇與VLP的一種特別有利的結(jié)合方法是VLP表面的賴氨酸殘基與本發(fā)明的MelanA肽類似物上的半胱氨酸殘基連接。在某些實施方案中，含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點或作為其一部分的氨基酸接頭與本發(fā)明的MelanA肽類似物的融合、偶聯(lián)、附著或結(jié)合，可能是與VLP偶聯(lián)所必需的。含有所述氨基酸接頭的這些構(gòu)建體也可以利用本領(lǐng)域公知的簡單肽合成方法獲得。因此，在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，抗原或抗原決定簇進(jìn)一步包含氨基酸接頭，其中優(yōu)選地該氨基酸接頭包含或由第二附著位點組成。柔性的氨基酸接頭通常是有利的。氨基酸接頭的例子選自(a)CGG;(b)N-端yl-接頭；(c)N-端y3-接頭；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n,其中n=0-12,k=0-5;(g)N-端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n,其中n=0-3,k=0-5,m=0-10,1=0-2(SEQIDNO:62);(i)GGC;(k)GGC-NH2;①C端yl-接頭；(m)C-端y3-接頭；(n)C-端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k,其中n=0-12，k=0-5;(p)C-端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k,其中n=0-3,k=0-5,m=0-10,1=0-2,o=0-8(SEQIDNO:63)。氨基酸接頭的其它實例包括免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)、甘氨酸絲氨酸接頭(GGGGS)n(SEQIDNO:64)和甘氨酸接頭(G)n，它們均還含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點，并且可選地含有另外的甘氨酸殘基。這類氨基酸接頭的典型優(yōu)選實例是N-端yl:CGDKTHTSPP(SEQIDNO:65);C-端yl:DKTHTSPPCG(SEQIDNO:66);N-端y3:70CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQIDNO:67);C-端:PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQIDNO:68);N-端甘氨酸接頭GCGGGG(SEQIDNO:69);C-端甘氨酸接頭GGGGCG(SEQIDNO:70);C-端甘氨酸-賴氨酸接頭GGKKGC(SEQIDNO:71);N-端甘氨酸-賴氨酸接頭CGKKGG(SEQIDNO:72)。當(dāng)疏水性抗原或抗原決定簇與VLP結(jié)合時，特別適于本發(fā)明實施的其它氨基酸接頭有作為N-端接頭的CGKKGG(SEQIDNO:73)或CGDEGG(SEQIDNO:74)，或者作為C-端接頭的GGKKGC(SEQIDNO:75)和GGEDGC(SEQIDNO:76)。對于C-端接頭，末端半胱氨酸可選地纟皮C端酰胺化?？捎糜诒景l(fā)明的其它接頭有允許從VLP上釋放抗原性肽，即人黑素瘤MelanA肽類似物的氨基酸序列。這些接頭的實例在ToesREetal.JExpMed.2001Jul2;194(l):l-12中有描述。而且，可以使用用于蛋白酶體切割的PAProC-a預(yù)測算法(NussbaumAK,etal.Immunogenetics.2001Mar;53(2):87-94)來預(yù)測上述允許從VLP上釋方文抗原性肽，即人黑素瘤MelanA肽類似物的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選肽C-端的GGCG(SEQIDNO:77)、GGC或GGC-NH2("NH2"表示酰胺化)接頭或肽N-端的CGG作為氨基酸接頭。甘氨酸殘基通常插入大氨基酸與作為第二附著位點的半胱氨酸之間，以避免較大氨基酸在偶聯(lián)反應(yīng)中的可能的空間位阻。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實施方案中，氨基酸接頭GGC-NH2與本發(fā)明的MelanA肽類似物的C-端融合。添加到本發(fā)明的MelanA肽類似物上的半胱氨酸殘基必須是還原狀態(tài)，才能與活化的VLP上的異雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)，即必須有游離半胱氨酸或含有游離巰基的半胱氨酸殘基。當(dāng)作為結(jié)合位點的半胱氨酸殘基是氧化形式時，例如，如果它形成二硫鍵，則需要用例如DTT、TCEP或P-巰基乙醇還原該二硫鍵。如WO02/05690所述，低濃度還原劑適于偶聯(lián)，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，較高濃度還原劑抑制偶聯(lián)反應(yīng)，在這種情況下必須在偶聯(lián)前除去還原劑，或者降低其濃度，例如通過71透析、凝膠過濾或反相HPLC。根據(jù)上述優(yōu)選方法，利用異雙功能交聯(lián)劑使本發(fā)明的MelanA肽類似物與VLP結(jié)合，可使本發(fā)明的MelanA肽類似物與VLP以定向方式偶聯(lián)。本發(fā)明的MelanA肽類似物與VLP結(jié)合的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS將本發(fā)明的MelanA肽類似物與VLP交聯(lián)的方法。另外一些方法使用同雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、DSG、BM[PE0]4、BS3(PierceChemicalCompany,Rockford，IL,USA)或含有對VLP的胺基或羧基具有反應(yīng)性的官能團(tuán)的其它公知的同雙功能交聯(lián)劑，將本發(fā)明的MelanA肽類似物附著于VLP。VLP與本發(fā)明的MelanA肽類似物結(jié)合的其它方法包括將VLP生物素化、并且將本發(fā)明的MelanA肽類似物表達(dá)為鏈親和素-融合蛋如WO00/23955所述。在這種情況下，可以通過調(diào)節(jié)本發(fā)明的MelanA肽類似物與鏈親和素的比例，首先使本發(fā)明的MelanA肽類似物與鏈親和素或親和素結(jié)合，并且使得仍有自由結(jié)合位點可與下一步添加的VLP結(jié)合?；蛘撸谐煞忠部梢曰旌显?一鍋"反應(yīng)中。存在受體和配體的可溶形式、并且能夠與VLP或本發(fā)明的MelanA肽類似物交聯(lián)的其它配體-受體對也可以用作結(jié)合本發(fā)明的MelanA肽類似物與VLP的結(jié)合劑?；蛘撸潴w或受體可以與本發(fā)明的MelanA肽類似物融合，從而介導(dǎo)與分別化學(xué)結(jié)合或融合于該受體或配體的VLP的結(jié)合。也可以通過插入或置換實現(xiàn)融合。如前所述，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP,在一個更優(yōu)選的實施方案中，VLP是RNA噬菌體Q(3外殼蛋白的VLP。如果空間上允許，一個或幾個抗原分子，即一個或幾個抗原或抗原決定簇，能夠附著于RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼或VLP的一個亞單位上，優(yōu)選地通過RNA噬菌體VLP的暴露賴氨酸殘基附著。RNA噬菌體外殼蛋白的VLP,特別是QI3外殼蛋白VLP的一個特殊特征是每個亞單位能夠偶聯(lián)幾個抗原。這能夠產(chǎn)生密集的抗原陣列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述至少一種本發(fā)明的MelanA肽類似物與病毒樣顆粒的結(jié)合和附著分別是通過病毒樣顆粒的至少一個第一附著位點與本發(fā)明的MelanA肽類似物的至少一個第二附著位點之間的相互作用和連接實現(xiàn)的。Q(3外殼蛋白的VLP或衣殼在其表面展示數(shù)量確定的賴氨酸殘基，具有確定的拓樸學(xué)，有3個賴氨酸殘基指向衣殼內(nèi)部，并與RNA相互作用，另外4個賴氨酸殘基暴露于衣殼外面。這些明確的特性有利于抗原附著于顆粒外部，而不是賴氨酸殘基與RNA相互作用的顆粒內(nèi)部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的VLP在其表面也有數(shù)量確定的賴氨酸殘基，這些賴氨酸殘基有確定的拓樸學(xué)。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，并且/或者第二附著位點包含巰基或半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，并且第二附著位點是半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的MelanA肽類似物通過半胱氨酸殘基與RNA噬菌體外殼蛋白VLP的賴氨酸殘基結(jié)合，特別是與Q(3外殼蛋白的VLP結(jié)合。來源于RNA噬菌體的VLP的另一個優(yōu)點是它們在細(xì)菌中的高表達(dá)量，這允許以較低的成本生產(chǎn)大量的物質(zhì)。如上所述，本發(fā)明的偶聯(lián)物和陣列分別與現(xiàn)有技術(shù)中偶聯(lián)物的不同在于高度組織化的結(jié)構(gòu)、大小以及抗原在陣列表面上的重復(fù)性。而且，用VLP作為載體可以分別形成具有不同抗原密度的龐大的抗原陣列和偶聯(lián)物。特別是，使用RNA噬菌體的VLP,尤其是^f吏用RNA噬菌體QP外殼蛋白的VLP,能夠獲得極高的表位密度。具體而言，將肽(例如WO2004/016282所述的人A(31-6肽)與Q卩外殼蛋白的VLP偶聯(lián)，能夠獲得每個亞單位1.5個以上表位的密度。具有高表位密度的RNA噬菌體外殼蛋白VLP組合物的制備可以根據(jù)本申請的教導(dǎo)來實現(xiàn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，當(dāng)本發(fā)明的MelanA肽類似物與Q(3外殼蛋白的VLP偶聯(lián)時，每個亞單位上本發(fā)明的MelanA肽類似物的平均數(shù)量為0,5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高是優(yōu)選的。如此處定義的第二附著位點可以是本發(fā)明的MelanA肽類似物天然存在或非天然存在的。如果本發(fā)明的MelanA肽類似物上沒有合適的天然存在的第二附著位點，則必須為該抗原構(gòu)建非天然的第二附著位點。如上所述，有4個賴氨酸殘基暴露于Qp外殼蛋白的VLP表面。這些殘基一般在與交聯(lián)劑分子反應(yīng)時被衍化。如果不是所有的暴露賴氨酸殘基都能與抗原偶聯(lián)，則已經(jīng)與交聯(lián)劑反應(yīng)的賴氨酸殘基在衍化步驟后s-氨基連接交聯(lián)劑分子。這使得一個或幾個正電荷丟失，這可能不利于VLP的可溶性和穩(wěn)定性。通過用精氨酸代替一些賴氨酸殘基，如在下文所述的QP外殼蛋白突變體中的那樣，我們防止了正電荷的過多丟失，因為精氨酸殘基不與交聯(lián)劑反應(yīng)。而且，用精氨酸置換賴氨酸殘基可產(chǎn)生更明確的抗原陣列，因為有更少的位點可以與抗原反應(yīng)。因此，在本申請公開的下列Q|3外殼蛋白突變體和突變Q(3VLP中，用精氨酸替換了暴露的賴氨酸殘基QP-240(Lysl3-Arg;SEQIDNO:20)、QP-250(Lys2畫Arg,Lysl3-Arg;SEQIDNO:22)和QP隱259(Lys2-Arg,Lysl6-Arg;SEQIDNO:24)?？寺×诉@些構(gòu)建體，表達(dá)了蛋白質(zhì)，純化了VLP,并用于與本發(fā)明的MelanA肽類似物偶聯(lián)。也構(gòu)建了QP-251(SEQIDNO:23),在本申請中能夠找到如何表達(dá)、純化和偶聯(lián)Q(3-251外殼蛋白VLP的指南。在另一個實施方案中，我們公開了含有一個額外賴氨酸殘基的QP突變外殼蛋白，它適用于獲得更高密度的抗原陣列。克隆該突變QP外殼蛋白Q(3-243(Asnl0-Lys;SEQIDNO:21)，表達(dá)蛋白質(zhì)，分離并純化衣殼或VLP,表明該額外賴氨酸殘基的引入與亞單位自裝配為衣殼或VLP相容。因此，可以用Q(3外殼蛋白突變體的VLP分別制備MelanA肽類似物陣列和偶聯(lián)物?？乖cVLP、特別是與RNA噬菌體外殼蛋白VLP附著的一種特別優(yōu)選的方法是將RNA噬菌體外殼蛋白VLP表面的賴氨酸殘基與添加于抗原中的半胱氨酸殘基連接。為了使半胱氨酸殘基能夠有效地作為第二附著位點，必須有一個巰基能用來偶聯(lián)。因此，半胱氨酸殘基必須是還原狀態(tài)，即，必須有游離半胱氨酸或含有游離巰基的半胱氨酸殘基。如果作為第二附著位點的半胱氨酸殘基是氧化形式，例如，如果它形成二硫鍵，則需要使用如DTT、TCEP或(3-巰基乙醇還原該二硫鍵。必須為每種抗原調(diào)節(jié)還原劑的濃度和還原劑超過抗原的摩爾數(shù)。必要時需要檢測滴定范圍，從<氐至10nM或更^f氐到可達(dá)10-20mM或更高的還原劑濃度，并評價抗原與載體的偶聯(lián)。盡管如WO02/056905所述，低濃度還原劑適于偶聯(lián)反應(yīng)，較高濃度抑制偶聯(lián)反應(yīng)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在這種情況下必須除去還原劑或降低其濃度，例如通過透析、凝膠過濾或反相HPLC來實現(xiàn)。有利地，透析或平衡緩沖液的pH低于7,優(yōu)選6。必須檢測低pH緩沖液與抗原活性或穩(wěn)定性的相容性。通過選擇交聯(lián)劑和其它反應(yīng)條件，能夠調(diào)節(jié)RNA噬菌體外殼蛋白VLP上的表位密度。例如，交聯(lián)劑Sulfo-GMBS和SMPH—般能夠獲得高表位密度。高濃度反應(yīng)物正面影響衍生化，可以通過控制反應(yīng)條件來控制與RNA噬菌體外殼蛋白VLP偶聯(lián)、特別是與QP外殼蛋白VLP偶聯(lián)的抗原數(shù)量。在設(shè)計非天然的第二附著位點之前，必須選擇融合、插入或通常構(gòu)建的位置。第二附著位點的位置選擇例如可以以抗原的晶體結(jié)構(gòu)為如取決于它們的溶劑可及性)或關(guān)于適于作為第二附著位點的殘基(如半胱氨酸殘基)暴露于溶劑的信息。如Fab片段那樣，暴露的二硫鍵也可以是第二附著位點的來源，因為通過用例如2-巰基乙胺、TCEP、P-巰基乙醇或DTT溫和還原，通?？梢詫⑺鼈冝D(zhuǎn)化為單個半胱氨酸殘基。選擇不影響抗原免疫原性的溫和還原條件。如果用自身抗原免疫旨在抑制該自身抗原與其天然配體的相互作用，通常添加第二附著位點以產(chǎn)生針對與天然配體相互作用的位點的抗體。因此，第二附著75位點的位置選擇要避免第二附著位點或含有它的任何氨基酸接頭引起的空間位阻。在其它一些實施方案中，希望有針對一個位點的抗體應(yīng)答，該位點不同于自身抗原與其天然配體的相互作用位點。在這些實施方案中，可選擇第二附著位點，以防止產(chǎn)生針對自身抗原與其天然配體的相互作用位點的抗體。選擇第二附著位點位置的其它標(biāo)準(zhǔn)包括抗原的寡聚狀態(tài)，寡聚位點，輔因子的存在，以及揭示抗原結(jié)構(gòu)和序列中位點的實驗證據(jù)的可獲得性，在該位點對該抗原的修飾與自身抗原的功能相容，或者適于產(chǎn)生可識別自身抗原的抗體。在非常優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的MelanA肽類似物包含添加的單一的第二附著位點或單一的反應(yīng)性附著位點，該位點分別能夠與核心顆粒和VLP或VLP亞單位上的第一附著位點連接。這進(jìn)一步確保至少有一個、但一般是一個以上、優(yōu)選超過10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450個本發(fā)明的MelanA肽類似物分別與核心顆粒和VLP明確且均一地結(jié)合和連接。因此，抗原上含有單一的第二附著位點或單一的反應(yīng)性附著位點確保了類型單一且均勻的結(jié)合和連接，分別產(chǎn)生高度有序且重復(fù)的陣列。例如，如果分別通過賴氨酸-(作為第一附著位點)和半胱氨酸-(作為第二附著位點)相互作用來實現(xiàn)結(jié)合和連接，根據(jù)本發(fā)明的這一優(yōu)選實施方案，確保了每個抗原只有一個半胱氨酸殘基能夠分別與VLP和核心顆粒的第一附著位點結(jié)合和連接，而無論該半胱氨酸殘基是抗原上天然存在的還是非天然存在的。在某些實施方案中，向本發(fā)明的MelanA肽類似物上構(gòu)建第二附著位點需要根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容融合含有適于作為第二附著位點的氨基酸的氨基酸接頭。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，氨基酸接頭通過至少一個共價4建與本發(fā)明的MelanA肽類似物結(jié)合。優(yōu)選地，該氨基酸接頭包含或由第二附著位點組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，氨基酸接頭包含巰基或半胱氨酸殘基。在另一個優(yōu)選實施方案中，該氨基酸接頭是半胱氨酸。一些選擇氨基酸接頭的標(biāo)準(zhǔn)76以及根據(jù)本發(fā)明的氨基酸接頭的進(jìn)一步優(yōu)選實施方案在上文中已經(jīng)提及。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，附著位點選擇為與HBcAg框內(nèi)融合的賴氨酸或半胱氨酸殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，抗原通過三亮氨酸接頭與HBcAg的C端融合。當(dāng)抗原或抗原決定簇通過賴氨酸殘基與VLP連接時，有利的是置換或刪除一個或多個天然存在的賴氨酸殘基，以及HBcAg變體中存在的其它賴氨酸殘基。在許多情況下，當(dāng)天然存在的賴氨酸殘基被去除時，向HBcAg內(nèi)引入另一個賴氨酸作為抗原或抗原決定簇的附著位點。插入賴氨酸殘基的方法在本領(lǐng)域公知。也可以在不除去已有賴氨酸殘基的情況下添加賴氨酸殘基。已經(jīng)證明HBcAg的C端可引導(dǎo)該蛋白質(zhì)的核定位(Eckhardt,etal.J.Virol.65:575-582(1991))。而且也認(rèn)為該蛋白質(zhì)的這一區(qū)域4吏HBcAg具有結(jié)合核酸的能力。如上所述，適于在本發(fā)明的實施中使用的HBcAg還包括N端截短突變體。合適的截短突變體包括已經(jīng)從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸的修飾HBcAg。然而，在組成病毒樣顆粒的亞單位序列內(nèi)含有內(nèi)部缺失的病毒樣顆粒變體也適用于本發(fā)明，只要它們與病毒樣顆粒的有序或顆粒狀結(jié)構(gòu)相容。例如，HBcAg序歹'j內(nèi)的內(nèi)部缺失是適宜的(Preikschat,P.,etal.,J.Gen.Virol.80:1777-1788(1999》。適于在本發(fā)明的實施中使用的其它HBcAg包括N端和C端截短突變體。合適的截短突變體包括已經(jīng)從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15和17個氨基酸、并從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48個氨基酸的HBcAg。本發(fā)明的疫苗組合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由氨基酸序列不同的多種HBcAg組成。例如，可以制備包含"野生型"HBcAg和其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)改變(例如缺失、插入或置換)的修飾HBcAg的疫苗組合物。然而在大多數(shù)應(yīng)用中，只使用一種類型的HBcAg。在一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含至少一個第一附著位點，且抗原或抗原決定簇包含至少一個第二附著位點。優(yōu)選地，該第一附著位點包含或優(yōu)選由氨基或賴氨酸殘基組成。該第二附著位點優(yōu)選選自(a)所述抗原或抗原決定簇中非天然存在的附著位點；和(b)所述抗原或抗原決定蔟中天然存在的附著位點。再更優(yōu)選地，該第二附著位點包含或者優(yōu)選地由巰基或半胱氨酸殘基組成。在一個優(yōu)選實施方案中，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒的結(jié)合是通過第一附著位點和第二附著位點的連接實現(xiàn)的，其中優(yōu)選地這種連接是通過至少一個非肽4建實現(xiàn)的，并且其中優(yōu)選地，抗原或抗原決定簇和病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重復(fù)的抗原陣列。在一個實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，第二附著位點是半胱氨酸殘基。在另一個實施方案中，第一附著位點是氨基，第二附著位點是巰基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，抗原，在此特別指黑素瘤MelanA肽類似物，包含一種或多種細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位或這兩種表位的組合。因此，在一個實施方案中，抗原或抗原決定簇包含一種、兩種或多種細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。在另一個實施方案中，抗原或抗原決定蔟包含一種、兩種或多種Th細(xì)胞表位。在另一個實施方案中，抗原或抗原決定簇包含一種、兩種或多種細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位和一種、兩種或多種Th細(xì)胞表位。天然MelanA/Mart-l表位，例如MelanA/Mart-l26-35表位，只與人HLA-2低親和力結(jié)合。因此，接種后天然MelanA表位和肽的分別體內(nèi)呈遞可能是一個限制因素。如果分別與VLP結(jié)合、偶聯(lián)或融合的MelanA表位和肽用于接種，這特別重要，因為在這些條件下，MelanA肽通過交叉呈遞攜帶HLA分子。但是，交叉呈遞的過程不象傳統(tǒng)抗原呈遞途徑那樣有效，MelanA肽對HLA的親和力甚至更重要。因此，對于基于VLP的接種，非常優(yōu)選地是使用可與HLA相對高親和力結(jié)合的MelanA肽類似物。同樣，使用可被宿主的天然T細(xì)胞所有組成成分(repertoire)以較高親和力識別的MelanA肽類似物也可能是有利的。一般來說，在適當(dāng)位點含有錨定殘基從而允許與MHC分子有效結(jié)合的MelanA表位和肽類似物分別是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明的另一個方面和本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案提供一種增強動物中免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；和(b)免疫刺激物，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中至少一種抗原或抗原決定簇包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成，并且其中所述人黑素瘤MelanA肽類似物與所述病毒樣顆粒結(jié)合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，MelanA肽類似物能夠允許與MHC分子有效結(jié)合。因此，MelanA肽類似物的使用特別能夠允許引入這種導(dǎo)致改善與MHC分子結(jié)合的錨定殘基。如果天然和正常的MelanA肽類似物分別不含這種錨定殘基，或者只是不含次于新引入的錨定殘基的錨定殘基，以分別代替天然和正常的錨定殘基，引入導(dǎo)致改善與MHC分子結(jié)合的錨定殘基是特別有利的。產(chǎn)生MelanA肽類似物的正常人MelanA肽的修飾，優(yōu)選這些錨定殘基的引入，如下實現(xiàn)(i)誘導(dǎo)突變(例如化學(xué)誘導(dǎo)、照射或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方法)，然后篩選與MHC的結(jié)合改善的修飾肽，或者(ii)篩選與MHC的結(jié)合改善的修飾肽，這種改善是由于在蛋白質(zhì)合成的任何水平上發(fā)生的天然突變引起的，包括但不限于在蛋白質(zhì)表達(dá)的DNA、轉(zhuǎn)錄、RNA或翻譯水平上發(fā)生的突變，或者(iii)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的經(jīng)典的肽合成法，進(jìn)行系統(tǒng)或隨機氨基酸交換、缺失、置換或插入。這些錨定殘基的鑒定一般且優(yōu)選地使用如Rammenseeetal.inImmunogenetics50:213-219(1999)所述的SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫來實現(xiàn)。SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫允許計算選擇的任何肽的HLA結(jié)合效率，并且能夠利用該程序在HLA結(jié)合效率方面對肽進(jìn)行優(yōu)化。此外，優(yōu)選肽類似物的鑒定也能夠通過MHC-肽結(jié)合測定來實現(xiàn)，包括但不限于突變細(xì)胞系中T細(xì)胞活化或識別或MHC上調(diào)的全細(xì)胞測定，MHC-四聚體-肽結(jié)合測定，使用標(biāo)記肽的竟?fàn)幮越Y(jié)合測定，表面等離共振測定，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，MelanA肽類似物的特征在于相對于相應(yīng)的正常MelanA肽有兩個，更優(yōu)選一個氨基酸置換。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，MelanA肽類似物受到保護(hù)而免遭蛋白酶或肽酶介導(dǎo)的降解。使用受到保護(hù)而免遭蛋白酶或肽酶降解的MelanA肽類似物導(dǎo)致在對患者施用該肽后肽的體內(nèi)穩(wěn)定性提高，并且/或者在存在蛋白酶或肽酶的貯存過程中肽的穩(wěn)定性提高。這種穩(wěn)定性提高的后果是人黑素瘤MelanA肽類似物在MHC上更有效的、延長的呈遞，從而提高特異性T細(xì)胞應(yīng)答的刺激。優(yōu)選地，通過將選擇的天然人MelanA肽的氨基酸殘基置換為如Blanchetetal,J.Immunol.167:5852-5861(2001)和此處引用的參考文獻(xiàn)所舉例說明的非天然氨基酸衍生物，保護(hù)人MelanA肽類似物。這克服了通常由于以下事實造成的限制分別與天然和正常的MelanA肽相比，化學(xué)修飾的MelanA肽和MelanA肽類似物可能不^皮T細(xì)胞同樣好地識別。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物組成，該肽類似物具有選自但不限于下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQIDNO:84)，(b)MAGIGILTV(SEQIDNO:85),(c)EAMGIGILTV(SEQIDNO:86),(d)ELAGIGILTV(SEQIDNO:50),(e)EMAGIGILTV(SEQIDNO:87),(f)YAAGIGILTV(SEQIDNO:88),(g)FAAGIGILTV(SEQIDNO:89),(h)GHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:51),(i)SYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:52),和①ELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:53)。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物組成，該肽類似物具有選自但不限于下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQIDNO:84),(b)MAGIGILTV(SEQIDNO:85)，(c)80EAMGIGILTV(SEQIDNO:86),(d)ELAGIGILTV(SEQIDNO:50),(e)EMAGIGILTV(SEQIDNO:87),(f)YAAGIGILTV(SEQIDNO:88),和(g)FAAGIGILTV(SEQIDNO:89)。這些肽類似物以及它們的合成已經(jīng)被Valmoriatal.,J.Immunol.160:1750-1758(1998)描述。這些肽類似物顯示被針對天然黑素瘤肽的5個不同細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆的相對識別和耙細(xì)胞裂解提高。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQIDNO:50)組成。如整個實施例部分所述，這一非常優(yōu)選的實施方案在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)功能性MelanA-特異性CD8+T細(xì)胞的擴增，代表HLA-結(jié)合與TCR-識別之間良好的折衷(參見Valmoriatal.,J.Immunol.160:1750-1758(1998))。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，帶有第二附著位點的人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有選自但不限于下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEEAAGIGILTV(SEQIDNO:54);在此一般縮寫為16-35,(b)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55);在此一般縮寫為MelanA16-35A/L)，(c)CGGEAAGIGILTV(SEQIDNO:56);在此一般縮寫為MelanA26-35,(d)CGGELAGIGILTV(SEQIDNO:57);在此一般縮寫為MelanA26-35A/L),(e)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:58);在此一般縮寫為MelanA20-40A/L),(f)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:59);在此一般縮寫為MelamA26-40A/L),(g)ELAGIGILTVGGC(SEQIDNO:60);在此一般縮寫為MelanA26-35-CA/L),(h)CSPKSLELAGIGILTV(SEQIDNO:92);在此一般縮寫為CSPKSL隱MelanA26-35A/L;和(i)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQIDNO:93);在此一般縮寫為MelanA26-40-CA/L。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，帶有第二附著位點的人黑素瘤MelanA/MART-l肽類似物具有選自下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55);在此一般縮寫為MelanA16-35A/L),(b)CGGELAGIGILTV(SEQIDNO:57);在此一般縮寫為MelanA26-35A/L),(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:58);在此一4殳縮寫為MelanA20-40A/L),(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQIDNO:59);在此一4殳縮寫為MelanA26-40A/L)，(e)ELAGIGILTVGGC(SEQIDNO:60);在此一般縮寫為MelanA26-35-CA/L)。在本發(fā)明的另一個非常優(yōu)選的實施方案中，帶有第二附著位點的人黑素瘤MelanA/MART-1肽類似物具有氨基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQIDNO:55)(MelanA16-35A/L)。如實施例21所述，含有這種非常優(yōu)選的實施方案的本發(fā)明的疫苗組合物，即Qj3MelanA16-35A/L疫苗，被樹突細(xì)胞加工。在本發(fā)明的另一個實施方案中，與病毒樣顆粒偶聯(lián)、融合或以其它方式附著的本發(fā)明的MelanA肽類似物是T細(xì)胞表位，該表位是細(xì)胞毒性的或是Th細(xì)胞表位。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述抗原是至少兩種相似或不同的、優(yōu)選不同的表位的組合，其中所述至少兩種表位直接連接或通過連接序列連接。這些表位優(yōu)選地選自對于黑素瘤所述的細(xì)胞毒性和Th細(xì)胞表位(gp100、酪氨酸酶、MAGE家族或NY-ESO-l)。因此，在本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述抗原包含或進(jìn)一步包含細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接結(jié)合或者通過連接序列結(jié)合，并且其中優(yōu)選地所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位是病毒或腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。優(yōu)選的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位有MelanA表位(16-36A/L)(25-36A/L);酪氨酸酶表位(1-9)和(368-376)(Panelli,M.C.etal"J.Immunol.2000,164,495-504);GplOO表位(154-162),(209-217(T210M))，(280-288)和(280-288(A288V))和(457-466)(Nielsen,M.B.etal"2000.JImmunol"164(4)"2287-96和Linette,GP.etal.JImmunol,2000,164,3402-3412和Skipper,J.C.,Int.J.Cancer,1999,82,669-677和Pass82H.A.,etal.,CancerJSciAm.,1998,4,316-323);TRP2表位(180-188)(288-296)(455-463)(Sun，Y.etal"Int.JCancer,2000,87(3),399-404和Parkhurst,M.R.etal"CancerRes"1998,58，4895-8901和Harada,M.,etal"CancerRes"2001,61,1089-1094));NY-ESO畫l表位157-165(Chen,J.L.,etal.,J.Immunol,2000,165,948-955);和MAGE-A表位(248V9)(Graff-Dubois,S.，etal.，2002,J.Immunol,169,575-580)。一個優(yōu)選的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位組合是組合(25-36A/L)，酪氨酸酶(368-376),GplOO(209-217(T210M))和(457-466),和NY國ESO-l(157-165)。優(yōu)選的Th細(xì)胞表位有Mage-3表位(281-295)，(141-155)和(146-160)(Kobayashi,H.,etal.,CabcerRes.,2001,61,4773-4778);酪氨酸酶表位(188-208),(193-203)(KobayashiH.,etal.,Immunogenetics,1998,47,398-403);GP100表位(44-59);和NY畫ESO-l表位(115-132)，(121-138),(139-156),(119畫143)和(134-148)(Zarour,H.M"etal"CancerRes"2002,62,213-218)。優(yōu)選的細(xì)胞毒性和Th細(xì)胞表位的組合有MelanA表位(l-118A/L)(SEQIDNO:94);NY匿ESO-l表位115-165;或MelanA(25-36A7L)、gplOO(209-217(T210M)、Mage-3(146-160)和gapl00(44-59)的組合。同樣應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明范圍內(nèi)也包括鑲嵌病毒樣顆粒，例如由分別與不同抗原和表位附著的亞單位組成的病毒樣顆粒。本發(fā)明的這種組合物可以如下獲得例如，用兩種相容的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這兩種質(zhì)粒分別編碼與不同抗原和表位融合的組成病毒樣顆粒的亞單位。在此情況中，鑲嵌病毒樣顆粒在細(xì)胞中直接裝配或者在細(xì)胞裂解后裝配。而且，通過將不同抗原和表位的混合物與分離的病毒樣顆粒附著，也可以獲得本發(fā)明的這種組合物。本發(fā)明的MelanA肽類似物，特別是所述表位，可以被合成或重組表達(dá)，并且與病毒樣顆粒偶聯(lián)，或利用重組DNA技術(shù)與病毒樣顆粒融合?？乖c病毒樣顆粒附著的典型方法公開在WO00/32227、WO01/85208和WO02/056905中，其公開內(nèi)容在此完整地引用作為83參考。本發(fā)明也提供一種制備用于增強動物中免疫應(yīng)答的組合物的方法，該組合物包含VLP和與VLP結(jié)合的免疫刺激物、優(yōu)選含非甲基化CpG的寡核苦酸，該方法包括將VLP分別與免疫刺激物和寡核苷酸孵育，添力口RNase，并純化該組合物。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包4舌抗原或抗原決定簇與該病毒樣顆粒結(jié)合的步驟，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在一個優(yōu)選實施方案中，在病毒樣顆粒與免疫刺激物孵育之前，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合。在另一個優(yōu)選實施方案中，在純化該組合物后，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合。在一個同樣優(yōu)選的實施方案中，該方法包括將VLP與RNase—起孵育，分別添加免疫刺激物和寡核香酸，并純化該組合物。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括結(jié)合抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒的步驟，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在一個優(yōu)選實施方案中，在病毒樣顆^立與RNase孵育之前，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合。在另一個優(yōu)選實施方案中，在純化該組合物后，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合。在一個實施方案中，VLP在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，RNase是RNaseA。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備用于增強動物中免疫應(yīng)答的組合物的方法，該組合物包含與免疫刺激物、優(yōu)選與含非曱基化CpG的寡核香酸結(jié)合的VLP，該方法包4舌解裝配VLP,分別添加免疫刺激物和寡核苷酸，以及重裝配VLP。該方法可進(jìn)一步包括除去解裝配的VLP的核酸，以及/或者在重裝配后純化該組合物。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括將抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合的步驟，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。在一個優(yōu)選實施方案中，在解裝配病毒樣顆粒之前，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合。在另一個優(yōu)選實施方案中，在重裝配病毒樣顆粒之后，優(yōu)選地在純化該組合物之后，抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合。本發(fā)明也提供可用于預(yù)防和/或緩解疾病或狀況的疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗組合物包含、或者由免疫有效量的本發(fā)明的免疫增強組合物以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑組成。該疫苗可選地也可含有佐劑。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗，該疫苗包含免疫有效量的本發(fā)明的免疫應(yīng)答增強組合物，以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，其中該組合物含有(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中該抗原或抗原決定簇與該病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中該免疫刺激物與該病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中該抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。優(yōu)選地，該疫苗進(jìn)一步含有佐劑。本發(fā)明還提供用來預(yù)防和/或緩解動物疾病或狀況的接種方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于預(yù)防多種動物物種，特別是哺乳動物，如人、猴、牛、狗、貓、馬、豬等，優(yōu)選人的癌癥的疫苗。該疫苗可以設(shè)計為治療所有類型的癌癥，優(yōu)選黑素瘤。眾所周知，使用蛋白質(zhì)或病毒進(jìn)行的同源引發(fā)-力口強(prime-boost)接種策略大多數(shù)通常是不成功的。先前存在的抗體在重新遇到抗原時，被認(rèn)為干擾記憶應(yīng)答的誘導(dǎo)。令我們吃驚的是，在同源引發(fā)-加強接種程序中，RNA噬菌體來源的VLP,特別是來源于QP的VLP,非常有效地誘導(dǎo)記憶CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。相反，如實施例26所述，活痘苗病毒免疫在誘導(dǎo)初次CD8+T細(xì)胞應(yīng)答方面無效，而用牛痘進(jìn)行同源加強幾乎不引起記憶CD8+T細(xì)胞的擴增。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種免疫或治療動物的方法，該方法包括通過施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗而在動物中引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括加強動物中的免疫應(yīng)答的步驟，其中優(yōu)選地這種加強是通過施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現(xiàn)的，其中更優(yōu)選地，所述異種疫苗是DNA疫苗、肽疫苗、重組病毒或樹突細(xì)胞疫苗。另外，在另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種免疫或治療動物的方法，該方法包括在動物中引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答以及加強動物中的T細(xì)胞應(yīng)答的步驟，其中這種加強是通過施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗來實現(xiàn)的。優(yōu)選地，這種引發(fā)是通過施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗或免疫有效量的異種疫苗來實現(xiàn)的，其中更優(yōu)選地，所述異種疫苗是DNA疫苗、肽疫苗、重組病毒或樹突細(xì)胞疫苗。而且，在另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種組合物，該組合物含有病毒樣顆粒、至少一種免疫刺激物和至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位或至少兩種所述表位的組合，其中所述至少兩種表位直接結(jié)合或者通過連接序列結(jié)合，并且其中優(yōu)選地所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位是病毒或腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。在另一方面，本發(fā)明提供一種通常且優(yōu)選地用于增強動物中的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物含有(a)病毒樣顆粒；(b)免疫刺激物；其中該免疫刺激物(b)與該病毒樣顆粒(a)結(jié)合；和(c)抗原，其中該抗原與所述病毒樣顆粒(a)混合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。如此處所用的術(shù)語"混合，，是指一起添加的兩種或多種物質(zhì)、成分或組分的組合，它們彼此不是化學(xué)結(jié)合，并且能夠分開?；旌峡乖c病毒樣顆粒的方法在WO04/000351中有描述，該專利在此全文引用作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)對動物施用本發(fā)明的組合物時，該組合物中可以含有鹽、緩沖劑、佐劑或希望用來提高組合物效力的其它物質(zhì)。在大量資料中提供了適于制備藥物組合物的材料的實例，包括Remington'sPharmaceuticalSciences(Osol,A,ed.,MackPublishingCo"(1990))。根據(jù)宿主物種的不同，可以用不同佐劑來增強免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全及不完全)佐劑，無機凝膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂，多聚醇(pluronicpolyols)、聚陰離子、肽、油狀乳劑、匙孔戚血藍(lán)蛋白、二硝基酚，以及可能用于人的佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。這些佐劑是本領(lǐng)域公知的。可與本發(fā)明的組合物一起施用的其它佐劑包括但不限于單磷酸脂免疫調(diào)節(jié)劑、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、鋁鹽、MF-59和病毒體佐劑技術(shù)。佐劑也可包括這些物質(zhì)的混合物。如果接受個體能夠耐受本發(fā)明的組合物的施用，則稱該組合物是"藥理學(xué)可接受的"。而且，本發(fā)明的組合物以"治療有效量"施用(即產(chǎn)生希望的生理學(xué)效果的量)。本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域公知的多種方法施用。選擇的具體方式當(dāng)然取決于所選擇的具體組合物、所治療疾病的嚴(yán)重程度和達(dá)到治療效果所需的劑量。一般來說，本發(fā)明的方法可以用醫(yī)學(xué)上可接受的任何給藥方式實施，即，產(chǎn)生有效水平的活性化合物而不會引起臨床上不可接受的副作用的任何方式。這些給藥方式包括口服、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(通過粉末、軟膏、液滴或透皮帖劑)、面頰或口或鼻噴霧。如此處使用的術(shù)語"腸胃外"是指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸液在內(nèi)的給藥方式。本發(fā)明的組合物也可以直接注射到淋巴結(jié)中。用于給藥的組合物成分包括無菌水(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和注射用有機酯如油酸乙酯?？梢岳幂d體或封閉性包衣來提高皮膚通透性并提高抗原吸收。聯(lián)合給藥可以同時(例如作為混合物，或分開但同時或共同給藥)或相繼施用。這包括組合藥劑作為治療混合物一起施用的形式，以及組合藥劑分開但同時施用的方法，例如通過不同的靜脈輸入同一個體中。"聯(lián)合"給藥還包括先給予這些化合物或藥劑之一，隨后再給予第二種。劑量水平取決于給藥方式、患者狀況和載體/佐劑制劑的質(zhì)量。典型用量為每名患者約0.1pg至約20mg。優(yōu)選的量是每名患者至少約1iag至約lmg，更優(yōu)選至少約10^g至約400ng。優(yōu)選多次給藥以對患者進(jìn)行免疫，給藥方案是本領(lǐng)域中適合所述患者的標(biāo)準(zhǔn)方案。該組合物可以方便地制成單位劑量形式，可以按制藥領(lǐng)域公知的任何方法制備。這些方法包括將本發(fā)明的組合物與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相結(jié)合的步驟。這些組合物通常按如下制備將本發(fā)明的組合物均勻、密切地與一種液體載體、細(xì)^^的固體載體或這兩種載體混合，然后在必要時使產(chǎn)品成形。適于口服的組合物可以是分散的單位形式，如膠嚢、片劑或錠劑，每個單位含有預(yù)定量的本發(fā)明的組合物。其它形式的組合物包括在水溶液或非水液體中的懸液，如糖漿、酏劑或乳劑。其它給藥系統(tǒng)包括定時釋放、延時釋放或緩釋給藥系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可以避免重復(fù)施用上述本發(fā)明的組合物，從而大大方便了患者和醫(yī)生。有多種類型的釋放給藥系統(tǒng)可以應(yīng)用，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本發(fā)明的其它實施方案包括制備本發(fā)明的組合物的方法，和利用所述組合物治療癌癥和變態(tài)反應(yīng)的方法。通過下列實施例和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它方面和實施方案將是顯而易見的。下列實施例只是說明性的，并非限制如所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明的方法進(jìn)行多種修改和變化。因此，本發(fā)明覆蓋對本發(fā)明的這些修改和變化，只要它們屬于所附權(quán)利要求及其等同物的范圍。本文提到的所有專利和公開文獻(xiàn)均明確地完整引用作為參考。實施例1p33-HBcAgVLP的產(chǎn)生SEQIDNO:15給出了含有來自LCMV的肽p33的HBcAg的DNA序列。p33-HBcAgVLP如下產(chǎn)生含有乙型肝炎病毒完整病毒基因組的乙型肝炎克隆pEco63購自ATCC。將編碼HBcAg的基因?qū)氡磉_(dá)載體pkk223.3(Pharmacia)的EcoRI/Hind111限制酶切位點內(nèi)，置于強tac啟動子的控制下。通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，將來源于淋巴細(xì)胞88性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的p33肽(KAVYNFATM)(SEQIDNO:80)與HBcAg的C端(l-185)通過一個三亮氨酸接頭融合。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為了良好表達(dá)而選擇的大腸桿菌K802克隆，培養(yǎng)細(xì)胞，并將其重懸浮于5ml裂解緩沖液(IOmMNa2HP04,30mMNaCl,10mMEDTA,0.25%Tween-20，pH7.0)中。添加200溶菌酶溶液(20mg/ml)。超聲處理后，添加4lilBenzonase和10mMMgCl2,懸液在室溫下孵育30分鐘，在4。C下以15000rpm離心15分鐘，保留上清液。然后，向上清液中添加20%(w/v)(0.2g/ml裂解液)硫酸銨。在冰上孵育30分鐘，并在4。C下以20,000rpm離心15分鐘后，棄去上清液，將沉淀重懸浮于2-3mlPBS中。將20mlPBS溶液上SephacrylS-400)疑膠過濾柱(AmershamPharmaciaBiotechnologyAG),將級分加樣到SDS-PAGE凝膠上，合并含有純化p33-VLP衣殼的級分。將合并的級分上羥磷灰石柱。收集流出液(含有純化的p33-VLP衣殼)，并將其加樣到還原SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行單體分子量分析。電子顯微鏡檢查按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。p33-VLP的結(jié)構(gòu)通過電子顯微鏡檢查和SDS-PAGE來分析。將重組產(chǎn)生的HBcAg野生型VLP(由HBcAg[aal-185]單體組成)和p33-VLP上SephacrylS-400凝月交過濾柱(AmershamPharmaciaBiotechnologyAG)進(jìn)行純化。合并的級分上羥磷灰石柱。收集流出液(含有純化的p33-VLP),并將其加樣到還原SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行單體分子量分析。在整個說明書中，術(shù)語p33-HBcAgVLP、HBcAg-p33VLP、p33-VLP和HBc33可以互換使用。實施例2GAVLP的克隆、表達(dá)和純化使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas)，通過反轉(zhuǎn)錄及隨后的PCR擴增步驟，從GA噬菌體中擴增GA噬菌體外殼蛋白的cDNA。該cDNA用NcoI和HindIII酶切，克隆到預(yù)先用相同的酶酶切的載體pQ(3185中，產(chǎn)生帶有GAcDNA的質(zhì)粒355.24。插入的cDNA的序列通過DNA測序來檢查。用質(zhì)粒355.24轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。基本如對于Q|3VLP所述進(jìn)行表達(dá)。用單菌落接種含20mg/L氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基，在不振搖的情況下放置過夜。次日將該接種物轉(zhuǎn)移到含有添加了1%酪蛋白氨基酸、0.2%葡萄糖和20mg/L氨節(jié)青霉素的M9培養(yǎng)基的較大搖瓶中，在振搖下孵育14-20小時。GAVLP基本如對于Q(3VLP所述分離。裂解細(xì)胞，澄清后的裂解液上SepharoseCL-4B柱(AmershamPharmacia)。洗脫液經(jīng)碌u酸銨沉淀濃縮，并上SepharoseCL-6B柱(AmershamPharmacia)再次層析。最后一步是在蔗糖梯度(20-50%w/v)或CsCl上超速離心。分離的VLP然后用20mMTris，150mMNaCl,pH8.0透析。實施例3熒光素標(biāo)記的含CpG的寡核苷酸可被包裝于BKV、HBcAg和Q(3-VLP內(nèi)在酵母中產(chǎn)生的VLP含有少量RNA，該RNA可被容易地消化，因此通過VLP與RNaseA—起孵育而除去。高活性RNaseA酶的分子量約為14kDa,它小得足以進(jìn)入VLP，從而除去不需要的核糖核酸。重組產(chǎn)生的BKVVLP(SEQIDNO:12)在PBS緩沖液pH7.2中濃縮為1mg/ml,并且在存在或不存在RNaseA(200|_ig/ml,RocheDiagnosticsLtd,Switzerland)的條件下37。C孵育3小時。在RNaseA消4匕后，向BKVVLP中添加75nmol/ml5'-熒光素標(biāo)記的硫代磷酸CpG-FAM寡核苷酸(來自SEQIDNO:34的寡核苷酸)，并在37。C下孵育3小時。隨后BKVVLP在37。C下用DNasel消化3小時(40u/mlAMPD1,Sigma,DivisonofFlukaAG,Switzerland),或者不經(jīng)DNasel消化即加樣。向樣品中加入6倍濃縮的DNA加樣緩沖液(10mMTrispH7.5，10%v/v甘油，0.4%橘黃G),在65伏電壓下在0.8%非變性tris-乙酸pH7.5瓊脂糖凝膠中電泳1小時。用溴化乙錠染色后檢測核酸，而在不含溴化乙錠時，紫外線激發(fā)使CpG-FAM中的熒光素標(biāo)記產(chǎn)生熒光。BKVVLP(15iug)在對照孵育后或在RNaseA消化并且隨后與雙鏈(ds)DNA(246bp)(SEQIDNO:17)孵育后，通過非變性0.8%瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1:未處理的BKVVLP;2:RNaseA處理的BKVVLP;3:RNaseA處理并與dsDNA—起孵育的BKVVLP;泳道M:GeneRuler1kbDNA分子量片l殳(MBIFermentasGmbH,Heidelberg,Germany)。BKVVLP(15ng)在對照孵育后或在RNaseA消化并且隨后與CpG-寡核香酸(含有磷酸或硫代磷酸酯(pt)骨架)孵育后，通過非變性0.8%瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1:BKVVLP貯存液(PBS/50M甘油)；2:未處理的BKVVLP(PBS緩沖液)；3:RNaseA處理的BKVVLP;4:RNaseA處理的BKVVLP,透析后；5:RNaseA處理的與CpG-寡核苷酸孵育的BKVVLP;6:RNaseA處理的與CpG(pt)-寡聚體孵育的BKVVLP;7:RNaseA處理的與CpG(pt)-寡聚體孵育的BKVVLP,透析后；泳道M:GeneRuler1kbDNA分子量片段(MBIFermentasGmbH,Heidelberg,Germany)。RNaseA消化使VLP的遷移改變，這在考馬斯藍(lán)染色的瓊脂糖凝膠上可見，這可能是由于RNA缺乏負(fù)電荷所致。添加CpG-寡核苷酸恢復(fù)了BKVVLP的遷移，并且產(chǎn)生與未處理的VLP中存在的RNA帶同樣遷移的熒光帶。這清楚地表明，CpG-FAM寡核苷酸已經(jīng)被包裝于VLP內(nèi)。實施例4大的雙鏈寡核苷酸可被包裝于BKVVLP內(nèi)為了導(dǎo)入雙鏈(ds)核苷酸序列，向RNaseA處理過的重組BKVVLP(實施例3)中添加50|_ig/ml(ds)DNA片段(長246bp,dsDNA,SEQIDNO:17),并在37。C下孵育3小時。向樣品中加入6倍濃縮的DNA加樣緩沖液(IOmMTrispH8.0,10%v/v甘油，0.4%橘黃G),在65伏電壓下在0.8%非變性tris-乙酸pH8.0瓊脂糖凝膠中電泳1小時。在對照孵育后或在RNaseA消化并且隨后與(ds)DNA孵育后，將BKVVLP(15pg)加樣到非變性0.8%瓊脂糖凝膠電泳中，經(jīng)溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析，以檢測RNA/DNA或蛋白質(zhì)的存在。在溴化乙錠存在下，包裝的DNA分子顯現(xiàn)為與考馬斯藍(lán)顯色的VLP帶同樣遷移的一條帶。添加(ds)DNA恢復(fù)了BKVVLP的遷移，并且產(chǎn)生與考馬斯藍(lán)染色的VLP同樣遷移的DNA帶。這清楚地表明，(ds)DNA已經(jīng)被包裝于BKVVLP內(nèi)。實施例5含CpG的寡核苷酸能夠被包裝于BKVVLP內(nèi)為了導(dǎo)入免疫刺激性CpG-寡核苷酸，向RNaseA處理過的重組BKVVLP(實施例3)中添加150nmol/ml具有磷酸二酯骨架的CpG-寡核苷酸CyCpG或具有硫代磷酸酯骨架的CyCpGpt，并在37。C下孵育3小時。使用300kDaMWCO透析膜(SpectrumMedicalindustriesInc.,Houston,USA),將用于免疫小鼠的VLP制劑用PBSpH7.2充分透析(IO,OOO倍稀釋)24小時，以除去RNaseA和過量的CpG-寡核苷酸。向樣品中加入6倍濃縮的DNA加樣緩沖液(IOmMTrispH7.5,10%v/v甘油，0.4。/o橘黃G),在65伏電壓下在0.8%非變性tris-乙酸pH7.5瓊脂糖凝膠中電泳1小時。在對照孵育后或在RNaseA消化并且隨后與CpG-寡核苷酸(具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架)孵育后，將BKVVLP(15ng)加樣到非變性0.8。/o瓊脂糖凝膠電泳中，經(jīng)溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析，以檢測RNA/DNA或蛋白質(zhì)的存在，以及透析后未結(jié)合的CpG-寡核苷酸的減少。未結(jié)合的CpG-寡核苷酸顯現(xiàn)為一條低分子量溴化乙錠染色帶。添加CpG-寡核苷酸恢復(fù)了BKVVLP的遷移，并且產(chǎn)生與考馬斯藍(lán)染色的VLP同樣遷移的DNA帶。這清楚地表明，CpG-寡核苷酸已經(jīng)被包裝于BKVVLP內(nèi)。92實施例6含CpG-寡核苷酸(磷酸骨架上有硫代磷酸修飾)的VLP誘發(fā)增強的Thl指導(dǎo)的免疫應(yīng)答雌性BALB/C小鼠(每組3只小鼠)皮下注射10|ng含硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt(SEQIDNO:34)的BKVVLP。對照小鼠皮下注射溶于200piPBSpH7.2中的10單獨的RNase處理的BKVVLP或與0.3nmol或20nmol硫代磷酸CpG-寡核香酸混合的BKVVLP，或者不予處理。BKVVLP如實施例5所述制備，并且在免疫之前通過透析從未結(jié)合的CpG-寡核苷酸中充分純化。免疫后第14天，采血，測定對BKVVLP的IgGl和IgG2a抗體應(yīng)答(見表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表1:用BKVVLP和硫代磷酸(pt)CpG-寡核苷酸免疫后第14天,小鼠對BKVVLP的IgGl和IgG2aOD50y?？贵w滴度。與用相同量(0.3nmol)的與BKVVLP混合的CpG-寡核苷酸或用單獨的BKVVLP免疫相比，用RNaseA處理的含硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt的BKVVLP免疫導(dǎo)致IgGl滴度降低和抗BKVVLPIgG2a滴度增加。用與20nmol硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt混合的BKVVLP免疫的小鼠顯示極低的IgGl滴度和高IgG2a滴度。與對照相比，IgGl滴度降低且IgG2a滴度升高，說明包裝于BKVVLP中的硫代磷酸CpG-寡核苷酸誘發(fā)了Thl細(xì)胞指導(dǎo)的免疫應(yīng)答。表1清楚地顯示，相比與CpG-寡核苦酸簡單混合的BKVVLP,含有包裝于顆粒內(nèi)的CpG-寡核苷酸的BKVVLP具有更好的效果。實施例7免疫刺激性核酸能夠被包裝于含有與抗原融合的融合蛋白的HBcAgVLP內(nèi)HBcAgVLP當(dāng)通過表達(dá)乙型肝炎核心抗原融合蛋白p33-HBcAg(HBc33)(見實施例l)或與肽PIA融合的融合蛋白(HBcPlA)而在大腸桿菌中產(chǎn)生時，它含有RNA,該RNA可被消化，因此通過VLP與RNaseA孵育將其除去?；騊IA編碼由肥大細(xì)胞瘤肺瘤細(xì)胞系P815表達(dá)的一種蛋白質(zhì)。被稱為PIA肽的顯性CTL表位與MHCI類(Ld)結(jié)合，該復(fù)合物被特異性CTL克隆識別(Brandleetal.,1998,Eur.J.Immunol.28:4010-4019)。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，使用合適的引物，通過PCR進(jìn)行肽P1A-1(LPYLGWLVF)(SEQIDNO:90)與HBcAg的C端(氨基酸185,參見實施例l)的融合。將一個三亮氨酸接頭克隆到HBcAg與肽序列之間。如實施例1所述進(jìn)行表達(dá)。HBcAg與PIA的融合蛋白被稱為HBcPlA,當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時形成衣殼，可以按類似于實施例1所述的方法進(jìn)行純化。酶RNA水解重組產(chǎn)生的HBcAg-p33(HBc33)和HBcAg-PlA(HBcPlA)VLP在lxPBS緩沖液(KCl0.2g/l，KH2P040.2g/1,NaCl8g/1:Na2HP041.15g/1)pH7.4中以1.0mg/ml的濃度，在300fig/mlRNaseA(QiagenAG,Switzerland)存在下，在恒溫混勻器中以650rpm37。C孵育3小時。免疫刺激性核酸的包裝RNA用RNaseA消化后，向HBcAg-p33VLP中補加130nmol/mlCpG-寡核苷酸B-CpG、NKCpG、G10-PO(表2)。類似地，分別以130nmol/ml或1.2nmol/ml的濃度添加150mer單鏈Cyl50-1和253mer雙鏈dsCyCpG-253,它們均含有多個拷貝的CpG基序，并在恒溫混勻器中37。C孵育3小時。通過將CyCpG的雙鏈多聚體克隆到pBluescriptKS-的EcoRV位點內(nèi)產(chǎn)生雙鏈CyCpG-253DNA。在大腸桿菌XLl-blue中產(chǎn)生并用QiagenEndofree質(zhì)粒Giga試劑盒分離獲得的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切核酸酶Xhol和Xbal消化，產(chǎn)生的限制酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳分離。253bp的插入片段通過電洗脫和乙醇沉淀分離。通過對兩條鏈進(jìn)行測序檢驗其序列。表2:實施例中使用的免疫刺激性核酸的命名和序列小寫字母表示通過硫代磷酸酯鍵連接的脫氧核苷酸，而大寫字母表示通過磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸95<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>CyCyCyTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAAT47Cyl50-1TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTGGATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCC48dsCyCpG-253(互補鏈未顯示)CTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATTCATGACTTCCTGAATAATTCCATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAAAATTCCAATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC49DNaseI處理包裝的HBcAg-p33VLP隨后在37。C下用DNaseI消化(5U/ml)3小時(DNaseI,不含RNase，F(xiàn)lukaAG,Switzerland),并用300kDaMWCO透析膜(SpectrumMedicalIndustriesInc.,Houston,USA)用PBSpH7.4充分透析(2次，透析液為200倍體積)24小時，以除去RNaseA和過量的CpG-寡核苷酸。Benzonase處理由于某些單鏈寡脫氧核香酸對DNaseI處理有部分抗性，利用Benzonase處理從制品中除去游離的寡核苷酸。在透才斤前添力口100-120U/mlBenzonase(MerckKGaA,Darmstadt,Germany)和5mMMgCl2,37。C孵育3小時。透析使用300kDaMWCO透析膜(SpectrumMedicalIndustriesInc.,Houston,US),在小鼠免疫實驗中使用的包裝有免疫刺激性核酸的VLP制劑用PBSpH7.4充分透析(2次，透析液為200倍體積)24小時，以除去添加的酶和游離的核酉臾。包裝的分析包裝的免疫刺激性核酸的釋放向50pl衣殼溶液中加入1|il蛋白酶K(600U/ml，Roche,Mannheim,Germany)、3pi10%SDS-溶液和6jil10倍蛋白酶緩沖液(0.5MNaCl,50mMEDTA,0.1MTrispH7.4),隨后在37。C下孵育過夜。VLP在該條件下完全水解。在65。C下加熱20分鐘滅活蛋白酶K。向25衣殼中加入1piRNaseA(Qiagen,100)ug/ml,稀釋250倍)。2-30衣殼與1倍體積的2x加樣緩沖液(lxTBE，42%w/v尿素，12%w/vFicoll,0.01%溴酚藍(lán))混合，95。C加熱3分鐘，加樣到10%(對于約20nt長的寡核苷酸)或15%(對于〉40mer的核酸)TBE/尿素聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上。此外，樣品也可以與6x加樣染料(10mMTrispH7.5,50mMEDTA,10%v/v甘油，0.4%橘黃G)—起加樣到1%瓊脂糖凝膠上。TBE/尿素凝膠用CYBRGold染色，瓊脂糖凝膠用溴化乙錠染色。寡核香酸B-CpG、NKCpG和G10-PO被包裝于HBc33內(nèi)。利用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝膠分析被包裝于HBc33VLP內(nèi)的B-CpG。加樣到凝膠上的是50pg下列樣品1.未處理的HBc33VLP;2.RNaseA處理的HBc33VLP;3.RNaseA處理并包裝有B-CpG98的HBc33VLP;4.RNaseA處理、包裝有B-CpG并用DNaseI處理的HBc33VLP;5.RNaseA處理、包裝有B-CpG、DNaseI處理并透析的HBc33VLP;6.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段。利用溴化乙錠染色的1.5。/。瓊脂糖凝膠分析從VLP中提取的包裝的B-CpG的量。加樣到凝月交上的是下列樣品1.0.5nmolB-CpG對照;2.0.5nmolB-CpG對照；3.酚/氯仿抽提后HBc33中的B-CpGoligo內(nèi)容物；4.酚/氯仿抽提并且用RNaseA處理后HBc33中的B-CpGoligo內(nèi)容物；5.酚/氯仿抽提并且用DNaseI處理后HBc33中的B-CpGoligo內(nèi)容物；6.空；7.MBIFermentas100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段。利用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝膠分析被包裝于HBc33VLP內(nèi)的NKCpG。加樣到凝膠上的是15|ug下列樣品1.未處理的HBc33VLP;2.RNaseA處理的HBc33VLP;3.RNaseA處理的且包裝有NKCpG的HBc33VLP;4.RNaseA處理、包裝有NKCpG、DNaseI處理并且透析的HBc33VLP;5.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段。利用CYBRGold染色的15%TBE/尿素凝膠分析從VLP中提取的包裝的NKCpG的量。加樣到凝膠上的是下列樣品1.蛋白酶K消化及RNaseA處理后HBc33中的NKCpGoligo內(nèi)容物；2.20pmolNKCpG對照；3.10pmolNKCpG對照；4.40pmolNKCpG對照。利用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝膠分析被包裝于HBc33VLP內(nèi)的gl0gacga-PO。加樣到凝膠上的是15(ig下列樣品1.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；2.未處理的HBc33VLP;3.RNaseA處理的HBc33VLP;4.RNaseA處理的且包裝有g(shù)l0gacga-PO的HBc33VLP;5.RNaseA處理、包裝有g(shù)lOgacga-PO、Benzonase處理并透析的HBc33VLP。RNaseA處理后VLP中的RNA內(nèi)容物極大地減少，而大多數(shù)衣殼以緩慢遷移的彌散帶(smear)遷移，這大概是由于除去了帶負(fù)電荷的RNA。與過量寡核苷酸一起孵育后的衣殼比RNaseA處理的衣殼含有更高含量的核酸，因此以與未處理的衣殼類似的速度遷移。另外用DNAseI或Benzonase處理能降解游離寡核苷酸，而包裝在衣殼內(nèi)的寡核苷酸不被降解，清楚地顯示了寡核苷酸的包裝。在某些情況下，在DNaseI/Benzonase處理并透析后，通過蛋白酶K消化證實寡核苷酸的包裝。利用上述方法從衣殼中釋放的寡核苷酸與用于包裝的寡核香酸大小相同，這一發(fā)現(xiàn)清楚地證實了寡核苷酸的包裝。大的單鏈寡核香酸Cyl50-1被包裝于HBc33內(nèi)。Cyl50-1含有7.5個重復(fù)的CyCpG,按照標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成方法(IBA,G6ttingen,Germany)合成。包裝于HBc33VLP內(nèi)的Cyl50-1用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。加樣到凝膠上的是15ng下列樣品1.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片革殳；2.未處理的HBc33VLP;3.RNaseA處理的HBc33VLP;4.RNaseA處理的且包裝有Cyl50陽l的HBc33VLP;5.RNaseA處理、包裝有Cyl50-1、DNaseI處理并透析的HBc33VLP;6.RNaseA處理、包裝有Cyl50-1、DNaseI處理并透析的HBc33VLP。從VLP中提取的包裝的Cyl50-1的量用SYBRGold染色的10%TBE/尿素凝膠分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1.20pmolCyl50匿l對照；2.10pmolCyl50-1對照；3.4pmolCyl50-1對照；4.4pgHBc33在與1倍體積的TBE/尿素樣品緩沖液95。C孵育3分鐘后的Cyl50-1oligo內(nèi)容物。衣殼中的RNA內(nèi)容物在RNaseA處理后極大減少，而大多數(shù)衣殼以緩慢遷移的彌散帶遷移。衣殼用4倍體積的水稀釋，并濃縮到1mg/ml。與過量的Cyl50-1孵育后，衣殼含有大量核酸，因此以類似于未處理衣殼的速度遷移。另外用DNaseI處理能降解游離的、未包裝的寡核苷酸，而衣殼內(nèi)的寡核苷酸不被降解。在TBE/尿素加樣緩沖液中95。C加熱3分鐘從包裝的VLP中釋放出DNaseI抗性的核酸，這表明存在150mer。寡核苷酸NKCpGpt也被包裝于HBcPlA內(nèi)。被包裝于HBcPlAVLP內(nèi)的NKCpGpt用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝膠來分析。加樣到凝膠上的是15ng下列樣品1.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；2.未處理的HBcPlAVLP;3.RNaseA處理的HBcPlAVLP;4.RNaseA處理的且包裝有NKCpGpt的HBcPlAVLP。100RNase處理減少了核酸內(nèi)容物，并使衣殼的遷移減'f曼。添加NKCpGpt恢復(fù)了衣殼中的核酸內(nèi)容物并使遷移變快。實施例8免疫刺激性核酸能夠被包裝到與抗原偶聯(lián)的HBcAg-wt內(nèi)重組產(chǎn)生的HBcAg-wtVLP在與來自淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的肽p33(CGG-KAVYNFATM)(SEQIDNO:81)偶聯(lián)后被包裝。為了偶聯(lián)，HBcAg-wtVLP(2mg/ml)在恒溫混勻器中用25x摩爾過量的SMPH(琥珀酰亞胺基-6-[((3-馬來酰亞氨基-丙酰氨基)己酸],Pierce)25。C衍化1小時。使用MWCO10,000kD透析膜，將衍化的VLP在4。C下用Mes緩沖液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)pH7.4透析2次各2小時。隨后在恒溫混勻器中25。C孵育2小時，在此期間VLP(50|aM)與p33肽(250)iiM)的N端半胱氨酸偶聯(lián)。樣品用IxPBSpH7.4充分透析(MWCO300,000),以除去不需要的游離肽。用SMPH衍化并與p33肽偶聯(lián)的HBcAg-wtVLP通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。樣品通過16%SDS-PAGE經(jīng)考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1.NEB預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，寬范圍(#7708S),10pi;2.p33肽；3.SMPH衍化的HBcAg-wtVLP，透析前；4.SMPH衍化的HBcAg-wtVLP,透析后；5.與p33偶聯(lián)的HBcAg-wtVLP,上清液；6.與p33偶聯(lián)的HBcAg-wtVLP,沉淀。HBcAg-wt顯現(xiàn)為一條21kD蛋白帶。由于SMPH的分子量低，衍化產(chǎn)物僅僅略微增大，不能通過SDS-PAGE鑒別。單獨的肽顯現(xiàn)為一條3kD條帶，而被稱為HBx33的偶聯(lián)產(chǎn)物在約24kD處顯示第二條強條帶，占總HBcAg-wt的50%以上。酶RNA水解在RNaseA(300叫/ml,QiagenAG,Switzerland)存在下，用4倍體積的H20稀釋HBx33VLP(0.5-1.0mg/ml,IxPBS緩沖液pH7.4)，使鹽濃度降低至0.2xPBS的終濃度，并在恒溫混勻器中以650rpm37。C孵育3小時。免疫刺激性核酸的包裝RNaseA消化后，用MilliporeMicrocon101或Centriplus濃縮器濃縮HBx33VLP,然后添加130nmol/mlCpG-寡核苷酸B-CpGpt,在恒溫混勻器中在0.2xPBSpH7.4中37。C孵育3小時。隨后，反應(yīng)混合物在37。C下用DNaseI(5U/ml)消化3小時(DNaseI，不含RNase,FlukaAG,Switzerland).使用300kDaMWCO透才斤月莫(SpectrumMedicalIndustriesInc.,Houston,USA),將用于免疫小鼠的VLP制劑用PBSpH7.4充分透析(2次，透析液為200倍體積)24小時，以除去RNaseA和過量的CpG-寡核苷酸。用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝月交分析被包裝于HBx33VLP內(nèi)的B-CpGpt。加樣到凝膠上的是50pg下列樣品1.未處理的HBx33VLP;2.RNaseA處理的HBx33VLP;3.RNaseA處理且包裝有B-CpGpt的HBx33VLP;4.RNaseA處理、包裝有B-CpGpt并用DNaseI處理的HBx33VLP;5.RNaseA處理、包裝有B-CpGpt、DNaseI處理并透析的HBx33VLP;6.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段。顯示RNase處理減少了衣殼的核酸內(nèi)容物，并且減慢了它們的遷移。添加B-CpGpt可恢復(fù)衣殼的核酸內(nèi)容物并J吏其遷移加快。DNasel僅消化游離寡核苷酸，而包裝的寡核苷酸在透析后仍保留在VLP中。實施例9免疫刺激性核酸能夠被包裝于與抗原偶聯(lián)的Q(3VLP內(nèi)p33肽與QPVLP的偶聯(lián)重組產(chǎn)生的RNA噬菌體Qb的病毒樣顆粒(QPVLP)不經(jīng)處理即使用，或者在與含有N端CGG和/或C端GGC延伸(CGG-KAVYNFATM(SEQIDNO:81)和KAVYNFATM-GGC(SEQIDNO:82))的p33肽偶聯(lián)后使用。重組產(chǎn)生的Q(3VLP在25。C下用10倍摩爾過量的SMPH(Pierce)衍化0.5小時，隨后在4。C下用20mMHEPES,150mMNaCl,pH7.2透析，以除去未反應(yīng)的SMPH。添加5倍摩爾過量的肽，并且在30%乙腈存在下在恒溫混勻器中25。C反應(yīng)2小時。利用SDS-PAGE經(jīng)考馬斯藍(lán)染色分析與QbVLP偶聯(lián)的p33。加樣到凝膠上的是下列樣品(A)l.NEB預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，寬范圍(弁7708S),10|ul;2.QbVLP，143.SMPH衍化的QbVLP,透析后；4.與CGG-p33偶聯(lián)的QbVLP,上清液。(B)l.NEB預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，寬范圍(弁7708S),10^1;2.QbVLP,10pg;3.與GGC-p33偶聯(lián)的QbVLP,上清液。SDS-PAGE分析證明了由一個、兩個或三個與Q(3單體偶聯(lián)的肽組成的多偶聯(lián)帶。為了簡單起見，尤其在實施例部分中，將肽p33與QPVLP的偶聯(lián)產(chǎn)物稱為Qbx33。當(dāng)Q(3VLP通過表達(dá)噬菌體Q|3衣殼蛋白在大腸桿菌中產(chǎn)生時，它含有RNA，該RNA能被消化，因此通過VLP與RNaseA孵育除去。低離子強度和低Q|3濃度使RNaseA水解QPVLP中的RNA:在20mMHepes/150mMNaCl緩沖液(HBS)pH7.4中濃度為1.0mg/ml的Q(3VLP,通過添加RNaseA(300pg/ml,QiagenAG,Switzerland)直接消化，或者用4倍體積的H20稀釋至終濃度為0.2xHBS，然后與RNaseA(60|ig/ml，QiagenAG，Switzerland)—起孵育。孵育在恒溫混勻器中以650rpm37。C進(jìn)行3小時。用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的1%瓊脂糖凝膠分析在低及高離子強度下RNaseA對QbVLP中RNA的水解。加樣到凝膠上的是下列樣品(A,B)l.MBIFermentaslkbDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；2.未處理的QbVLP;3.在lxHBS緩沖液pH7.2中用RNaseA處理的QbVLP。(C，D)1.MBIFermentaslkbDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；2.未處理的QbVLP;3.在0.2xHBS緩沖液pH7.2中用RNaseA處理的QbVLP。證實在lxHBS中只觀察到極弱的RNA內(nèi)容物的減少，而在0.2xHBS中大多數(shù)RNA均水解。與之一致的是，向lxHBS中添加RNaseA后衣殼的遷移不改變，而向0.2xHBS中添加RNase后遷移減慢。低離子強度增加核酸在QPVLP中的包裝在0.2xHBS中RNaseA消化后，用MilliporeMicrocon或Centriplus濃縮器將Qf3VLP濃縮至1mg/ml，其等份樣品用lxHBS或0.2xHBS透析。向QPVLP中添加130nmol/mlCpG-寡核苷酸B-CpG,在恒溫混勻器中37。C孵育3小時。隨后，在37。C下用Benzonase(100U/ml)消化Q(3VLP3小時。利用1%瓊脂糖凝膠經(jīng)溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色分析樣品。加樣到凝膠上的是下列樣品1.未處理的QbVLP;2.RNaseA處理的QbVLP;3.RNaseA處理、在0.2xHBS緩沖液pH7.2中包裝B-CpG并用Benzonase處理的QbVLP;4.RNaseA處理、在1xHBS緩沖液pH7.2中包裝B-CpG并用Benzonase處理的HBx33VLP(見實施例12)。在lxHBS中只有極少量的寡核苷酸能被包裝，而在0.2xHBS中可檢測到強溴化乙錠染色帶，該條帶與衣殼的考馬斯藍(lán)染色位置重疊。不同免疫刺激性核酸能夠被包裝于Q|3和Qbx33VLP中在0.2xHBS中RNaseA消化后，用MilliporeMicrocon或Centriplus濃縮器將Q卩VLP或Qbx33VLP濃縮至1mg/ml,并添加130nmol/mlCpG-寡核苦酸B-CpGpt、glOgacga和253merdsCyCpG-253(表2),并在恒溫混勻器中37。C孵育3小時。隨后，在37。C下用DNaseI(5U/ml)或Benzonase(100U/ml)消化Q(3VLP或Qbx33VLP3小時。利用1%瓊脂糖凝膠經(jīng)溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色后分析樣品。加樣到凝膠上的是50pg下列樣品1.未處理的Qbx33VLP;2.RNaseA處理的Qbx33VLP;3.RNaseA處理并包裝有B-CpGpt的Qbx33VLP;4.RNaseA處理、包裝有B-CpGpt、DNaseI處理并透析的Qbx33VLP;5.1kbMBIFermentasDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段。(C)顯示利用CYBRGold染色的15%TBE/尿素凝膠對從VLP中提取的包裝oligo的量所進(jìn)行的分析。加樣到凝膠上的是下列樣品1.蛋白酶K消化和RNaseA處理后2)ngQbx33VLP中的B-CpGptoligo內(nèi)容物；2.20pmolB-CpGpt對照；3.10pmolB-CpGpt對照；4.5pmolB-CpGpt對照。加樣到另一塊凝膠上的是15)ag下列樣品1.MBIFermentas1kbDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；2.未處理的Qbx33VLP;3.RNaseA處理的Qbx33VLP;4.RNaseA處理并包裝有g(shù)l0gacga-PO的Qbx33VLP;5.RNaseA處理、包裝有g(shù)l0gacga-PO、Benzonase處理并透析的Qbx33VLP。加樣到第三塊凝膠上的是15fig下列樣品1.MBIFermentas1kbDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；2.未處理的Qbx33VLP;3.RNaseA處理的Qbx33VLP;4.RNaseA處理、包裝有dsCyCpG-253并用DNaseI處理的Qbx33VLP;5.RNaseA處理、包裝有dsCyCpG-253、用DNaseI處理并透析的Qbx33VLP。不同的核酸B-CpGpt、glOgacga和253merdsDNA能夠被包裝于Qbx33內(nèi)。包裝的核酸對DNaseI消化有抗性，在透析過程中保持包裝狀態(tài)。通過蛋白酶K消化釋放核酸，隨后進(jìn)行瓊脂糖電泳和溴化乙4走染色，來證實B-CpGpt的包裝。實施例10AP205的解裝配-純化-重裝配和免疫刺激性核酸的包裝A.AP205VLP的解裝配，以及由在不添加寡核苷酸的條件下能夠重裝配的材料重裝配解裝配40mg凍干純化的AP205VLP(SEQ-ID:80或81)溶解于4ml6MGuHCl中，4。C孵育過夜。解裝配混合物以8000rpm離心(Eppendorf5810R,固定角轉(zhuǎn)頭F34-6-38,在下列所有步驟中使用)。將沉淀溶解于7M尿素中，上清液用NET緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.8,5mMEDTA,150mMNaCl)透析3天，其中更換3次緩沖液。另外，也以連續(xù)方式透析4天。透析過的溶液以8000rpm離心20分鐘，將沉淀溶解于7M尿素中，上清液用硫酸銨(60%飽和)沉淀，并溶解于含有10mMDTT的7M尿素緩沖液中。合并溶解于7M尿素中的上述所有沉淀，用硫酸銨(60。/。飽和)沉淀，并且再溶解于含有10mMDTT的7M尿素緩沖液中。合并溶解于含有10mMDTT的7M尿素緩沖液中的物質(zhì)，上SephadexG75柱，該柱用含有10mMDTT的7M尿素緩沖液平衡并以2ml/h的流速洗脫。從柱上洗脫下一個峰。以3ml收集級分。合并含有AP205外殼蛋白的峰級分，用硫酸銨(60%飽和)沉淀。以8000rpm離心20分鐘分離沉淀。將沉淀溶解于7M尿105素，10mMDTT中，上短Sepharose4B柱(1.5x27cmSepharose4B,2ml/h，7M尿素，10mMDTT作為洗脫緩沖液)。從該柱上主要洗脫下一個峰，其含有一個小肩部。含有AP205外殼蛋白的級分通過SDS-PAGE鑒定，合并，除去肩部。獲得10.3ml樣品。通過分光光度法測定稀釋25倍的蛋白質(zhì)等份，使用下列公式來估計蛋白質(zhì)濃度(1.55xOD280—0.76xOD260)x體積。平均濃度為1nmol/mlVLP(2.6mg/ml)。280nm與260nm處的吸光度之比為0.12/0.105。重裝配向樣品中加入1.1mip-巰基乙醇，建立下列重裝配反應(yīng)體系1mlAP205外殼蛋白，不含核酸1mlAP205外殼蛋白，rRNA(約200OD260單位，lOnmol)9mlAP205外殼蛋白，CyCpG(370pl225pmol/^il溶液，即83nmol)。這些混合物用30ml含10%J3-巰基乙醇的NET緩沖液透析1小時。不含核酸的混合物分開透析。然后以連續(xù)方式繼續(xù)透析3天，更換11NET緩沖液。反應(yīng)混合物隨后用水充分透析(更換5次緩沖液)，并凍干。將其再溶解于水中，用電子顯微鏡(EM)分析。所有混合物均含有衣殼，表明AP205VLP重裝配不依賴于可檢測的核酸的存在，如同利用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色所測定的。EM程序如下蛋白質(zhì)懸液吸附到覆蓋碳-聚醋酸曱基乙烯脂(formvar)的網(wǎng)格上，用2。/o磷鴒酸(pH6.8)染色。用JEM100C(JEOL,日本)電子顯微鏡以80kV的加速電壓4全查該網(wǎng)格。在Kodak電子成像膠片上進(jìn)行照相記錄(負(fù)片)，在KodakPolymax相紙上洗印負(fù)片獲得電子顯微照片。在CyCpG存在下重裝配的VLP通過Sepharose4B柱(lx50cm)純化，用NET緩沖液洗脫(lml/h)。級分通過Ouchterlony試驗分析，并合并含有VLP的級分。獲得8ml樣品，用水透析脫鹽，干燥。衣殼產(chǎn)量為10mg。用0.6%瓊脂糖凝膠經(jīng)溴化乙錠染色分析溶解物質(zhì)，結(jié)果表明衣殼不含核酸。在重裝配步驟之后和充分透析之前采集的含CyCpG的重裝配反應(yīng)樣品用0.6%瓊脂糖凝膠經(jīng)溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色分析。能夠獲得遷移高度與完整的AP205VLP相同并且能夠用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色的一條帶，表明含有寡脫氧核苷酸的AP205VLP已經(jīng)被重裝配。重裝配程序后的充分透析步驟可能導(dǎo)致寡脫氧核苷酸擴散到VLP之外。值得注意的是，如利用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳所測定的，在不含可4全測的寡脫氧核苷酸的條件下，AP205VLP也能被重裝配。因此，在最初的VLP解裝配、從核酸中純化解裝配的外殼蛋白以及隨后VLP在寡脫氧核苷酸存在下重裝配后，寡脫氧核苷酸能夠與AP205VLP成功結(jié)合。B.使用在不添加寡核苷酸的條件下不能重裝配的解裝配材料重，酉己AP205VLP解裝配100mg純化并干燥的重組AP205VLP如上所述解裝配。所有步驟都基本如部分A的解裝配所述進(jìn)行，只是使用8M尿素溶解碌u酸銨沉淀步驟的沉淀物，并且省去了重裝配之前使用CL-4B柱的凝膠過濾步驟。通過光譜測定，使用部分A所述公式計算，合并的SephadexG-75柱級分含有21mg蛋白質(zhì)。樣品的280nm吸光度與260nm吸光度之比為0.16:0.125。樣品稀釋50倍進(jìn)行測定。重裝配SephadexG-75凝膠過濾純化步驟獲得的蛋白質(zhì)制品用60%飽和的硫酸銨沉淀，獲得的沉淀物溶解于2ml7M尿素，10mMDTT中。樣品用含10%卩-巰基乙醇的8mlNET緩沖液稀釋，用40ml含10%P-巰基乙醇的NET緩沖液透析1小時。通過向透析袋內(nèi)的蛋白質(zhì)樣品中添加0.4mlCyCpG溶液(109nmol/ml)啟動重裝配。建立連續(xù)模式的透析，NET緩沖液用作洗脫液。繼續(xù)透析2天，在完成該透析步驟后采集樣品進(jìn)行EM分析。透析過的重裝配溶液隨后用含50%v/v甘油的NET緩沖液透析，以實現(xiàn)濃縮。透析一天后更換一次緩沖液。透析繼續(xù)進(jìn)行總共3天。通過在Sepharose4-B柱(lx60cm)上用NET緩沖液以lml/h的流速進(jìn)行凝膠過濾，來純化透析并濃縮的重裝配溶液。級分用Ouchterlony試驗檢測，并且對含衣殼的級分進(jìn)行干燥，將其重懸浮于水中，并在用20mMHepespH7.6平衡的4-B柱上重新層析。使用下107x體積-3.((OD228.5nm-OD234.5nm)x0.37)x體積才企測到6-26mg重裝配VLP的蛋白質(zhì)含量。重裝配的AP205VLP通過如上所述的EM、瓊脂糖凝膠電泳和非還原條件下的SDS-PAGE進(jìn)行分析。解裝配材料的EM分析顯示，用鹽酸胍處理AP205VLP從根本上破壞了VLP的衣殼裝配。該解裝配材料與寡核普酸的重裝配產(chǎn)生衣殼，衣殼通過凝膠過濾純化并進(jìn)一步富集。獲得兩種大小的顆粒；在電子顯微照片上可見直徑約25nm的顆粒和較小的顆粒。沒有寡核苦酸時無法獲得重裝配。將重裝配的顆粒加樣到瓊脂糖電泳上，顯示重裝配的顆粒含有核酸。通過酚抽提提取核酸內(nèi)容物，隨后將其加樣到瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，顯示該顆粒含有用于重裝配的寡核香酸。通過將該寡核苷酸樣品與從顆粒中提取的核酸物質(zhì)從左到右加樣，確定包裝的寡核苷酸的特性。已經(jīng)加樣了重裝配的AP205VLP并且已用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠再用考馬斯藍(lán)染色，顯示該顆粒的寡核苷酸內(nèi)容物與蛋白質(zhì)內(nèi)容物共遷移，表明寡核苷酸已經(jīng)被包裝到顆粒中。加樣到凝膠上的樣品是未處理的AP205VLP,含有不同含量的與CyCpG重裝配并純化的AP205VLP的3個樣品，未處理的QPVLP。向SDS-PAGE凝膠上加樣重裝配的AP205VLP,在不含還原劑的條件下電泳，證實重裝配的顆粒已經(jīng)形成二硫鍵，如同未處理的AP205VLP—樣。而且，二碌b4定才莫式也與未處理的顆粒相同。加樣到SDS凝膠上的樣品是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，未處理的野生型Q|3,重裝配的野生型Q(3，未處理的AP205VLP,重裝配的AP205VLP。AP205VLP亞單位的分子量是14.0kDa，而Q|3亞單位的分子量為14.3kDa(這兩個分子量都是根據(jù)N端曱硫氨酸計算出來的)。C.p33表位(序列H2N-KAVYNFATMGGC-COOH,含游離N端和C端(SEQIDNO:82))與同CyCpG重裝配的AP205VLP的偶聯(lián)如部分B所述獲得的重裝配AP205VLP,在20mMHepes,150mMNaCl,pH7.4中，以1.4mg/ml的濃度與5倍過量的由50mMDMSO貯存液稀釋而成的交聯(lián)劑SMPH在15。C下反應(yīng)30分鐘。獲得的所謂書亍化AP205VLP用至少1000倍體積的20mMHepes,150mMNaCl，pH7.4緩沖液透析2次各2小時。衍化的AP205以1mg/ml的濃度與2.5倍或5倍過量的由20mMDMSO貯存液稀釋而成的肽在15。C下反應(yīng)2小時。樣品隨后在液氮中驟凍用于貯存。偶聯(lián)反應(yīng)通過SDS-PAGE分析。加樣到凝膠上的是下列樣品蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；衍化的AP205VLP(d);與2.5倍過量的肽偶聯(lián)的AP205VLP，上清液(s);與2.5倍過量的肽偶聯(lián)的AP205VLP,沉淀物(p);與5倍過量的肽偶聯(lián)的AP205VLP,上清液(s);與5倍過量的肽偶聯(lián)的AP205VLP,沉淀物(p)。偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果顯示，在偶聯(lián)反應(yīng)中使用5倍過量的肽比使用2.5倍過量的肽能夠達(dá)到更高的偶聯(lián)程度。實施例11VLP的RNA內(nèi)容物的非酶水解和免疫刺激性核酸的包裝VLP核酸內(nèi)容物的ZnS04依賴的降解溶于20mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl中的5mgQ(3VLP(通過Bradfold分析測定)在SnakeSkin折疊透析管(Pierce,貨號68035)中在4。C下用2000ml50mMTrisHClpH8.0，50mMNaCl,5%甘油,10mMMgCl2或2000ml4mMHEPES,pH7,4,30mMNaCl透析2小時。每種透析緩沖液均更換一次，在4。C下再繼續(xù)透析16小時。透析過的溶液以14000rpm澄清10分鐘(Eppendorf5417R,固定角轉(zhuǎn)頭F45-30-11，在下列所有步驟中使用)，再次通過Bradfold分析測定蛋白質(zhì)濃度。溶于50mMTrisHClpH8.0,50mMNaCl,5%甘油，10mMMgCl2中的Q(3VLP用相應(yīng)緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)終濃度為1mg/ml,而溶于4mMHEPESpH7.4,30mMNaCl中的QPVLP用相應(yīng)緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)終濃度為0.5mg/ml。這種含衣殼的溶液在4。C下以14OOOrpm再次離心IO分鐘。上清液與加至2.5mM終濃度的ZnS04添在Eppendorf恒溫混勻器裝置中以550rpm60。C孵育24小時。24小時后溶液以14000rpm澄清IO分鐘，棄去沉淀。ZnS04依賴的核酸降解效率通過瓊脂糖凝月交電泳證實。上清液在4。C下用5000ml4mMHEPESpH7.4,30mMNaCl透析2小時。更換一次5000ml緩沖液，在4。C下繼續(xù)透析過夜。透析過的溶液在4。C下以14000rpm澄清10分鐘，棄去微小的沉淀物，上清液的蛋白質(zhì)濃度通過Bradfold分析測定。以氯化銅/二氮雜菲/過氧化氫處理衣殼獲得類似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知用于水解RNA的備選的非酶方法。通過瓊脂糖凝膠電泳分析ZnS04處理的Q(3VLP:從大腸桿菌中純化并用緩沖液1(50mMTrisHClpH8.0，50mMNaCl，5%甘油，10mMMgCl2)或緩沖液2(4mMHEPESpH7.4,30mMNaCl)透析的Q(3VLP在存在或不存在2.5mM硫酸鋅(ZnS04)的條件下60。C孵育24小時。該處理后，等量指定樣品(5貼蛋白質(zhì))與加樣染料混合，加樣到0.8%瓊脂糖凝膠上。電泳后，凝膠用溴化乙錠染色。用ZnS04處理VLP導(dǎo)致核酸內(nèi)容物降解，而假處理的對照不受影響。將寡脫氧核苷酸包裝于ZnS04處理的VLP內(nèi)寡脫氧核苷酸的包裝使用ZnS04處理且透析過的QP衣殼，其蛋白質(zhì)濃度(通過Bradfold分析測定)為0.4mg/ml-0.9mg/ml(分別對應(yīng)于159nM和357.5nM的衣殼濃度)。加入相對于Q|3VLP衣殼300倍摩爾過量的寡脫氧核苷酸，在Eppendorf恒溫混勻器中以550rpm37。C孵育3小時。3小時后反應(yīng)液在4。C下以14000rpm離心10分鐘。上清液在MWCO300000的Spectra/PorCEDispo透析器(Spectrum,貨號135526)中在4。C下用5000ml20mMHEPESpH7.4,150mMNaCl透析8小時。更換一次5000ml緩沖液，在4。C下繼續(xù)透析過夜。透析過的樣品的蛋白質(zhì)濃度通過Bradfold分析測定。QP衣殼及其核酸內(nèi)容物如實施例7和9所述分析。寡脫氧核苷酸向ZnS04處理的VLP內(nèi)的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。以2.5mM硫酸鋅(+ZnS04)處理的Q(3VLP用4mMHEPESpH7.4,30mMNaCl透析，并且與過量的寡脫氧核苷酸37。C孵育3小時(由于透析，ZnS04的濃度降低106數(shù)量級，因此只在括號中標(biāo)明)。在寡脫氧核苷酸存在下孵育后，等量的指定樣品(5ng蛋白質(zhì))與加樣染料混合，加樣到0.8%瓊脂糖凝膠上。電泳后，凝膠用溴化乙錠染色。與從大腸桿菌中純化的未處理的QP衣殼相比，向ZnS04處理的Q(3VLP中添加寡脫氧核苷酸能夠恢復(fù)這樣處理的衣殼的電泳行為。ZnS04和寡脫氧核苷酸處理的QPVLP的核酸內(nèi)容物通過Benzonase和蛋白酶K消化和聚丙烯酰胺TBE/尿素凝膠電泳來分析如上所述，將寡脫氧核苷酸包裝于ZnS04處理的QPVLP內(nèi)。按照使用說明用25|ilBenzonase(Merck,貨號1.01694.0001)消化25嗎該VLP。在熱滅活核酸酶后(8(TC30分鐘)，按照使用說明用蛋白酶K(酶的終濃度為0.5mg/ml)處理VLP。3小時后，將Benzonase和蛋白酶K消化的等量2ngQPVLP與TBE-尿素樣品《爰沖液混合，并加樣到15%聚丙烯酰胺TBE-尿素凝膠(Novex⑧，Invitrogen,貨號EC6885)上。加于第2泳道的衣殼在li沖液1(見上文)存在下用2.5mMZnS04處理，而加于第3泳道的衣殼在緩沖液2(見上文)存在下用2.5mMZnS04處理。將用于重裝配反應(yīng)的1pmol、5pmol和10pmol寡脫氧核苷酸加樣到同一凝膠上(泳道4-6)作為定性及定量標(biāo)準(zhǔn)。作為對照，從大腸桿菌中純化的QP衣殼進(jìn)行完全相同的處理，并在同一塊聚丙烯酰胺TBE-尿素凝膠上進(jìn)行分析(泳道1)。完成電泳后，將凝膠固定，平衡至中性pH,用SYBR-Gold(MolecularProbes,貨號S-11494)染色。完整的QPVLP(從大腸桿菌中純化)不含與從ZnS04和寡脫氧核苷酸處理的QP衣殼中提取的大小相似的核酸。另外，從后一種VLP中分離的核酸與重裝配反應(yīng)中使用的寡脫氧核苷酸共遷移。該結(jié)果證實，所用的寡脫氧核苷酸被包裝于ZnS04處理的Q(3衣殼內(nèi)。實施例12向VLP內(nèi)包裝免疫刺激性核酸后抗原性肽的偶聯(lián)RNaseA和ZnS04介導(dǎo)的VLP核酸內(nèi)容物的降解QPVLP如實施例9所述在低離子強度條件下(20mMHepespH7.4或4mMHepes,30mMNaCl,pH7.4)用RNaseA處理。類似地處理如實施例2、3、7、10所述的其它VLP,即GA、BKV、HBcAg和AP205。此外，QPVLP和AP205VLP也在如實施例11所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4或4mMHepes，30mMNaClpH7.4)下用ZnS04處理。在Eppendorf恒溫混勻器中，溶于20mMHepespH7.4或20mMHepes,1mMTris，pH7.4中的AP205VLP(1mg/ml)在50。C和550rpm下用2.5mMZnS04處理48小時。Q|3和AP205VLP樣品如實施例11所述澄清，上清液在10,000MWCOSpectra/Por⑧透析管(Spect讓,貨號128118)中在4。C下首先用2L20mMHepes,pH7.4透析2小時，然后在更換緩沖液后透析過夜。如實施例ll所述，在透析后澄清樣品，通過Bradford分析測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將ISS包裝到RNaseA和ZnS04處理的VLP內(nèi)在RNA水解和透析后，QP和AP205VLP(1-1.5mg/ml)與每mlVLP130|ulCpG寡核苦酸(NKCpG,G10-PO-參見表2;G3-6，G8-8-參見表3;在10mMTrispH8中的1mM寡核苷酸貯存液)混合。樣品在恒溫?fù)u床上以650rpm37。C孵育3小時。隨后在透析前，在2mMMgCl2存在下，用125UBenzonase/mlVLP(MerckKGaA，Darmstadt,德國)處理樣品，并37。C孵育3小時。樣品在4。C下在300,000MWCOSpectra/Por⑧透析管(Spectrum,貨號131447)中用20mMHepes,pH7.4透析2小時，更換緩沖液后用相同緩沖液透析過夜。透析后，樣品如實施例11所述澄清，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析來測定。免疫原性肽與包裝有ISS的VLP的偶聯(lián)包裝有ISS的QpVLP與含有C端GGC延伸(KAVYNFATM-GGC)(SEQIDNO:82)的p33肽偶聯(lián)，產(chǎn)生被稱為Qb-ISS-33VLP的QPVLP。包裝的QPVLP在20mMHepes,pH7.4中用IO倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25°C下衍化0.5小時，然后在4°C下用20mMHEPES,112pH7.4透析兩次各2小時，以除去未反應(yīng)的SMPH。向透析過的衍化混合物中加入5倍摩爾過量的肽，使之在恒溫混勻器中25。C反應(yīng)2小時。樣品在300,000MWCOSpectra/Por⑧透析管中用20mMHepes,pH7.4在4。C下透析2小時，并在更換緩沖液后，用相同緩沖液透析過夜。透析后，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析來測定。肽p33與Q(3的偶聯(lián)在16%PAGETris-甘氨酸凝膠(Novex⑧，Invitrogen,貨號EC64952)上通過SDS-PAGE分析，其中使用含有2%SDS和(3-巰基乙醇或DTT的樣品緩沖液。如實施例7所述，包裝在1%瓊脂糖凝膠上分析，并且在蛋白酶K消化后在TBE/尿素凝膠上分析。對如上所述的包裝有G8-8寡核苷酸的AP205VLP(1.24mg/ml)進(jìn)行衍化，并且與含有N端C延伸的MelanA16-35A/L(cGHGHSYTTAEELAGIGILTV)(SEQIDNO:55)偶聯(lián)，產(chǎn)生AP205-G8-8誦MelanAVLP。AP205VLP(包裝有G8陽8)在20mMHepes，pH7.4中用20倍摩爾過量的SMPH25。C衍化0.5小時，然后在4。C下用20mMHEPES,pH7.4透析兩次，以除去未反應(yīng)的SMPH。向透析過的衍化混合物中加入10倍摩爾過量的肽，使之在恒溫混勻器中25。C反應(yīng)2小時。樣品在4。C下在10,000MWCO透析管中用20mMHepespH7.4透析2小時，并且在更換緩沖液后用相同的緩沖液透才斤過夜。透析后，樣品如實施例11所述澄清，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析來測定。肽MelanA16-35A/L與AP205的偶聯(lián)效率在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上通過SDS-PAGE分析。包裝于AP205內(nèi)的G8-8寡核苷酸利用1%瓊脂糖凝膠分析，并且如實施例7所述在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝膠分析AP205-G8-8-MelanA16-35A/L中G8-8寡核苷酸的量。RNAseA和ZnS04處理的Q(3VLP在與p33肽偶聯(lián)之前及之后與NKCpG的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳加以分析。含有NKCpG寡核苷酸并且隨后與p33肽偶聯(lián)的QPVLP被稱為Qb-NKCpG-33VLP。在1%瓊脂糖凝膠上，在溴化乙錠染色的凝膠上可見的熒光帶與在考馬斯藍(lán)染色的凝膠上可見的蛋白帶共遷移，證明了包裝。因此，在包裝后，RNaseA和ZnS04處理的Q(3VLP在與p33肽偶聯(lián)之前及之后都含有NKCpG寡核苷酸。p33肽的偶聯(lián)效率仍然保持，這可以根據(jù)在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析后可見的多偶聯(lián)產(chǎn)物來判斷，這些產(chǎn)物顯現(xiàn)為比殘余的不與肽反應(yīng)的Q(3VLP亞單位單體遷移更慢的條帶。包裝效率可以根據(jù)TBE/尿素凝膠的分析，通過比較包裝的Qb-NKCpG-33泳道中的寡核苷酸信號與加樣到同一塊凝膠上的寡核苦酸標(biāo)準(zhǔn)的信號來估計。包裝的NKCpG的量為1-4nmo1/100ngQb曙NKCpG誦33VLP。G8-8寡核香酸向Q(3VLP內(nèi)的包裝以及隨后與p33肽的偶聯(lián)通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。含有G8-8寡核苷酸并且隨后與p33肽偶聯(lián)的QPVLP被稱為Qb-G8-8-33VLP。包裝有G8-8的QPVLP的溴化乙錠染色在溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上可以看到。溴化乙錠熒光帶與在隨后用考馬斯藍(lán)染色的同一塊凝膠上可見的QPVLP蛋白帶共遷移，證明了包裝。通過在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析，估計偶聯(lián)效率為30%。Qb-G8-8-33VLP的G8-8含量的分析在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行，其中包裝的寡核苷酸的量約為1nmol/100|_igQb-G8隱8-33VLP。G8-8寡核苷酸向AP205VLP內(nèi)的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳分析。包裝有G8-8的AP205VLP的染色在溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上可見。在隨后用考馬斯藍(lán)染色的同一凝膠上檢測到的AP205VLP蛋白帶的共遷移證明了包裝。與MelanA16-35A/L肽的偶聯(lián)效率可以根據(jù)在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行的SDS-PAGE分析來估計，其中可見多偶聯(lián)帶，它們的遷移慢于殘余的不與該肽反應(yīng)的AP205VLP單體亞單位。將偶聯(lián)效率與獲得的Qb-G8-8-33VLP的偶聯(lián)效率相比較。與MelanA16-35A/L偶聯(lián)后對AP205VLP的G8-8寡核苷酸內(nèi)容物的分析可以在TBE/尿素凝膠電泳上看到。實施例13向VLP內(nèi)包裝側(cè)翼為鳥苷的免疫刺激性寡核苷酸Qbx33VLP(與肽p33偶聯(lián)的QpVLP,參見實施例9)在如實施例9所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4)下用RNaseA處理，以水解Qbx33VLP的RNA內(nèi)容物。用20mMH印es,pH7.4透析后，Qbx33VLP與側(cè)翼為鳥苷的寡核苷酸(表2:G10-PO;表3:G3-6，G7-7,G8-8,G9-9或G6,來自在10mMTrispH8中的1mM貯存液)混合，并如實施例12所述孵育。隨后，Qbx33VLP用Benzonase處理，并在300,000MWCO管中透析。含oligosG7-7、G8-8和G9-9的樣品充分透析3天，其中更換4次緩沖液，以除去游離的oligo。如實施例7所述，利用1%瓊脂4唐凝膠、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。表3.在實施例中使用的免疫刺激性核酸的序列ISS名稱5'-3'序列SEQIDNOGACGATCGTC1G3-6GGGGACGATCGTCGGGGGG2G4-6GGGGGACGATCGTCGGGGGGG5-6GGGGGGACGATCGTCGGGGGG4G6-6GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG5G7-7GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG6G8-8GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG7G9-9GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG8G6GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG9G10-POGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG41G3-6、G6、G8-8寡核苷酸在RNaseA處理的Qbx33VLP中的包裝通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。在寡核苷酸包裝后，在溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上可見比未處理的參照Q(3VLP遷移略慢的熒光帶，115表明寡核苷酸的存在。該信號在Benzonase處理后仍然保留，表明寡核苷酸在Qbx33VLP內(nèi)的包裝。包裝效率可以根據(jù)TBE/尿素凝膠電泳來估計。包裝的G3-6寡核苷酸的量(約4nmol/100|igQbx33VLP)大大高于包裝的G8-8寡核苷酸的量(約1nmol/100ngQbx33VLP)。這表明包裝能力對位于CpG基序側(cè)翼的鳥苷核苷酸尾的長度的依賴性。實施例14向VLP內(nèi)包裝核糖核酸VLP核酸內(nèi)容物的ZnS04依賴的降解QPVLP在如實施例11所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4或4mMHepes,30mMNaCl,pH7.4)下用ZnS04處理。在Eppendorf恒溫混勻器中，在20mMHepespH7.4或20mMHepes,1mMTris，pH7.4中的AP205VLP(1mg/ml)用2.5mMZnS04在50。C和550rpm下處理48小時。如實施例11所述澄清QP和AP205VLP樣品，并如實施例12所述用20mMHepes,pH7.4透析。向ZnS04處理的VLP內(nèi)包裝Poly(I:C):將免疫刺激性核糖核酸Poly(I:C)(貨號27-4732-01,poly(I)叩oly(C),PharmaciaBiotech)溶解于PBS(Invitrogen,貨號14040)或水中，使?jié)舛葹?mg/ml(9pM)。Poly(I:C)在60。C下孵育10分鐘，然后冷卻至37°C。將孵育的Poly(I:C)以10倍摩爾過量加到ZnS04處理的Q|3或AP205VLP(1-1.5mg/ml)中，混合物在恒溫混勻器中以650rpm37。C孵育3小時。隨后在恒溫混勻器中以300rpm,在2mMMgCl2存在下與每mlVLP混合物125UBenzonase37。C酵育3小時，來酶水解過量的游離Poly(I:C)。Benzonase水解后，如實施例11所述澄清樣品，上清液在4。C下在300,000MWCOSpectm/Por⑧透析管(Spectrum,貨號131447)中用2L20mMHepes，pH7.4透析2小時，并且在更換緩沖液后用相同緩沖液透析過夜。透析后，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測定。116免疫原性肽與包裝有Poly(I:C)的VLP的偶聯(lián)對包裝有Poly(I:C)的QPVLP(lmg/ml)進(jìn)行衍化，并且與如實施例12所述的p33肽(KAVYNFATM-GGC)(SEQIDNO:82)或MelanA肽(MelanA16-35A/LCGHGHSYTTAEELAGIGILTV)(SEQIDNO:55)偶聯(lián)，分別得到Qb-pIC-33和Qb-pIC-MelanAVLP。為了與MelanA肽偶聯(lián)，包裝的QpVLP用2.1倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25。C下衍化0.5小時，然后在4。C下用20mMHEPES,pH7.4進(jìn)行兩次透析步驟，以除去未反應(yīng)的SMPH。加入2.1倍摩爾過量的肽，使之在恒溫混勻器中25。C反應(yīng)1.5小時。樣品在300,000MWCOSpectra/PorCEDispo透析器中用20mMHepes,pH7.2在4。C下透析3小時，并且在更換緩沖液后用相同緩沖液透析過夜。透析后，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析來測定。肽p33和肽MelanA與Qf3的偶聯(lián)通過在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行的SDS-PAGE來分析。如實施例7所述，利用1%瓊脂糖凝膠，以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。Poly(I:C)包裝到ZnS04處理的Q(3VLP內(nèi)以及與MelanA肽偶聯(lián)產(chǎn)生Qb-pIC-MelanAVLP通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。在溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上可見的熒光信號表明存在核酸，它與在考馬斯藍(lán)染色凝膠后可見的蛋白帶共遷移，證明了包裝。MelanA肽的偶聯(lián)效率通過在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行的SDS-PAGE分析來的條帶。MelanA的偶聯(lián)效率與Qb-G8-8-33VLP獲得的偶聯(lián)效率(實施例12)大體上相當(dāng)，但是略低。向Qb-pIC-MelanA內(nèi)的包裝效率可以根據(jù)TBE/尿素凝膠來估計；Qj3中Poly(I:C)的包裝量約為25pmol,在MelanA偶聯(lián)后仍然相同。對包裝有Poly(I:C)的AP205VLP(1mg/ml)進(jìn)行衍化，并且與含有N端C延伸的MelanA16-35A/L(cGHGHSYTTAEELAGIGILTV)(SEQIDNO:55)偶聯(lián)，產(chǎn)生AP205國G8-8腸MelanAVLP。AP205VLP在20mMHepes,pH7.4中用20倍摩爾過量的SMPH在25。C下衍化0.5小時，然后用20mMHEPES,pH7.4在4。C下透析兩次，以除去未反應(yīng)的SMPH。向透析過的衍化混合物中加入IO倍摩爾過量的肽，使之在恒溫混勻器中25。C反應(yīng)2小時。樣品在4。C下在10,000MWCO透析管中用20mMHepespH7.4透析2小時，并且在更換緩沖液后用相同的緩沖液透析過夜。透析后，樣品如實施例11所述澄清，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析來測定。肽MelanA16-35A/L與AP205的偶聯(lián)效率通過在16%PAGETris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行的SDS-PAGE來分析。如實施例7所述，利用1%瓊脂糖凝膠，以及在蛋白酶K消化后利用TBE凝膠來分析Poly(I:C)的包裝。Poly(I:C)向ZnS04處理的AP205VLP內(nèi)的包裝以及與MelanA肽偶聯(lián)后的偶聯(lián)產(chǎn)物AP205-pIC-MelanA通過瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)16%PAGETris-甘氨酸凝膠電泳進(jìn)行SDS-PAGE分析后，根據(jù)多偶聯(lián)產(chǎn)物的出現(xiàn)來估計MelanA肽的偶聯(lián)效率，這些偶聯(lián)產(chǎn)物顯示為比不與肽反應(yīng)的AP205VLP亞單位單體遷移更慢的條帶。包裝效率可以根據(jù)TBE凝膠來估計。實施例15向HBcAgVLP內(nèi)包裝側(cè)翼為鳥苷的免疫刺激性寡核苷酸HBcAgVLP在如實施例9所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4)下用RNaseA處理，以水解VLP的RNA內(nèi)容物。用20mMHepes,pH7.4透析后，VLP與側(cè)翼為鳥苷的寡核苷酸(表3;G3-6，G7-7,G8-8,G9-9,G10-PO或G6，在10mMTrispH8中的1mM貝d:存液)混合，如實施例12所述孵育。然后用Benzonase處理VLP,并在300,000MWCO管中透析。如實施例7所述，利用1%瓊脂糖凝膠、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。實施例16向GAVLP內(nèi)包裝側(cè)翼為鳥苷的免疫刺激性寡核苷酸GAVLP在如實施例9所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4)下用RNaseA處理，以水解VLP的RNA內(nèi)容物。用20mMHepes，pH7.4透析后，VLP與側(cè)翼為鳥苷的寡核苷酸(表3;G3-6,G7-7，G8-8,G9-9,G10-PO或G6，在10mMTrispH8中的1mM貯存液)混合，并如實施例12所述孵育。之后用Benzonase處理VLP，并在300,000MWCO管中透析。如實施例7所述，利用1%瓊脂糖凝膠、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝膠來分析包裝。實施例17向HBcAgVLP內(nèi)包裝核糖核酸HBcAgVLP在如實施例11所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4或4mMHepes,30mMNaCl,pH7.4)下用ZnS04處理，并且如實施例12所述用20mMHepes,pH7.4透析。向HBcAgVLP(1-1.5mg/ml)中加入IO倍摩爾過量的Poly(I:C)，如實施例14所述在恒溫混勻器中以650rpm37。C孵育3小時。隨后在恒溫混勻器中以300rpm，在2mMMgCl2存在下與每mlVLP混合物125UBenzonase37。C孵育3小時，從而酶水解過量的游離Poly(I:C)。樣品如實施例11所述在Benzonase水解后澄清，并且如實施例14所述透析。透析后，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測定。將包裝有Poly(I:C)的HBcAgVLP(1mg/ml)進(jìn)行衍化并且與MelanA偶聯(lián)，如實施例14所述透析。實施例18向GAVLP內(nèi)包裝核糖核酸GAVLP在如實施例11所述的低離子強度條件(20mMHepespH7.4或4mMHepes,30mMNaCl,pH7.4)下用ZnS04處理，并且如實施例12所述用20mMHepes，pH7.4透析。向GAVLP(1-1.5mg/ml)中加入10倍摩爾過量的Poly(I:C),如實施例14所述在恒溫混勻器中以650rpm37。C孵育3小時。隨后在恒溫混勻器中以300rpm,在2mMMgCl2存在下與每mlVLP混合物125UBenzonase37。C孵育3小時，119從而酶水解過量的游離Poly(I:C)。樣品如實施例11所述在Benzonase水解后澄清，并且如實施例14所述透析。透析后，如實施例11所述澄清樣品，上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測定。將包裝有Poly(I:C)的GAVLP(1mg/ml)進(jìn)行衍化并與MelanA偶聯(lián)，如實施例14所述透析。實施例19Q(3的解裝配、重裝配及寡脫氧核苷酸的包裝Q(3VLP的解裝配和重裝配解裝配在室溫及攪拌條件下，45mgQ(3VLP(2.5mg/ml，通過Bradford分析測定)在PBS(20mM磷酸鹽，150mMNaCl，pH7.5)中用10mMDTT還原15分鐘。加入氯化鎂至終濃度為700mM后在室溫和攪拌條件下進(jìn)行15分鐘的第二次孵育，使包裹的宿主細(xì)胞RNA沉淀，并伴隨著VLP的分解。溶液在4。C下以4000rpm離心IO分鐘(Eppendorf5810R,下列所有步驟中均使用的固定角轉(zhuǎn)頭A-4-62)，以從溶液中分離沉淀的RNA。對含有釋放的二聚體QP外殼蛋白的上清液進(jìn)行層析純化步驟。通過陽離子交換層析和大小排阻層析對Q(3外殼蛋白的兩步純化法解裝配反應(yīng)的上清液含有二聚體外殼蛋白、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和剩余的宿主細(xì)胞RNA,將該上清液上SP-SepharoseFF柱(xkl6/20;6ml;AmershamBioscience)。在以5ml/min的流速在室溫下進(jìn)4亍的層沖斤過程中，監(jiān)測260nm和280nm處的吸光度。層析柱用20mM磷酸鈉緩沖液pH7平衡；樣品用水1:15稀釋，以將電導(dǎo)率調(diào)節(jié)為低于10mS/cm,以便實現(xiàn)外殼蛋白與該柱的適當(dāng)結(jié)合。用達(dá)到20mM磷酸鈉/500mM氯化鈉的分步梯度對結(jié)合的外殼蛋白進(jìn)行洗脫，以約25ml的級分體積收集蛋白質(zhì)。該柱用0.5MNaOH再生。第二步，將分離的Q(3外殼蛋白二聚體(從陽離子交換柱上洗脫下來的級分)上到(分兩次)用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉；pH6.5平衡的SephacrylS-100HR斗主上(xk26/60;320ml;AmershamBioscience)。在室溫下以2.5ml/min的流速進(jìn)行層析。監(jiān)測260nm和280nm處的吸光度。以每4分5ml收集級分。該柱用0.5MNaOH再生。通過透析重裝配在寡脫氧核苷酸G8-8或G10-PO的存在下QPVLP的重裝配使用濃度為2mg/ml的純化QP外殼蛋白二聚體的貯存液。重裝配混合物中寡脫氧核苷酸的濃度為IOiliM。重裝配混合物中外殼蛋白二聚體的濃度為40(約1.13mg/ml)。向溶液中加入尿素和DTT的貯存液，4吏終濃度分別為1M尿素和5mMDTT。加入寡脫氧核苦酸作為最后的成分，并且加入1120，使重裝配反應(yīng)的終體積為3ml。該溶液在4°C下用1500ml含有20mMTrisHCl、150mMNaClpH8.0的緩沖液透析72小時。透析后的重裝配混合物在4。C下以14000rpm離心10分鐘。棄去微量的沉淀，而上清液中含有重裝配且包裝的VLP。重裝配且包裝的VLP用離心過濾裝置(Millipore，UFV4BCC25:5KNMWL)濃縮至蛋白質(zhì)終濃度為3mg/ml。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析來測定。利用大小排阻層析純化重裝配且包裝的VLP:將可達(dá)10mg的總蛋白質(zhì)上到用20mMHEPES,150mMNaCl,pH7.4平衡的SepharoseCL-4B柱上(xkl6/70,AmershamBiosciences)。在室溫下以0.4ml/min的流速進(jìn)行層析。監(jiān)測260nm和280nm處的吸光度。觀察到兩個峰，以0.5ml的級分體積收集，并且通過SDS-PAGE分析。通過非還原SDS-PAGE分析重裝配且純化的QP衣殼中的二硫鍵模式。5pg所述衣殼與不含還原劑的樣品緩沖液(含有SDS)混合，并加樣到16。/。Tris-甘氨酸凝膠上。電泳完成后，凝膠用考馬斯藍(lán)染色。與從大腸桿菌中純化的"完整，，衣殼相比，重裝配的Q(3VLP展示相同的二硫鍵模式，具有對應(yīng)于Qb外殼蛋白的二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體的條帶。用來自大腸桿菌的完整和高度純化的Q(3衣殼校準(zhǔn)該柱顯示第一主峰的表觀分子量與Q(3衣殼相符。通過滲濾重裝配(優(yōu)化的方法)20ml純化外殼蛋白的貯存液(1.5mg/ml)與尿素、DTT、寡脫氧核苷酸G10-PO的貯存液和水混合。加入寡脫氧核苷酸作為最后的成分。該混合液的體積為30ml,各成分的終濃度為35iiM二聚體外殼蛋白(對應(yīng)于1mg/ml)、35|iM寡脫氧核苷酸、1M尿素和2.5mMDTT。然后在正切流動過濾裝置中4吏用PelliconXL膜柱(Biomax5K，Millipore),在室溫下用300ml20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉，pH7.2滲濾該混合物?？偭魉僭O(shè)置為10ml/min，滲透流速設(shè)置為2.5ml/min。滲濾步驟結(jié)束后，向溶液中加入H202至終濃度為7mM,溶液進(jìn)一步在室溫下孵育60分鐘，以加速形成的VLP中結(jié)構(gòu)二硫鍵的形成。通過使用PelliconXL膜柱(PLCMK300K，Millipore),用600ml20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉，pH7.2進(jìn)行第二次滲濾，來去除未摻入的寡脫氧核苷酸和外殼蛋白。在寡脫氧核苷酸存在下重裝配的Q(3VLP的分析A)重裝配衣殼的流體動力學(xué)大小在寡脫氧核苷酸G8-8存在下重裝配的Q(3衣殼通過動態(tài)光散射(DLS)進(jìn)行分析，并與從大腸桿菌中純化的完整Qf3VLP進(jìn)行比較。重裝配的衣殼顯示與完整QPVLP相同的流體動力學(xué)大小(取決于質(zhì)量和構(gòu)象)。B)重裝配的衣殼中二硫鍵的形成重裝配的Q(3VLP通過非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析，并與從大腸桿菌中純化的完整Q(3VLP進(jìn)行比較。重裝配的衣殼顯示與完整Qj3VLP(如上所述)相似的帶型，存在二硫鍵連接的五聚體和六聚體形式的外殼蛋白。C)通過變性聚丙烯酰胺TBE-尿素凝膠電泳對在寡脫氧核苷酸存在下重裝配的QPVLP的核酸內(nèi)容物進(jìn)行分析在2mMMgCl2存在下，含有G8-8寡脫氧核苷酸的重裝配的Q|3VLP(0.4mg/ml)與每mlQ(3VLP125Ubenzonase—起37。C孵育2小時。隨后如實施例7所述，用蛋白酶K(PCR級，RocheMolecularBiochemicals，貨號1964364)處理經(jīng)benzonase處理的Q卩VLP。反應(yīng)液然后與TBE-尿素樣品緩沖液混合，并加樣到15。/。聚丙烯酰胺TBE-尿素凝膠上(Novex⑧，Invitrogen,貨號EC6885)。將1pmol、5pmol和10pmol用于重裝配反應(yīng)的寡脫氧核苷酸加樣到同一塊凝膠上，作為定性及定量標(biāo)準(zhǔn)。該凝膠用SYBR-Gold(MolecularProbes貨號S-l1494)染色。SYBR-Gold染色顯示，重裝配的Qp衣殼含有與重裝配反應(yīng)中使用的寡脫氧核苷酸共遷移的核酸。在寡脫氧核苷酸存在下重裝配的Q(3VLP的核酸內(nèi)容物對benzonase消化具有抗性，而且通過蛋白酶K消化從純化的顆粒中分離到寡脫氧核苷酸，將這些綜合起來，證明了寡脫氧核苦酸的包裝。實施例20來源于MelanA黑素瘤抗原的肽與Qb的偶聯(lián)表4.化學(xué)合成下列MelanA肽部分縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>氺A/L表示與原始野生型MelanA肽相比，丙氨酸變?yōu)橘嚢彼?*來自接頭序列的氨基酸用小寫字母表示MelanA肽部分與QbVLP的化學(xué)偶聯(lián)使用下列程序?qū)τ陔腗elanA16-35、MelanA16-35A/L和MelanA26-35-CA/L:2ml3.06mg/mlQbVLP在20mMHepes,pH7.2中的溶液與18.4|ul50mMSMPH(琥珀酰亞胺基-6-((3-馬來酰亞氨基丙酰氨基)己酸，Pierce)在DMSO中的溶液在25°C搖床上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液然后用2L20mMHepes，pH7.2在4。C下透析2次各2小時。2ml透析過的反應(yīng)混合物然后與18.4|il50mM肽貯存液(溶于DMSO)在25"C搖床上反應(yīng)2小時。反應(yīng)混合物然后在4°C下用2升20mMHepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯(lián)產(chǎn)物被稱為Qb-MelanA16-35(SEQIDNO:54)、Qb-MelanA16-35A/L(SEQIDNO:55)和Qb-MelanA26-35-CA/L(SEQIDNO:60)。對于MelanA26-35:2ml3.06mg/mlQb衣殼蛋白在20mMH印es，pH7.2中的溶液與75.3|li150mMSMPH的DMSO溶液在25。C搖床上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液然后在4。C下用2L20mMHepes,pH7.2透析兩次各2小時。2ml透析過的反應(yīng)混合物然后與37.7(^150mM肽貯存液(溶于DMSO)在25。C搖床上反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合物然后在4。C下用2升20mMHepes,pH7.2透析2次各2小時。偶聯(lián)產(chǎn)物被稱為Qb-MelanA26-35。對于MelanA26-35A/L(SEQIDNO:57):2ml3.06mg/mlQbVLP在20mMHepes,pH7.2中的溶液與37.7|li150mMSMPH的DMSO溶液在25。C搖床上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液然后在4。C下用2L20mMHepes，pH7.2透析2次各2小時。2ml透析后的反應(yīng)混合物然后與18.4^150mM肽貯存液(溶于DMSO)在25。C搖床上反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合物然后在4。C下用2升20mMHepes，pH7.2透析2次各2小時。偶聯(lián)產(chǎn)物被稱為Qb-MelanA26-35A/L。對于MelanA20-40A/L(SEQIDNO:58):2ml3.06mg/mlQbVLP在20mMHepes,pH7.2中的溶液與18.4pi50mMSMPH的DMSO溶液在25。C搖床上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液然后在4。C下用2L20mMHepes,pH7.2透析2次各2小時。2ml透析后的反應(yīng)混合物然后與184|il50mM肽貝i存液(溶于DMSO)在25。C搖床上反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合物然后在4。C下用2升20mMHepes,pH7.2透析2次各2小時。偶聯(lián)產(chǎn)物被稱為Qb-MelanA20-40A/L。對于MelanA26-40A/L(SEQIDNO:59):2ml3.06mg/mlQbVLP在20mMHepes，pH7.2中的溶液與37.7|il50mMSMPH的DMSO溶液在25。C搖床上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液然后在4"C下用2升20mMHepes,pH7.2透析2次各小時。2ml透析后的反應(yīng)混合物然后與184|li15mM肽貯存液(溶于DMSO)在25。C搖床上反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合物然后在4。C下用2升20mMHepes,pH7.2透析2次各2小時。偶聯(lián)產(chǎn)物被稱為Qb-MelanA26-40A/L。偶聯(lián)效率通過SDS-PAGE分析來檢測。圖1顯示Qb-MelanAVLP的SDS-PAGE分析。MelanA-肽與QbVLP偶聯(lián)。終產(chǎn)物與樣品緩沖液混合，并且在125V電壓和還原條件下在16%NovexTris-甘氨酸凝膠上分離1.5小時。通過將凝膠浸沒在考馬斯藍(lán)溶液中來染色分離的蛋白質(zhì)。在50%曱醇、8%乙酸中洗滌凝膠以除去背景染色。分子量標(biāo)準(zhǔn)(P77085,NewEnglandBioLabs,Beverly,USA)用作Qb-MelanA遷移速度的參照(泳道1)。加樣14iag單獨的Qb(泳道2)或用SMPH衍化的Qb(泳道3)，與8pg的下列各種終產(chǎn)物進(jìn)行比較Qb-MelanA16-35(泳道4),Qb-MelanA16-35A/L(泳道5),Qb畫MelanA26-35(泳道6)和Qb-MelanA26-35A/L(泳道7)。MelanA16-35A/L肽含有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位MelanA26-35,進(jìn)一步研究Qb-MelanA16-35A/L在體外和體內(nèi)的免疫原性。實施例21QPMelanA16-35A/LVLP被樹突細(xì)胞加工，并且在體外呈遞給T細(xì)胞MelanA-特異性T細(xì)胞的體外產(chǎn)生為了評價Qb-MelanA16-35A/L疫苗的免疫原性，在體外產(chǎn)生MelanA-特異性T細(xì)胞。如前所述(Salusto,F.etal.1994,J.Exp.Med.179:1109)，從HLA-A2健康志愿者中獲得未成熟的單核細(xì)胞來源的125樹突細(xì)胞(DC)。在37。C下對DC(0.5xl0"孔)進(jìn)行模擬脈沖或用40jag/mlQb-MelanA16-35A/L脈沖2小時。為了提高M(jìn)elanA-特異性CTL前體的頻率，通過磁力分選(MiltenyiBiotech)從PBMC中分離自體CD8T細(xì)胞。向抗原脈沖的DC中加入lxl0V孔CD8T細(xì)胞。在第3天向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入濃度為10U/ml的IL-2，到第12天提高到可達(dá)50U/ml。如前所述(Romero，P.etal，1998,J.Exp.Med.1998,188:1641),通過用由載有MelanA26-35肽的HLA-A2(HLA-A2-MelanA-PE)制得的藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的四聚體染色，分析細(xì)胞系中MelanA-特異性CD8T細(xì)胞的擴增。細(xì)胞在室溫下用HLA-A2-MelanA26-35-PE標(biāo)記1小時，然后加入抗-CD8-FITC抗體(BDPharMingen,SanJose,USA),在冰上保持30分鐘。洗滌后，利用CellQuest軟件在FACSCalibur上分析細(xì)胞。在前向散射和側(cè)向散射中獲得細(xì)胞，并且門控(gate)淋巴細(xì)胞。從該淋巴細(xì)胞群體中只選擇CD8陽性T細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。MelanA-特異性CD8+T細(xì)胞的量計算為HLA-A2-MelanA陽性細(xì)胞占CD8+淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。Qb-MelanA16-35A/L疫苗誘導(dǎo)MelanA26-35A/L-特異性CTL(CD8T細(xì)胞的9.7%)增殖，證明該疫苗被人DC有效吸收，被加工為CTL表位(MelanA26-35A/L),并且被呈遞給T細(xì)月包。如前所述(Knuth,A.1989,PNAS,86:2804)，MelanACTL通過FACS分選法富集(FACSVantage,BectonDickenson),并且通過有限稀釋來克隆。選擇CTL克隆用HLA-A2-MelanA-PE四聚體進(jìn)行正染色。CTL定期用植物凝集素活化的照射的異源PBMC再刺激。CTL克隆的抗原識別的分析進(jìn)行"Cr釋放試驗，來分析MelanACTL克隆的功能活性。APC與10-6MMelanA26-35A/L肽一起孵育1.5小時，或者與1(T6M流感Ml肽孵育作為陰性對照。APC與Cr"孵育，以測定肽脈沖時放射性核苷酸的非特異性攝取。在充分洗滌以除去殘留的抗原和放射性后，104/孔APC與不同數(shù)量的MelanA特異性T細(xì)胞一起孵育5小時。收集上清液，按照下列公式計算MelanA特異性T細(xì)胞對呈遞MelanA的APC的特異性裂解%凈爭異'1"生裂解=((cpm實驗畫cpm自發(fā))/(cpm最大-cpmu發(fā)))x100，其中cpm實驗是實驗樣品中測得的放射性計數(shù)，cpm自發(fā)是不加入T細(xì)胞而從51Cr脈沖的APC中獲得的計數(shù)，cpm最大是從用1%NP-40裂解的"Cr脈沖的APC中獲得的計數(shù)。載有MelanA26-35A/L而不載有無關(guān)Ml肽的APC被CTL有效裂解(70-85%特異性裂解)，這證實了CTL克隆的抗原特異性。實施例22免疫刺激性序列(ISS)在體外激活人細(xì)胞的能力為了選擇將要裝入Qb-MelanA疫苗中的最佳ISS，檢測含有不同數(shù)量側(cè)翼G或雙鏈RNA如Poly(I:C)的系列CpG上調(diào)人CD8T細(xì)胞上的CD69以及誘導(dǎo)人PBMC分泌IFNa和IL-12的能力。從血沉棕黃層中分離人PBMC,在含有10%FCS的RPMI培養(yǎng)基中用所述ISS處理18小時。使用PBLBiomedicalLaboratories提供的抗體組，通過ELISA測定上清液中的IFNa。PBMC用小鼠抗人CD8-FITC、小鼠抗人CD19-PE和抗人CD69-APC染色，并且通過流式細(xì)胞法分析。G10-PO是在誘導(dǎo)IFNa分泌方面最具活性的ISS(圖2A)。G9-9和G8-8比G10-PO活性略低，盡管它們也誘導(dǎo)高水平的IFNa分泌。減少其它寡核苷酸中的側(cè)翼G的數(shù)量導(dǎo)致IFNa分泌減少。Poly(I:C)處理的PBMC不釋放任何IFNa,盡管Poly(I:C)處理的來自PBMC的T細(xì)胞和B細(xì)胞上調(diào)CD69(圖2B)。Poly(I:C)也誘導(dǎo)PBMC和單核細(xì)胞來源的DC分泌IL-12。用GIO-PO、G9-9和G8-8處理PBMC將CD8T細(xì)胞的細(xì)胞膜上的CD69上調(diào)到幾乎相似的程度。減少其它寡核苷酸中側(cè)翼G的數(shù)量(少于7個)降低了它們誘導(dǎo)IFNa分泌(圖2A)和上調(diào)T細(xì)胞上的CD69的能力(圖2B)。這些數(shù)據(jù)表明，G10-PO、G9-9和G8-8對人細(xì)胞有相似的高活性，因此它們能夠在Qb-MelanA疫苗中用作ISS。實施例23G10-PO增強MelanA-特異性T細(xì)胞的體外擴增在存在或不存在G10-PO的條件下檢測了Qb-MelanAVLP誘導(dǎo)MelanA特異性CTL體外增殖的能力。未成熟的人單核細(xì)胞來源的DC(0.5xl()6/孔)如實施例21所述用Qb-MelanA16-35A/L或MelanA26-35A/L肽脈沖或模擬脈沖。人單核細(xì)胞來源的DC是toll樣受體-9(TLR-9)陰性的，因此不對CpG應(yīng)答。人PBMC中存在的B細(xì)胞和類漿細(xì)胞DC是TLR-9陽性的，響應(yīng)CpG處理產(chǎn)生細(xì)胞因子(IFNa、IL-12)。為了研究G10-PO對單核細(xì)胞來源的DC的抗原呈遞能力的作用，洗滌抗原^K沖的DC,并且在存在或不存在2pMG10-PO的條件下將其與lx106自體PBMC—起孵育2小時。向APC中加入通過磁力分選分離的自體CD8T細(xì)胞(lx106),使用實施例21所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件醉育12天。MelanA-特異性CTL通過HLA-A2-MelanA-PE四聚體染色和流式細(xì)胞分析來檢測。向Qb-MelanA-脈沖的DC中加入G10-PO提高了特異性CTL的頻率(從10%到14%)，這表明CpG刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子環(huán)境有利于CTL的體外擴增。實施例24載有G3-6、G6、G10-PO或Poly(I:C)的Qbx33VLP誘導(dǎo)對抗p33-重組痘苗病毒攻擊的保護(hù)B6小鼠用單獨的Qbx33或載有G3-6或G6或Poly(I:C)的Qbx33(參見實施例12和14)皮下免疫。8天后，小鼠用1.5xl(^pfu的表達(dá)LCMV-p33抗原的重組痘苗病毒進(jìn)行攻擊。4天后，殺死小鼠，如前所述測定卵巢中的病毒滴度(Bachmannetal,Eur.J.Imunol.1994,24:2228)。如圖3所示，接受載有G3-6或G6或Poly(I:C)的Qbx33疫苗的所有小鼠都受到對抗病毒攻擊的保護(hù)。相反，幼稚(naive)小鼠和用單獨的Qbx33免疫的小鼠未從卵巢中清除病毒。這些數(shù)據(jù)證明，單獨的VLP不足以誘導(dǎo)保護(hù)性CTL免疫應(yīng)答，而載有CpG或Poly(I:C)的VLP在引發(fā)幼稚CTL方面非常有效。128同樣，用載有G10-PO的Qbx33免疫小鼠引發(fā)了p33特異性CTL(6.2%+/-1.4%,相對于幼稚小鼠中的0.2%+/-0.1%),并且誘導(dǎo)了對抗重組痘苗病毒攻擊的保護(hù)。實施例25在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中，Q|3MelanA16-35A/LVLP被加工并且被人MHCI類等位基因HLA-A0201呈遞，并且誘導(dǎo)功能性MelanA-特異性CD8+T細(xì)胞的擴增HHD小鼠表達(dá)嵌合單鏈I類分子，該分子含有的人(32-微球蛋白共價連接到與Dba3域融合的A2al和a2域的N端(Fimt,H.etal1999，Eur.J.Immunol"29:3112)。HLA-A2轉(zhuǎn)基因在這些小鼠中的表達(dá)允i午研究QPMelanA16-35A/LVLP^皮加工并且被作為CTL表^f立MelanA26-35呈遞以及在體內(nèi)引發(fā)CTL的能力。此外，也能夠在體內(nèi)研究佐劑作為ISS的作用。HHD小鼠不予處理或者通過皮下注射100pgQb-MelanA16-35A/L或Qb-pIC-MelanA16-35A/L進(jìn)行免疫。8天后分離脾細(xì)胞，將其重懸浮于FACS緩沖液(PBS,2%FCS,5mMEDTA,pH8.2)，用HLA-A2-MelanA-PE標(biāo)記的四聚體在室溫下染色30分鐘。第二步，加入大鼠抗小鼠CD8-APC(BDPharMingen,SanJose,USA)和抗小鼠Mell4-FITC(BDPharMingen,SanJose,USA),4。C下保持30分鐘。洗滌后，在室溫下用BD-裂解溶液(BDBiosciences,SanJose,USA)裂解紅細(xì)胞10分鐘。最后，利用CellQuest軟件在FACSCalibur上分析脾細(xì)胞。首先，在前向散射和側(cè)向散射中獲得細(xì)胞，并且門控淋巴細(xì)胞。從該淋巴細(xì)胞群體中只選擇CD8陽性T細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。HLA-A2-MelanA-PE和Mell4-FITC標(biāo)記的細(xì)胞分別用FL2和FL1檢測器檢測。MelanA-特異性活化CD8+T細(xì)胞的量計算為HLA-A2-MelanA陽性Mel14陰性細(xì)胞占總CD8+淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。流式細(xì)胞分析表明，Qb-pIC-MelanA16-35A/L誘導(dǎo)MelanA-特異性活化CD8+Mel14-T細(xì)胞的高得驚人的擴增(2.43%和0.73%)，其高于未處理的動物(0.22%和0.37%)。應(yīng)當(dāng)指出，只有當(dāng)Qb-MelanA載有Poly(I:C)時該疫苗的能力才顯著提高。如上所述使用的人HLA-A2-MelanA四聚體不能非常有效地與小鼠MelanA-特異性T細(xì)胞結(jié)合，因為該蛋白質(zhì)是嵌合蛋白。因此，我們可以假定在這些小鼠中有相當(dāng)高程度的抗原特異性T細(xì)胞。在一個類似的實-驗中，我們通過用與CpG和IFA混合的肽4妄種分析了Qb-G10-MdanA16-35A/L在體內(nèi)引發(fā)CTL的效率。HHD小鼠用200|ugQ(3-G10-MelanA16-35A/L免疫，或者用與20nmolCpG和弗氏不完全佐劑(IFA)混合的50pgMelanA16-35A/L免疫，或者不予處理。8天后從脾臟中分離活淋巴細(xì)胞，對MelanA-特異性CD8+T細(xì)月包進(jìn)行染色。在37。C下和FACS緩沖液中，用PE-標(biāo)記的對于載有MelanA26-35肽的嵌合HLA-A2ocla2Kba3MHCI類分子特異的四聚體染色1.5小時。第二步，加入大鼠抗小鼠CD8-APC(BDPharMingen,SanJose,USA)和抗小鼠Mell4-FITC(BDPharMingen,SanJose,USA),在4。C下保持30分鐘。最后，使用CellQuest軟件在FACSCalibur上分析脾細(xì)胞。流式細(xì)胞分析顯示，Q(3-G10-MelanA16-35A/L誘導(dǎo)MelanA-特異性活化CD8+Mell4-T細(xì)胞的擴增(18.2%),其高于未處理的動物(2%)或接受與20nmolCpG和IFA混合的等摩爾量MelanAA/L16-35的動物(2.0%)。應(yīng)當(dāng)指出，只有在Qb-MelanA載有G10-PO時該疫苗的能力才提高。在一個類似的實驗方案中，用載有G8-8或G10-PO的Qb-MelanA16-35A/L或Qb-MelanA26-35A/L免疫HHD小鼠誘導(dǎo)了HLA-A2-MelanA-陽性且Mel14陰性CD8T細(xì)胞的擴增。這些發(fā)現(xiàn)綜合進(jìn)來證明了載有ISS的Qb-肽疫苗非常有效地引發(fā)針對外源及自身抗原的CTL的能力。實施例26載有CpG的Qbx33能夠在用于誘導(dǎo)長期記憶CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的同源及異源引發(fā)-力口強方案中使用小鼠用150)igQbx33/NKCpG免疫，8天后經(jīng)抗原特異性MHC/肽四聚體測定，p33特異性T細(xì)胞的頻率從幼稚小鼠中的0.4%+/-0.2%升高為免疫動物中的7.5%+/-2.2%。20天后，肽特異性CD8+T細(xì)胞群體降至1.6%+/-0.7%。第一次免疫30天后用150)LigQbx33/NKPS對這些小鼠進(jìn)行第二次免疫能夠加強記憶T細(xì)胞應(yīng)答至可達(dá)8.4%+/-1.9%特異性T細(xì)胞。該應(yīng)答緩慢降低，但是能夠在第一次加強4個月后用150pgQbx33/NKPS再次加強，達(dá)到23.8%+/-5.2%的T細(xì)胞水平。當(dāng)3只小鼠用與20nmolNKPS和IFA混合的50|ngp33肽引發(fā)時，到免疫后第8天只能誘導(dǎo)0.6%+/-0.4%的特異性CD8+T細(xì)胞。但是，這種低應(yīng)答能夠在7周后用Qbx33/NKPS有效加強，達(dá)到28.5%+/-9.8%的水平。用lxl(^噬斑形成單位的表達(dá)p33-肽的重組痘苗病毒免疫幾乎不能誘導(dǎo)任何T細(xì)胞應(yīng)答(1.1%+/-0.5%),但是在6個月后能夠用150|ugQbx33/NKPS非常有效地加強，達(dá)到28.1+/-4.2%的T細(xì)胞水平。這些結(jié)果表明，在異源以及同源引發(fā)加強方案中，載有CpG的Qb能夠非常有效地加強任何預(yù)先存在的T細(xì)胞應(yīng)答。應(yīng)當(dāng)指出，Qb/NKPS甚至能夠加強用肽或重組病毒幾乎無法引發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答。另外，當(dāng)用Qbx33/NKPS誘導(dǎo)強T細(xì)胞應(yīng)答時，我們能夠用免疫有效量的異種疫苗如單獨的p33肽、表達(dá)p33的重組病毒、或與VLP融合或偶聯(lián)的p33來加強這種應(yīng)答。在后一種情況中，使用的VLP不是來源于RNA噬菌體Qb的VLP，而是例如HBcAg或來源于AP205的VLP。序列表〈110〉賽托斯生物技術(shù)公司巴赫曼,馬丁馬諾勒夫，瓦尼阿麥亞林克，埃德溫普羅巴,卡爾施萬茨，卡特林<120>MelanA-肽類似物-載體偶聯(lián)物<130〉PA058WO〈150〉US60/457，348<151>2003-03-26<160>94〈170>Patentlnversion3.2<210>1<211>10〈212>DNA〈213>人工序列〈220><223>寡核苷酸ISS<400〉1gacgatcgtc10<210>2〈211〉19〈212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸G3-6<400>2ggggacgatcgtcgggggg19<210>3<211〉20<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>寡核苷酸G4-6<400>3gggggacgatcgtcgggggg<210>4〈211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉寡核苷酸G5-6<400〉4ggggggacgatcgtcgggggg〈210>5<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉寡核苷酸G6-6<400>5gggggggacga/tcgtcgggggg<210>6<211>24<212>腿<213>人工序列<220〉〈223〉寡核苷酸G7-7<400>6ggggggggacgatcgtcggggggg〈210〉7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220〉〈223〉寡核苷酸G8-8<400>7gggggggggacgatcgtcgggggggg<210〉82021222426<211〉〈212><213>28DNA人工序列<220>〈223〉寡核苷酸G9-9〈400>8ggggggggggacgatcgtcggggggggg<210><211><212〉<213>930DNA人工序列<220><223>寡核苷酸G6<400>9ggggggcgacgacgatcgtcgtcggggggg<210>10<211〉132<212〉PRT<213〉噬菌體Q-.beta〈400>10AlaLysLeuGluThrValThrLeuGlyAsnlieGlyLysAspGlyLys151015GinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGlyVal202530AlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArgVal354045ThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLysVal505560GinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySerCys65707580AspProSerValThrArgGinAlaTyrAlaAspValThrPheSerPhe8590952830ThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGluLeu100105110AlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGinLeu115120125AsnProAlaTyr130<210>11<211>328<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>11MetAlaLysLeuGluThrValThrLeuGlyAsnlieGlyLysAspGly151015LysGinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGly202530ValAlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArg354045ValThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLys505560ValGinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySer65707580CysAspProSerValThrArgGinAlaTyrAlaAspValThrPheSer859095PheThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGlu100105110LeuAlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGin115120125LeuAsnProAlaTyrTrpLeuLeulieAlaGlyGlyGlySerGlySer130135140LysProAspProVallieProAspProProlieAspProProProGly145150155160ThrGlyLysTyrThrCysProPheAlalieTrpSerLeuGluGluVal165170175TyrGluProProThrLysAsnArgProTrpProlieTyrAsnAlaVal180185190GluLeuGinProArgGluPheAspValAlaLeuLysAspLeuLeuGly195200205AsnThrLysTrpArgAspTrpAspSerArgLeuSerTyrThrThrPhe210215220ArgGlyCysArgGlyAsnGlyTyrlieAspLeuAspAlaThrTyrLeu225230235240AlaThrAspGinAlaMetArgAspGinLysTyrAsplieArgGluGly245250255LysLysProGlyAlaPheGlyAsnlieGluArgPhelieTyrLeuLys260265270SerlieAsnAlaTyrCysSerLeuSerAsplieAlaAlaTyrHisAla275280285AspGlyVallieValGlyPheTrpArgAspProSerSerGlyGlyAla290295300lieProPheAspPheThrLysPheAspLysThrLysCysProlieGin305310315320AlaVallieValValProArgAla325〈210>12<211〉362<212>PRT<213〉BK病毒<400>12MetAlaProThrLysArgLysGlyGluCysProGlyAlaAlaProLys151015LysProLysGluProValGinValProLysLeuLeulieLysGlyGly202530ValGluValLeuGluValLysThrGlyValAspAlalieThrGluVal354045GluCysPheLeuAsnProGluMetGlyAspProAspAspAsnLeuArg505560GlyTyrSerGinHisLeuSerAlaGluAsnAlaPheGluSerAspSer65707580ProAspArgLysMetLeuProCysTyrSerThrAlaArglieProLeu859095ProAsnLeuAsnGluAspLeuThrCysGlyAsnLeuLeuMetTrpGlu100105110AlaValThrValLysThrGluVallieGlylieThrSerMetLeuAsn115120125LeuHisAlaGlySerGinLysValHisGluAsnGlyGlyGlyLysPro130135140ValGinGlySerAsnPheHisPhePheAlaValGlyGlyAspProLeu145150155160GluMetGinGlyValLeuMetAsnTyrArgThrLysTyrProGinGly165170175ThrlieThrProLysAsnProThrAlaGinSerGinValMetAsnThr180185190AspHisLysAlaTyrLeuAspLysAsnAsnAlaTyrProValGluCys195200205TrplieProAspProSerArgAsnGluAsnThrArgTyrPheGlyThr210215220TyrThrGlyGlyGluAsnValProProValLeuHisValThrAsnThr225230235240AlaThrThrValLeuLeuAspGluGinGlyValGlyProLeuCysLys245250255AlaAspSerLeuTyrValSerAlaAlaAsplieCysGlyLeuPheThr260265270AsnSerSerGlyThrGinGinTrpArgGlyLeuAlaArgTyrPheLys275280285lieArgLeuArgLysArgSerValLysAsnProTyrProlieSerPhe290295300LeuLeuSerAspLeulieAsnArgArgThrGinLysValAspGlyGin305310315320ProMetTyrGlyMetGluSerGinValGluGluValArgValPheAsp325330335GlyThrGluGinLeuProGlyAspProAspMetlieArgTyrlieAsp340345350ArgGinGlyGinLeuGinThrLysMetVal355360〈210〉13〈211〉130<212>PRT〈213〉噬菌體fr<400>13MetAlaSerAsnPheGluGluPheValLeuValAspAsnGlyGlyThr151015GlyAspValLysValAlaProSerAsnPheAlaAsnGlyValAlaGlu202530TrplieSerSerAsnSerArgSerGinAlaTyrLysValThrCysSer354045ValArgGinSerSerAlaAsnAsnArgLysTyrThrValLysValGlu505560ValProLysValAlaThrGinValGinGlyGlyValGluLeuProVal65707580AlaAlaTrpArgSerTyrMetAsnMetGluLeuThrlieProValPhe859095AlaThrAsnAspAspCysAlaLeulieValLysAlaLeuGinGlyThr100105110PheLysThrGlyAsnProlieAlaThrAlalieAlaAlaAsnSerGly115120125lieTyr130<210>14<211>130<212〉PRT<213>噬菌體GA<400>14MetAlaThrLeuArgSerPheValLeuValAspAsnGlyGlyThrGly151015AsnValThrValValProValSerAsnAlaAsnGlyValAlaGluTrp202530LeuSerAsnAsnSerArgSerGinAlaTyrArgValThrAlaSerTyr354045ArgAlaSerGlyAlaAspLysArgLysTyrAlalieLysLeuGluVal505560ProLyslieValThrGinValValAsnGlyValGluLeuProGlySer65707580AlaTrpLysAlaTyrAlaSerlieAspLeuThrlieProliePheAla859095AlaThrAspAspValThrVallieSerLysSerLeuAlaGlyLeuPheLysValGly115TyrAla130100AsnProlieAlaGlu120105110AlalieSerSerGinSerGlyPhe125<210><211><212><213>15594DNA人工序列<220><223>含有來自LCMV的p33的HBcAg<220><221><222>CDS(1)..(594)<400>15atggacattMetAsp1lietegtttSerPhettgILeugacccttataaagaatttggagetactgtggagttaetc48AspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeu51015ccttctgacttctttccttecgtcagagatetcetagac96ProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp202530accgccteagetctgtatcgagaagccttagagtctcctgagcattgc144ThrAlaSerAlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCys1404045teaSercctPro50cacHiscatHisactThrgcaAlaetcLeu55郷ArgcaagccGinAlaattetclieLeu60tgctggCysTrpgggGlyg犯Glu192ttgLeu65atgMetactThretaLeugetAlaaceThr70tggTrpgtgValggtaatGlyAsn組ttgAsnLeu75g犯gstGluAspCC3ProgcaAla80240tecSer鄉(xiāng)ArgAspetaLeugtaVal85gtcVal犯tAsntatTyrgttaatValAsn90actaacThrAsnatgggtMetGlytt￡LLeu95Lys288atelieaggArgGinetaLeu100ttgLeutggTrptttPhecatHisatatctlieSer105tgccttCysLeuacttttThrPhe110Gly柳Arg336gagGluactThrVal115cttLeuGlutatTyrttgLeugtcVal120tctttcSerPheggagtgGlyValtggattTrplie125cgcArgactThr384cctProCC3Pro130gccAlatatTyr柳ArgCC3ProCC3Pro135組AsngcccctAlaProatettalieLeu140teaacaSerThrcttLeuccgPro432g肪Glu145actThractThrgttValgttVal柳Arg150ArgeggArggaccgaAspArgggcaggGlyArg155teccctSerProagaArg3gaArg160480卿ArgactThrcccProtegSercctPro165cgcArg柳ArgcgcArg3g3tctArgSer170c肌tegGinSerccgcgtProArgcgcArg175agaArg528agaArgtctSerc肌GintctSer180eggArgGlutctSercaaGintgtcttCysLeu185etccttLeuLeua肪getLysAla190gttValtacTyr576AsnttcPhegetAla195accThr3tgMettaa594〈210〉16〈211〉197<212>PRT<213>人工序列〈220〉<223〉含有來自LCMV的p33的HBcAgMetAsplieAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeu151015SerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp202530ThrAlaSerAlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCys354045SerProHisHisThrAlaLeuArgGinAlalieLeuCysTrpGlyGlu505560LeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyAsnAsnLeuGluAspProAla65707580SerArgAspLeuValValAsnTyrValAsnThrAsnMetGlyLeuLys859095lieArgGinLeuLeuTrpPheHislieSerCysLeuThrPheGlyArg100105110GluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrplieArgThr115120125ProProAlaTyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuPro130135140GluThrThrValValArgArgArgAspArgGlyArgSerProArgArg145150155160ArgThrProSerProArgArgArgArgSerGinSerProArgArgArg165170175ArgSerGinSerArgGluSerGinCysLeuLeuLeuLysAlaValTyr180185190AsnPheAlaThrMet195142〈210〉<211>〈212〉<213>17246腿人工序列<220>〈223〉用于BKV包裝和穩(wěn)定的dsDNA片段<400>17ggcggtggtgtacacatccacacctgtccaatgcagaacg織gtgtcagatctacaatgatcgtcatceiccttggtgatgctgaagaagaaacag60ttcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgc120agatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcag180ctagctatccatacgatgtccctgattacgcctaacgcgaattcgccagc240246<210><211><212><213>185PRT人工序列<220>〈223>GGKGG接頭<400>18GlyGlyLysGlyGly15<210><211><212><213>19128PRT噬菌體PP7<400>19MetSerLysThrlieValLeuSerValGlyGluAlaThrArgThrLeu151015ThrGlulieGinSerThrAlaAspArgGinliePheGluGluLysVal202530GlyProLeuValGlyArgLeuArgLeuThrAlaSerLeuArgGinAsn354045GlyAla!LysThrAlaTyrArgValAsnLeuLysLeuAspGinAlaAsp505560ValValAspCysSerThrSerValCysGlyGluLeuProLysValArg65707580TyrThrGinValTrpSerHisAspValThrlieValAlaAsnSerThr859095GluAlaSerArgLysSerLeuTyrAspLeuThrLysSerLeuValAla100105110ThrSerGinValGluAspLeuValValAsnLeuValProLeuGlyArg115120125<210>20〈211>132<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>20AlaLysLeuGluThrValThrLeuGlyAsnlieGlyArgAspGlyLys151015GinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGlyVal202530AlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArgVal354045ThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLysVal505560GinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySerCys65707580AspProSerValThrArgGinLysTyrAlaAspValThrPheSerPhe859095144ThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGluLeu100105110AlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGinLeu120125115AsnProAlaTyr130<210>21<211>132<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>21AlaLysLeuGluThrValThrLeuGlyLyslieGlyLysAspGlyLys151015GinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGlyVal202530AlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArgVal354045ThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLysVal505560GinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySerCys65707580AspProSerValThrArgGinLysTyrAlaAspValThrPheSerPhe859095ThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGluLeu100105110AlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGinLeu115120125145AsnProAlaTyr130<210〉22<211>132<212〉PRT<213>噬菌體Q-beta<400〉22AlaArgLeuGluThrValThrLeuGlyAsnlieGlyArgAspGlyLys151015GinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGlyVal202530AlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArgVal354045ThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLysVal505560GinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySerCys65707580AspProSerValThrArgGinLysTyrAlaAspValThrPheSerPhe859095ThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGluLeu100105110AlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGinLeu115AsnProAlaTyr130〈210>23<211>132<212>PRT〈213>噬菌體Q-beta120125〈400>23AlaLysLeuGluThrValThrLeuGlyAsnlieGlyLysAspGlyArg151015GinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGlyVal202530AlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArgVal354045ThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLysVal505560GinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySerCys65707580AspProSerValThrArgGinLysTyrAlaAspValThrPheSerPhe859095ThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGluLeu100105110AlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGinLeu115120125AsnProAlaTyr130<210>24〈211>132〈212>PRT<213>噬菌體Q-beta〈400〉24AlaArgLeuGluThrValThrLeuGlyAsnlieGlyLysAspGlyArg151015GinThrLeuValLeuAsnProArgGlyValAsnProThrAsnGlyVal202530AlaSerLeuSerGinAlaGlyAlaValProAlaLeuGluLysArgVal354045ThrValSerValSerGinProSerArgAsnArgLysAsnTyrLysVal505560GinValLyslieGinAsnProThrAlaCysThrAlaAsnGlySerCys65707580AspProSerValThrArgGinLysTyrAlaAspValThrPheSerPhe859095ThrGinTyrSerThrAspGluGluArgAlaPheValArgThrGluLeu100105110AlaAlaLeuLeuAlaSerProLeuLeulieAspAlalieAspGinLeu115120125AsnProAlaTyr130<210>25<211>184<212>PRT〈213>乙型肝炎病毒<400>25MetAsplieAspProTyrGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeuSer151015PheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAspThr202530AlaSerAlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCysSer354045ProHisHisThrAlaLeuArgGinAlalieLeuCysTrpGlyGluLeu505560148MetThrLeuAlaThrTrpValGlyAsnAsnLeuGluAspProAlaSer65707580ArgAspLeuValValAsnTyrValAsnThrAsnMetGlyLeuLyslie859095ArgGinLeuLeuTrpPheHislieSerCysLeuThrPheGlyArgGlu100105110ThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrplieArgThrPro115120125ProAlaTyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuProGlu130135140ThrThrValValArgArgArgAspArgGlyArgSerProArgArgArg145150155160ThrProSerProArgArgArgArgSerGinSerProArgArgArgArg165170175SerGinSerArgGluSerGinCys180〈210><211>〈212〉<213〉26213PRT乙型肝炎病毒<400>26MetGinLeuPheHisLeuCysLeulielieSerCysSerCysProThr151015ValGinAlaSerLysLeuCysLeuGlyTrpLeuTrpGlyMetAsplie202530AspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeuSerPheLeu354045ProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAspThrAlaSer505560AlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCysSerProHis65707580HisThrAlaLeuArgGinAlalieLeuCysTrpGlyAspLeuMetAsn859095LeuAlaThrTrpValGlyGlyAsnLeuGluAspProValSerArgAsp100105110LeuValValGlyTyrValAsnThrThrValGlyLeuLysPheArgGin115120125LeuLeuTrpPheHislieSerCysLeuThrPheGlyArgGluThrVal130135140lieGluTyrLeuValSerPheGlyValTrplieArgThrProProAla145150155160TyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuProGluThrThr165170175ValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArgThrProSerPro180185190ProArgArgArgArgSerGinSerProArgArgArgArgSerGinSer195200205ArgGluSerGinCys210〈210〉27<211>188<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>27MetAsplieAspProTyrLysGluPheGlySerSerTyrGinLeuLeu151015AsnPheLeuProLeuAspPhePheProAspLeuAsnAlaLeuValAsp202530ThrAlaThrAlaLeuTyrGluGluGluLeuThrGlyArgGluHisCys354045SerProHisHisThrAlalieArgGinAlaLeuValCysTrpAspGlu505560LeuThrLysLeulieAlaTrpMetSerSerAsnlieThrSerGluGin65707580ValArgThrlielieValAsnHisValAsnAspThrTrpGlyLeuLys859095ValArgGinSerLeuTrpPheHisLeuSerCysLeuThrPheGlyGin100105110HisThrValGinGluPheLeuValSerPheGlyValTrplieArgThr115120125ProAlaProTyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuPro130135140GluHisThrVallieArgArgArgGlyGlyAlaArgAlaSerArgSer145150155160ProArgArgArgThrProSerProArgArgArgArgSerGinSerPro165170ArgArgArgArgSerGinSerProSerThrAsnCys180185175<210><211>〈212〉<213>28185PRT乙型肝炎病毒〈400>28151ThrValGluLeuLeu151015SerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp202530ThrAlaSerAlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCys354045SerProHisHisThrAlaLeuArgGinAlalieLeuCysTrpGlyGlu505560LeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyAsnAsnLeuGluAspProAla65707580SerArgAspLeuValValAsnTyrValAsnThrAsnMetGlyLeuLys859095lieArgGinLeuLeuTrpPheHislieSerCysLeuThrPheGlyArg100105110GluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrplieArgThr115120125ProProAlaTyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuPro130135140GluThrThrValValArgArgArgAspArgGlyArgSerProArgArg145150155160ArgThrProSerProArgArgArgArgSerGinSerProArgArgArg165170175ArgSerGinSerArgGluSerGinCys180185<210〉29〈211〉152<212>PRT<213〉乙型肝炎病毒<400>29MetAsplieAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeu151015SerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp202530ThrAlaAlaAlaLeuTyrArgAspAlaLeuGluSerProGluHisCys354045SerProHisHisThrAlaLeuArgGinAlalieLeuCysTrpGlyAsp505560LeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyThrAsnLeuGluAspGlyGly65707580LysGlyGlySerArgAspLeuValValSerTyrValAsnThrAsnVal859095GlyLeuLysPheArgGinLeuLeuTrpPheHislieSerCysLeuThr100105110PheGlyArgGluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrp115120125lieArgThrProProAlaTyrArgProProAsnAlaProlieLeuSer130135140ThrLeuProGluThrThrValVal145150<210><211><212>〈213〉303635DNA人工序列<220><223>質(zhì)粒pAP283-58〈400〉30cgagctcgcccctggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagaccggaattcga60gctcgcccggggatcctctagaattttctgcgcacccatcccgggtggcgcccaaagtga120ggaaaatcacatggcaaataagcc犯tgcaaccgatcacatctacagcaaataa犯ttgt180gtggtcggatccaactcgtttatcaactacattttcagcaagtctgttacgccaacgtgt240taaagttggtatagccgaactgaataatgtttcaggtcaatatgtatctgtttataagcg300tcctgcacctaaaccggaaggttgtgcagatgcctgtgtcattatgccgaatgaaaacca360atccattcgcacagtgatttcagggtcagccgaaaacttggctaccttaaaagcagaatg420ggaaactxacaaacgtaacgttgacacactcttcgcgagcggcaacgccggtttgggttt480ccttgaccctactgcggctatcgtatcgtctgatactactgcttaagcttgtattctata540gtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttc600taacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatc660atctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctgg了20taacgccgttccgcaccccggaaatggtcaccgaaccaatcagcagggtcatcgctagcc780agatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgcacacagtgcggttgctg840gcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatga900gCgCttgtttCggCgtgggt3tggtggCELggCCCCgtggCCggg哪CtgttgggCgCC￡l%0tctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgcttcaacggcctcaacctactactg1020ggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgatatggtgcactctcagta1080caatctgctctgatgccgcatagttaagccaactccgctatcgctacgtgactgggtcat1140ggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctccc1200ggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttc1260accgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgccta1320gtttcttagacgtcaggtggtttttctaaatacattcaaacaataatattgaaaaaggaatttttatagggga組gtgcctcatgagacattcaacattttaatgtcatgcggaaccccaataaccctgtccgtgtcgcgataataBtgtatttgtttaataaatgcttccttattcccttttttgcggcattttgcct154cacttttcggtatgtatccggsgteitgsgttcctgttttt1380144015001560tcgtagttatctacacgacg2280ctgagataggtgcctcactg2340gctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctg犯gatcagttgggtgcacgagtg1620ggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaa1680cgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtatt1740gacgccgggca卿gcaactcggtcgccgcatetcactattctcagaatgacttggttgag1800tactcaccagtcacagaaaagca/tcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagt1860gctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggagga1920ccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgt1980tgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgta2040gcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttxccgg2100caacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcc2160cttccggctggctggtttattgctga/taaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggt2220atcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtagggagtcaggcaactatggatgaacga^atagacagatcgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatacttt卿ttgatttaaaa2400cttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaa2460atcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaagga2520tcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccg2580ctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaact2640ggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccac2700cacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtg2760gctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccg2820gataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcga2880acgacctacaccgaactgagatacctacagcgcgagcattgagaaagcgccacgcttccc2940g犯ggg,aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaac鄉(xiāng)卿gcgcacg3000agggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctc3060tgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgcc3120agcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttcttt3180cctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgatacc3240gctcgccgcagccgaacgacgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcc3300caatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgtggtgtca3360tggtcggtgatcgccagggtgccgacgcgcatctcgactgcatggtgcaccaatgcttct3420ggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggccgtgcaggtcgtaaatcactgcataa3480ttcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcgaactagttaactagtacgcaagttcacgtaaaaagggtatcgcggaatt<210>31<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>〈223〉A(chǔ)P205外殼蛋白<400〉31MetAlaAsnLysProMetGinProlieThrSerThrAlaAsnLyslie151015ValTrpSerAspProThrArgLeuSerThrThrPheSerAlaSerLeu202530LeuArgGinArgValLysValGlylieAlaGluLeuAsnAsnValSer354045GlyGinTyrValSerValTyrLysArgProAlaProLysProGluGly505560CysAlaAspAlaCysVallieMetProAsnGluAsnGinSerlieArg65707580ThrVallieSerGlySerAlaGluAsnLeuAlaThrLeuLysAlaGlu859095354036003635156TrpGluThrHisLysArgAsnValAspThrLeuPheAlaSerGlyAsn100105110AlaGlyLeuGlyPheLeuAspProThrAlaAlalieValSerSerAsp115120125ThrThrAla130<210><211>〈212><213〉32131PRT人工序列<220>〈223〉A(chǔ)P205外殼蛋白<400>32MetAlaAsnLysThrMetGinProlieThrSerThrAlaAsnLyslie151015ValTrpSerAspProThrArgLeuSerThrThrPheSerAlaSerLeu202530LeuArgGinArgValLysValGlylieAlaGluLeuAsnAsnValSer354045GlyGinTyrValSerValTyrLysArgProAlaProLysProGluGly505560CysAlaAspAlaCysVallieMetProAsnGluAsnGinSerlieArg65707580ThrVallieSerGlySerAlaGluAsnLeuAlaThrLeuLysAlaGlu859095TrpGluThrHisLysArgAsnValAspThrLeuPheAlaSerGlyAsn100105110157AlaGlyLeuGlyPheLeuAspProThrAlaAlalieValSerSerAsp115120125ThrThrAla130<210>33<211>3607〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉質(zhì)粒pAP281-32〈400〉33cgagctcgcccctggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagaccggaattcga60gctcgcccggggatcctctagattaacccaacgcgtaggagtcaggccatggcaaataag120acaatgcaaccgatcacatctacagcaaataaaattgtgtggtcggatccaactcgttta180tcaactacattttcagcaagtctgttacgccaacgtgttaaagttggtatagccgaactg240aataatgtttcaggtcaatatgtatctgtttataagcgtcctgcacctaaaccgaaggtc300agatgcctgtgtcattatgccgaatgaaaaccaatccattcgcacagtgatttcagggtc360agccgaaaacttggctaccttaaaagcagaatgggaaactcacaaacgtaacgttgacac420actcttcgcgagcggcaacgccggtttgggtttccttgaccctactgcggctatcgtatc480gtctgatactactgcttaagcttgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgat540acataaggttatgtattaatggtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattg600tgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagt660cggttgggttggacagacctctgagtttctggtaacgccgttccgcaccccgga犯tggt720caccgaaccattcagcagggtcatcgctagccagatcctctacgccggacgcatcgtggc780ccgcatcaccggcgccacaggtgcggtgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggg840gaagatcgggctcgccacttcgggctcatgatcgctggtttccgcctgggtatggtggca900ggccccgtggcccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggc%0ggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataa1020gggagagcgtcgatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagc1080caactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccg1140ctgacgcgccctgacgggcttgtctgcttccggcatccgcttacagacaagctgtgaccg1200tctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagc1260ttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataat1320ggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaccccctattggttt1380atttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgct1440tcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcc1500cttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaa1560agatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcgg1620taagatccttgagagttttcgccccgaagaacgtttttcaatgatgagcacttttaaagt1680tctgctatgtgtcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccg1740catacactattctcagaatgacttggtggtacctaccagtcacagaaaagcatcttacgg1800atggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcgg1860ccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaaca1920tgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaa1980acgacgagcgtgacaccacgatgcctgtacgaacggcaacaacgttgcgcaaactattaa2040ctggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggata2100aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaat2160ctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagc2220cctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaata2280gacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagttt2340actcatatettactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtga2400agatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgag2460cggtcagaccccgtagaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaa2520tctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaag2580agctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagetgcgcagataccaaatactg2640tccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacat2700acctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta2760ccgggttggactca卿cgataggtaccggat卿gcgcagcggtcgggctg咖ggggg2820gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagc2880gcgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaa2940gcggcagggtcggaac犯gagagcgcacgagggagcttccaggggg犯acgcctggtatc3000tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt3060caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcct3120ttggctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataacc3180gtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgacggcgcag3240cgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcg3300ttggccgattcattaatgcagctgtggtgtcatggtcggtgatcgccagggtgccgacgc3360gcatctcgactgcatggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtgg3420caggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttttttttgcggcgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagcttatggccgtgctggstaatgggtgsca^ttcggaattaatcatcgaactagttaactagtacgcaagttcacgtaaaaagggtatcg〈210〉34〈211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉CyCpGpt〈400〉34tccatgacgttcctgaataat<210>35〈211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列348035403600360721160<220><223>CyCpG<400>35tccatgacgttcctgaataa<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列〈220><223>B-CpGpt<400>36tccatgacgttcctgacgtt<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>B-CpG<400>37tccatgacgttcctgacgtt〈210〉38<211>19<212>DNA〈213>人工序列<220><223〉NKCpGpt〈400>38ggggtc認(rèn)gUgaggggg<210>39<211〉19<212>腿<213〉人工序列<220>〈223>NKCpG說明書第159/176頁212020<400>39ggggtcaacgttgaggggg19〈210〉40〈211〉21〈212>DNA<213>人工序列<220><223〉CyCpG-rev-pt<400>40attattcaggaacgtcatgga21<210><211><212><213>4130腿人工序列〈220><223>glOgacga-PO(G10-P0)<400>41gggggggggggacgatcgtcgggggggggg30〈210〉〈211〉<212><213>4230DNA人工序列<220><223>glOgacga-PS<400>42gggggggggggacgatcgtcgggggggggg30〈210〉43<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>(CPG)200pA<400>43cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgaaatgcatgtcaaagacagc60at62<210>44<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>Cy(CpG)20<400>44tccatgacgttcctgaataatcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgc60g61<210〉45<211〉83<212〉DNA<213>人工序列<220><223>Cy(CpG)20_OpA<400>45tccatgacgttcctgaataatcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcGOgaaatgcatgtcaaagacagcat83〈210〉46<211〉43<212>腿<213>人工序列〈220><223〉CyOpA〈400>46tccatgacgttcctgaataataaatgcatgtcaaagacagcat43〈210>47〈211>63<212>腿<213>人工序列<220><223〉CyCyCy<400>47tccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaat60163aat63〈210>48<211>150<212>DNA<213>人工序列<220><223>Cyl50-l<400>48tccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaat60aattggatgacgttggtgaataattccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctg120aataattccatgacgttcctgaataattcc<210>49<211>253<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>dsCyCpG-253<400>49ctagaactagtggatccccc15060gggctgcaggaattcgattcatgacttcctgaataattccatgacgttggtgaataattccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaataat120tccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaat180aattccatgacgttcctgaataattccatgacgttcctgaaaattccaatcaagcttatc240gataccgtcgacc253<210>50<211>10<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>MelanA26-35A/L<400>50GluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510<210>51<211〉20<212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223〉MelanA16-35A/L<400〉51GlyHisGlyHisSerTyrThrThrAlaGluGluLeuAlaGlylieGly151015lieLeuThrVal20<210>52<211〉21〈212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>MelanA20-40A/L<400〉52SerTyrThrThrAlaGluGluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVal151015lieLeuGlyValLeu20<210>53〈211>14<212〉PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉MelanA26-40A/L<400>53GluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVallieLeuGlyVal1510165<210>54<211>21<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>MelanA16-35<400>54CysGlyHisGlyHisSerTyrThrThrAlaGluGluAlaAlaGlylie151015GlylieLeuThrVal20〈210>55<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223〉MelanA16-35A/L<400>55CysGlyHisGlyHisSerTyrThrThrAlaGluGluLeuAlaGlylie151015GlylieLeuThrVal20〈210〉56〈211〉13<212>PRT<213>人工序列〈220><223〉MelanA26-35<400>56CysGlyGlyGluAlaAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510〈210〉57〈211〉13〈212〉PRT<213>人工序列<220><223>MelanA26-35A/L<400>57CysGlyGlyGluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510<210>58<211>22<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>MelanA20-40A/L<400>58CysSerTyrThrThrAlaGluGluLeuAlaGlylieGlylieLeuThr151015VallieLeuGlyValLeu20<210>59〈211>18〈212〉PRT<213>人工序列<220><223>MelanA26-40A/L〈400〉59CysGlyGlyGluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVallieLeuGly151015ValLeu<210>60<211>13〈212〉PRT〈213〉人工序列<220><223>MelanA26-35-C〈400〉60GluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrValGlyGlyCys1510<210>〈211〉<212><213>6135DNA人工序列<220〉<223>載體pAbl85的序列<400〉61tctagattaacccaacgcgtaggagtcaggccatg35<210>62<211>9〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223>N端甘氨酸絲氨酸接頭<220〉<221>重復(fù)<222>(l)..(l)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至5次<220><221>重復(fù)<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重復(fù)O至IO次〈220〉<221>重復(fù)〈222〉(4)..(4)<223〉絲氨酸可以重復(fù)0至2次〈220>〈221>重復(fù)〈222〉(5)..(9)<223>這些殘基可以重復(fù)0至3次作為一組<400〉62168GlyCysGlySerGlyGlyGlyGlySer15〈210〉63<211〉10<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>C端甘氨酸絲氨酸接頭<220><221>重復(fù)<222>(l)..(l)〈223〉甘氨酸可以重復(fù)0至10次<220><221>重復(fù)<222>(2),.(2)<223>絲氨酸可以重復(fù)0至2次<220><221>重復(fù)<222〉(3)..(7)<223>這些殘基可以重復(fù)0至3次作為一組<220><221>重復(fù)<222>(8)..(8)<223〉甘氨酸可以重復(fù)0至8次<220><221>重復(fù)〈222>(IO)..(IO)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至5次<400>63GlySerGlyGlyGlyGlySerGlyCysGly1510<210>64<211〉5<212〉PRT<213>人工序列I<220><223〉甘氨酸絲氨酸接頭〈400〉64GlyGlyGlyGlySer15<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列〈220〉<223>N-端gammal<400>65CysGlyAspLysThrHisThrSerProPro1510<210>66〈211〉10<212>PRT<213>人工序列〈220><223>O端gamma1〈400〉66AspLysThrHisThrSerProProCysGly1510<210>67〈211>17〈212〉PRT〈213〉人工序列<220><223>N-端gamma3〈400〉67CysGlyGlyProLysProSerThrProProGlySerSerGlyGlyAla151015Pro<210>68<211〉18<212〉PRT<213〉人工序列〈220〉<223〉C-端garama3<400>68ProLysProSerThrProProGlySerSerGlyGlyAlaProGlyGly151015CysGly<210>69<211〉6〈212〉PRT<213>人工序列<220><223>N-端甘氨酸接頭<400>69GlyCysGlyGlyGlyGly15<210>70〈211〉6<212>PRT〈213〉人工序列<220〉〈223〉C-端甘氨酸接頭〈400>70GlyGlyGlyGlyCysGly15<210〉71<211>6<212>PRT<213>人工序列m〈220><223〉C-端甘氨酸-賴氨酸接頭<■71GlyGlyLysLysGlyCys15<210>72〈211>6<212>PRT〈213>人工序列<220><223>N-端甘氨酸-賴氨酸接頭<400>72CysGlyLysLysGlyGly15<210〉73<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>〈223>N-端接頭l〈400〉73CysGlyLysLysGlyGly15<210>74<211>6<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>N-端接頭2<400〉74CysGlyAspGluGlyGly15<210>75<211>6〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220>〈223〉O端接頭<400〉75GlyGlyLysLysGlyCys15<210>76<211〉6<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>C-端接頭2<400>76GlyGlyGluAspGlyCys15<210>77<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>C-端接頭3<400〉77GlyGlyCysGly1<210〉78<211〉10<212>PRT<213>人類〈400〉78GluAlaAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510173〈210〉79<211〉9<212>PRT〈213>人類<400>79AlaAlaGlylieGlylieLeuThrVal15<210〉80<211>9<212>PRT〈213〉人類<400>80LysAlaValTyrAsnPheAlaThrMet15<210>81<211>12<212>PRT<213>人類〈400〉81CysGlyGlyLysAlaValTyrAsnPheAlaThrMet1510<210><211><212><213>8212PRT人類<400〉82LysAlaValTyrAsnPheAlaThrMetGlyGlyCys1510<210>83〈211〉18<212>PRT〈213〉人類<400>83CysGlyGlyGlySerGluGlulieArgSerLeuTyrAsnThrValAlaThrLeu〈210〉84〈211〉9<212>PRT<213〉人類<400〉84LeuAlaGlylieGlylieLeuThrVal15<210><211><212><213〉859PRT<400>85MetAlaGlylieGlylieLeuThrVal15<210><211><212〉<213>8610PRT<■〉86GluAlaMetGlylieGlylieLeuThrVal1510<210〉<211><212〉〈213〉8710PRT<400>87GluMetAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510〈210〉88<400>88TyrAlaAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510〈210〉〈211〉<212〉<213〉8910PRT人類<400>89PheAlaAlaGlylieGlylieLeuThrVal1510〈210〉<211><212><213〉909PRT人類〈400>90LeuProTyrLeuGlyTrpLeuValPhe15<210〉〈211>〈212><213>91118PRT人類<400>91MetProArgGluAspAlaHisPhelieTyrGlyTyrProLysLysGly151015HisGlyHisSerTyrThrThrAlaGluGluAlaAlaGlylieGlylie202530LeuThrVallieLeuGlyValLeuLeuLeulieGlyCysTrpTyrCys354045ArgArgArgAsnGlyTyrArgAlaLeuMetAspLysSerLeuHisVal505560GlyThrGinCysAlaLeuThrArgArgCysProGinGluGlyPheAsp65707580HisArgAspSerLysValSerLeuGinGluLysAsnCysGluProVal859095ValProAsnAlaProProAlaTyrGluLysLeuSerAlaGluGinSer100105110ProProProTyrSerPro115<210><211><212〉<213〉9216PRT人工序列<220〉<223>CSPKSL-MelanA26-35A/L〈400〉92CysSerProLysSerLeuGluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVal1<210>〈211〉<212><213>510159318PRT人工序列<220>〈223〉MelanA26-40-CA/L〈400〉93GluLeuAlaGlylieGlylieLeuThrVallieLeuGlyValLeuGly151015GlyCys<210>94177<211><212>〈213〉118PRT人工序列<220><223>MelanA1-118A/L<400>94MetProArgGluAspAlaHisPhelieTyrGlyTyrProLysLysGly151015HisGlyHisSerTyrThrThrAlaGluGluLeuAlaGlylieGlylie202530LeuThrVallieLeuGlyValLeuLeuLeulieGlyCysTrpTyrCys354045ArgArgArgAsnGlyTyrArgAlaLeuMetAspLysSerLeuHisVal505560GlyThrGinCysAlaLeuThrArgArgCysProGinGluGlyPheAsp65707580HisArgAspSerLysValSerLeuGinGluLysAsnCysGluProVal859095ValProAsnAlaProProAlaTyrGluLysLeuSerAlaGluGinSer100105110ProProProTyrSerPro11權(quán)利要求1.一種組合物，其包含(a)病毒樣顆粒；和(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。2.—種增強動物中免疫應(yīng)答的方法，包括向該動物中導(dǎo)入一種組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒；(b)至少一種免疫刺激物；和(c)至少一種抗原或抗原決定簇；其中所述抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合，其中所述免疫刺激物與所述病毒樣顆粒結(jié)合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽類似物組成。3.—種疫苗，其含有免疫有效量的權(quán)利要求1的組合物以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，并且其中優(yōu)選地所述疫苗進(jìn)一步含有佐劑。4.一種免疫或治療動物的方法，包括對該動物施用免疫有效量的權(quán)利要求3的疫苗。5.—種免疫或治療動物的方法，包括通過施用免疫有效量的權(quán)利要求3的疫苗，而在所述動物中引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。6.—種免疫或治療動物的方法，包括在所述動物中引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答和加強所述動物中的T細(xì)胞應(yīng)答的步驟，其中這種加強是通過施用免疫有效量的權(quán)利要求3的疫苗來實現(xiàn)的。全文摘要本發(fā)明涉及MELAN-A肽類似物-病毒樣顆粒偶聯(lián)物。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供修飾的病毒樣顆粒(VLP)，包括能夠載有免疫刺激物，特別是載有含非甲基化C和G(CpG)的DNA寡核苷酸的VLP，并且來源于MelanA的具體肽與之連接。這些CpGVLP比不含CpG的對應(yīng)物具有顯著更強的免疫原性，并且誘導(dǎo)增強的B和T細(xì)胞應(yīng)答。針對任選地與該VLP偶聯(lián)、融合或以其他方式附著的MelanA肽類似物的免疫應(yīng)答與針對該VLP本身的免疫應(yīng)答相似地增強。另外，針對MelanA肽類似物的T細(xì)胞應(yīng)答特別集中在Th1型。因此，與載有CpG的VLP附著的抗原可能是用于針對變態(tài)反應(yīng)、腫瘤和其它自體分子和慢性病毒病的預(yù)防性或治療性接種的理想疫苗。文檔編號A61K39/21GK101675993SQ20091017552公開日2010年3月24日申請日期2004年3月25日優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日發(fā)明者卡爾·G·普羅巴,卡特林·施萬茨,埃德溫·麥亞林克,瓦尼阿·馬諾勒夫,馬丁·F·巴赫曼申請人:賽托斯生物技術(shù)公司