專利名稱：一種新型病原體識別分子的抗病毒作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及富亮氨酸重復(fù)相互作用蛋白 Lrrfip 1 [leucine rich repeat (in FLII) interacting protein 1]在病毒感染性疾病中的效應(yīng)、作用機(jī)制、實施方法和用途。
背景技術(shù)：
病毒是由一種以核酸(核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA)為核心，以蛋白質(zhì)為外殼(衣殼capsid)而組成的微小顆粒，其核酸可分為單股或雙股，線形或球形。病毒是最小的生物病原體，從20nm到300nm不等其中最大的是痘類病毒，例如痘苗病毒為 300nmX200nm，在普通光學(xué)顯微鏡下勉強(qiáng)可見；中等大小的病毒(如流行性感冒病)，直徑為80 IOOnm ；小型病毒(如流行性乙型腦炎病毒)，直徑為20nm，必須在電子顯微鏡下才能見到基礎(chǔ)病毒學(xué)，莽克強(qiáng)等著，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年第一版；分子病毒學(xué)，黃文林等著，人民衛(wèi)生出版社，2001年第一版。隨著病毒學(xué)和免疫學(xué)研究的進(jìn)展，人們對病毒性疾病(Viral diseases)的認(rèn)識也逐漸發(fā)展。最常用的病毒分類方式是根據(jù)核酸的性質(zhì)(RNA或DNA)來對病毒進(jìn)行分類，一般將病毒分為DNA病毒和RNA病毒。常見的致病性DNA病毒主要有人乳頭狀瘤病毒(HPV)、 乙肝病毒(HBV)、EB病毒等，常見的致病性RNA病毒包括流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARQ病毒以及流感病毒等基礎(chǔ)病毒學(xué)，莽克強(qiáng)等著，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年第一版；分子病毒學(xué)，黃文林等著，人民衛(wèi)生出版社，2001年第一版。病毒性疾病根據(jù)臨床表現(xiàn)及傳染方式，可以分為呼吸道病毒、蟲媒病毒、出疹性病毒、腸道病毒所致感染等。病毒性疾病往往引起比較嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，每每引起暴發(fā)流行。病毒感染后，除了短期內(nèi)引起感染所引起的局部炎癥外，長期的病毒感染可以導(dǎo)致腫瘤以及器官功能衰竭等嚴(yán)重的疾病，如HPV感染引起的宮頸癌、HBV感染引起的肝癌、肝硬化和肝功能衰竭、EB病毒引起的鼻咽癌、HIV引起的免疫功能缺陷和卡波濟(jì)氏肉瘤、SARS引起的呼吸功能衰竭以及流感病毒引起的呼吸功能障礙等基礎(chǔ)病毒學(xué)，莽克強(qiáng)等著，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年第一版；分子病毒學(xué)，黃文林等著，人民衛(wèi)生出版社，2001年第一版。我國是一個病毒性疾病高發(fā)的大國，如我國HBV感染患者估計有感染者1. 2億，是世界上最多的HBV大國；不能忘記的是2002年SARS在我國的大流行；另外，HIV以及可能的流感病毒爆發(fā)也時刻威脅著國民的身體健康。每一種流行性病毒感染都可以造成極大的人體健康和國民經(jīng)濟(jì)的損失，然而至今對抗病毒尚無特效藥，臨床治療重點(diǎn)就在對癥和保守治療，因此病毒性疾病的發(fā)病的分子和免疫學(xué)機(jī)理的研究和治療策略的研究具有重大的科學(xué)意義和顯示意義。干擾素(interferon，IFN)是一組體內(nèi)存在的、有廣泛生物活性的微量調(diào)節(jié)蛋白， 具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)活性，已被廣泛用于臨床。干擾素是病毒感染后宿主細(xì)胞釋放的具有抗病毒特性的糖蛋白。根據(jù)其生物學(xué)、生物化學(xué)、基因特征及細(xì)胞來源，可分為四種類型，S卩α、β、Y、ω型干擾素，分別來源于白細(xì)胞(單核/巨噬細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(T-cell和滋養(yǎng)層細(xì)胞)。干擾素具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)3種功能。其中α、β型IFN又稱為I型干擾素，在病毒性疾病的治療中具有重要地位。干擾素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的治療，如帶狀皰疹、皰疹性口咽、小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS等，可以抑制病毒的復(fù)制并調(diào)節(jié)病毒特異性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，是目前已經(jīng)得以證明并商業(yè)化應(yīng)用于臨床病毒性治療的有效生物制劑。多種病毒及非病毒病原誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生，是機(jī)體天然免疫反應(yīng)抗感染中的核心環(huán)節(jié)。宿主抗原識別受體(PRRs)能夠識別病原微生物固有元件介導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生。 大多數(shù)的外源菌誘導(dǎo)I型干擾素是通過胞膜關(guān)聯(lián)的toll樣受體途徑。例如，革蘭氏陰性菌脂多糖(LPQ能被Toll樣受體4識別，從而募集接頭蛋白TRIF活化下游激酶TBKl和 IKK ε，然后活化轉(zhuǎn)錄因子NF-K B和IRF3觸發(fā)I型干擾素基因轉(zhuǎn)錄。病原雙鏈RNA是在天然免疫反應(yīng)中誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生中一類潛在的活化物。 哺乳動物細(xì)胞中許多病原識別受體途徑的活化產(chǎn)生于識別病源雙鏈RNA。Toll樣受體 3 (TLR3)是第一個識別病毒雙鏈RNA的病原識別受體。TLR3識別雙鏈RNA并介導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生是通過TRIF依賴的信號途徑。胞內(nèi)核酸識別體含RNA螺旋酶蛋白RIG-I (視黃酸誘導(dǎo)基因I)和Mda5(黑色素瘤分化相關(guān)基因幻是胞內(nèi)識別雙鏈RNA的主要病原識別受體。 RIG-I和Mda5激活I(lǐng)型干擾素基因表達(dá)通過MAVS (IPS-1/Cardif/VISA)依賴的信號途徑， 活化IRF3和NF- κ B介導(dǎo)I型干擾素表達(dá)。除了識別含5-三磷酸組分的單鏈RNA(ssRNA) 外，RIG-I還能識別水泡性口炎病毒(VSV)等病毒來源的短片端雙鏈RNA。與此不同的是， Mda5識別腦心肌炎病毒(EMCV)等來源的長片端雙鏈RNA。是否還有一些未知的病原識別受體參與了胞內(nèi)雙鏈RNA的識別仍有待于進(jìn)一步研究。能否誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生以及能否抑制病毒的復(fù)制和擴(kuò)增是檢驗藥物治療病毒性疾病的非常有效的標(biāo)準(zhǔn)。富亮氨酸重復(fù)相互作用蛋白Lrrfipl (匪008515)最初鑒定為是一種能與哺乳動物細(xì)胞中果蠅Fli-I同源基因相互作用的蛋白。作為凝溶膠蛋白(gelsolin)家族成員， Lrrfipl在果蠅胚胎發(fā)育和肌肉形成過程中肌動蛋白的協(xié)調(diào)起重要作用。Lrrfipl主要分布于胞漿，能夠直接結(jié)合雙鏈RNA和富含GC雙鏈DNA。雖然已有的研究揭示了 Lrrfipl在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化發(fā)育等方面的作用，但是對于其免疫功能尤其是在病毒感染抵抗中的作用研究尚未見報道。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種可有效抵抗病毒感染、抑制炎性因子產(chǎn)生的免疫學(xué)活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的正是提供了 Lrrfipl蛋白或其編碼序列在有效抵抗病毒感染、 抑制病毒復(fù)制、促進(jìn)I型干擾素產(chǎn)生中的新用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了 Lrrfipl蛋白及其編碼序列在制備用于預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述病毒感染發(fā)生在選自下組的器官肝臟、脾臟、腦、腎臟或皮膚。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述Lrrfipl蛋白選自(a) SEQ ID NO 2 的氨基酸序列；(b)與SEQ ID NO :2氨基酸序列同源，且具有抑制病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的活性的多肽；以及(c) (a)或(b)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的、 且具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。在一個優(yōu)選例中，所述Lrrfipl蛋白及其編碼序列來自選自下組的對象人、大鼠、小鼠、犬、兔或牛。在一個優(yōu)選例中，Lrrfipl蛋白是天然純化的蛋白、化學(xué)合成的產(chǎn)物、或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生，優(yōu)選為人或小鼠Lrrfipl。在一個優(yōu)選例中，所述宿主選自細(xì)菌、酵母、高等動物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述Lrrfipl蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的分子；或(iii)與⑴或(ii)中的互補(bǔ)的分子。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述Lrrfipl蛋白及其編碼序列通過誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生來預(yù)防和/或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀。在另一個優(yōu)選例中，所述I型干擾素選自IFN-α和IFN-β，優(yōu)選為IFN-β。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個優(yōu)選例中，在給予本發(fā)明的藥物組合物之前、同時或之后，給予具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)。所述具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)選自臨床常用抗病毒藥物，優(yōu)選為選自下組的一種或多種抗甲型流感病毒表面Μ2受體、抗神經(jīng)氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述藥物組合物中Lrrfipl蛋白及其編碼序列占藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%o在一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物中Lrrfipl蛋白及其編碼序列占藥物組合物總重量的1 95wt%，優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。
在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白及其編碼序列；(B)預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)；以及(C)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個優(yōu)選例中，所述具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)選自臨床常用抗病毒藥物，優(yōu)選為選自下組的一種或多種包括抗甲型流感病毒表面M2受體、抗神經(jīng)氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗 HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的方法，所述方法包括給予需要預(yù)防或治療的對象有效量的Lrrfipl蛋白及其編碼序列。在一個優(yōu)選例中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述Lrrfipl蛋白及其編碼序列誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生，從而預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀。在另一個優(yōu)選例中，所述I型干擾素選自IFN- α和IFN- β，優(yōu)選為IFN- β。在另一優(yōu)選例中，所述病毒感染發(fā)生在選自下組的器官中皮膚、肝臟、腎臟、腦、 肺或脾臟。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1 :Lrrfipl增強(qiáng)水泡性口炎病毒(VSV)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生。圖2 =Lrrfipl增強(qiáng)雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生。圖3 :Lrrfipl介導(dǎo)VSV誘導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)活化。圖4 β-連環(huán)蛋白促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生，延長VSV感染小鼠的生存期。實施方式本發(fā)明人通過大量的研究和動物模型試驗，發(fā)現(xiàn)Lrrfipl在病毒感染性疾病中， 具有促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生、抑制病毒的復(fù)制以及病毒在體內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致的器官功能損傷的功能。在此，基礎(chǔ)上本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，針對IFN調(diào)節(jié)相關(guān)基因進(jìn)行應(yīng)用研究是病毒分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，將IFN促進(jìn)基因的核苷酸和蛋白質(zhì)應(yīng)用于病毒性疾病的預(yù)防和治療是人工干預(yù)病毒性感染的有效技術(shù)，因此無論是在功能基因組研究，還是病毒相關(guān)地基因治療方面均具有廣闊地應(yīng)用前景。本發(fā)明針對具有抗病毒作用的新型抗病毒分子Lrrfipl，對免疫細(xì)胞中巨噬細(xì)胞在微生物成分作用下的干擾素的產(chǎn)生進(jìn)行了研究。實驗顯示1)干擾Lrrfipl可以抑制VSV 病毒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IFN-β的產(chǎn)生；2)干擾Lrrfipl可以抑制病毒核酸模擬物dsRNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IFN-β的產(chǎn)生；3)干擾Lrrfipl可抑制VSV誘導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白活化，而β-連環(huán)蛋白缺陷可抑制VSV誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生，縮短VSV感染小鼠的生存期。通過上述試驗，本發(fā)明人證明了 Lrrfipl可促進(jìn)病毒感染后I型干擾素的產(chǎn)生，從而延長病毒感染個體的生存期或治療病毒感染相關(guān)的疾病。本發(fā)明針對Lrrfipl基因的不同的核苷酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用以促進(jìn)I型IFN的表達(dá)，延長病毒感染后實驗動物生存期。這些發(fā)明證實Lrrfipl的相關(guān)產(chǎn)物可望成為治療和預(yù)防病毒性疾病的有效手段。Lrrfipl 蛋白(多肽)如本文所用，術(shù)語“ Lrrf ip 1蛋白(多肽)”、“ Lrrfipl ”、可互換使用，是指SEQ ID NO 1的序列所編碼的蛋白質(zhì)或這些蛋白質(zhì)具有抗病毒作用的變異或修飾形式。例如，所述 Lrrfipl蛋白可選自(a) SEQ ID NO 2的氨基酸序列；或(b)與(a)限定的氨基酸序列同源，并具有抑制病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的蛋白本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等動物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明中Lrrfipl蛋白或多肽優(yōu)選由人Lrrfipl基因或其同源基因或家族基因編碼。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的Lrrfipl 蛋白或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有抑制炎性因子的活性?？刹捎幂椛浠虮┞队谡T變劑下來產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)來獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽?？衫镁幋a所述蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物，并觀察該轉(zhuǎn)基因動物對炎癥的抗性是否有所改良來篩選和鑒別所得蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。該術(shù)語還包括Lrrfipl蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與Lrrfipl蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、 以及利用抗Lrrfipl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含Lrrfipl蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 Lrrfil蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有Lrrfipl蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。Lrrfipl蛋白編碼基因如本文所用，術(shù)語“Lrrfipl基因”或“Lrrfipl蛋白編碼序列”可互換使用，均是指一種編碼本發(fā)明所述的Lrrfipl蛋白或多肽的序列，其可為SEQ ID N0:1的序列、在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達(dá)對IFN-β的產(chǎn)生和影響具有一定的抑制作用。本發(fā)明的Lrrfipl基因可選自(i)SEQ ID NO 1的序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交且具有抑制炎性因子活性的分子。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的Lrrfipl基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。應(yīng)理解，本發(fā)明的Lrrfipl基因優(yōu)選獲自人，獲自其它動物的與人Lrrfipl基因高度同源(如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80% 以上，更優(yōu)選85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。載體、宿主及轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明還涉及包含Lrrfipl基因的載體，以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及通過轉(zhuǎn)基因獲得高表達(dá)Lrrfipl的轉(zhuǎn)基因動物。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(kience，1984 ；224 1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Lrrfipl蛋白。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼Lrrfipl蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明中，術(shù)語“載體”與“重組表達(dá)載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、 噬菌體、酵母質(zhì)粒、動物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含Lrrfipl編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；動物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。本發(fā)明中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”、或“轉(zhuǎn)化動物”可互換使用，均指通過常規(guī)轉(zhuǎn)基因的方法獲得的轉(zhuǎn)入本發(fā)明Lrrfipl基因并穩(wěn)定高表達(dá)Lrrfipl蛋白或多肽的細(xì)胞、器官、組織或個體。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
I=I O藥物組合物或疫苗本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或疫苗，所述的組合物或疫苗含有有效量的本發(fā)明的Lrrfipl蛋白或其編碼序列，以及藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體。病毒感染可由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB 病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒、流感病毒。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和 “由……構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上/免疫學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和 /或動物所接受的量。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上/免疫學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體， 包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分， 且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington，s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、PH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的組合物中Lrrfipl蛋白或其編碼序列有效成分占組合物總重量的 0. 001 99. 9wt% ；優(yōu)選為組合物總重量的1 95wt%，較優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中 Lrrfipl蛋白或其編碼序列的含量為0. 01 2000mg/劑，優(yōu)選0. 1 1500mg/劑，更優(yōu)選 1 IOOOmg/劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，每天施用1 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用1 3劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為1齊U。應(yīng)理解，所用Lrrfipl蛋白或其編碼序列的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀?？刹捎?包括但不限于)如下的給藥途徑來給予本發(fā)明的活性物質(zhì)或組合物(1)直接裸DNA或者蛋白質(zhì)注射法；(2)將Lrrfipl的cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復(fù)合物連接， 以增強(qiáng)其生物效應(yīng)；(3)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與帶正電荷的脂類形成復(fù)合物，以克服磷酸骨架負(fù)電荷所致的穿越細(xì)胞膜的困難；(4)用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)DNA、mRNA和蛋白質(zhì)后介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，既有利于大分子的順利進(jìn)入又免受細(xì)胞外各種酶的水解作用；(5)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)與膽固醇結(jié)合使其胞漿保持時間增加10倍；(6)用免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)可使其特異性轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織和靶細(xì)胞；(7)將cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)體外轉(zhuǎn)染給轉(zhuǎn)載細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)也可較好地將 Lrrfipl相關(guān)藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)；或(8)電打孔(electroporation)，即借助于電流將cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)導(dǎo)入靶細(xì)胞。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和治療病毒感染性疾病的其它活性物質(zhì)，所述的其它活性物質(zhì)選自下組臨床常用抗病毒藥物(包括抗甲型流感病毒表面M2受體、抗神經(jīng)氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶、抗解旋酶)的一種或多種。本發(fā)明的Lrrfipl相關(guān)的核苷酸和蛋白質(zhì)藥物相互間可以聯(lián)合應(yīng)用，還可以與其它藥物和治療手段聯(lián)合，用于病毒感染性疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明揭示了 Lrrfipl及其編碼序列的新功能，即有效促進(jìn)病毒感染后I型 IFN的產(chǎn)生，并延長個體生存期；2.本發(fā)明提供了一種可有效促進(jìn)病毒感染后I型IFN的產(chǎn)生，并延長個體生存期的新型抗病毒感染性疾病藥物。
實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1 :Lrrfipl增強(qiáng)水泡性口炎病毒(VSV)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生小鼠(C57品系，雌性，4-6周齡，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購買)腹腔注射肉湯(購自Sigma) Iml/只，三天后，以PBS沖洗腹腔獲得原代腹腔巨噬細(xì)胞。以30nM LrrfiplsiRNA或?qū)φ誷iRNA(由上海吉凱公司合成)轉(zhuǎn)染所獲得的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞(細(xì)胞密度為2X IO6個/孔)，轉(zhuǎn)染試劑為INTERFERin試劑(購自法國 Polyplus公司，按廠商說明書操作)。轉(zhuǎn)染后48小時，以VSV(購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，MOI為10)感染細(xì)胞18小時。用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-β含量(所用試劑盒購自R&D公司)。LrrfiplsiRNA 5' -GGACCAGATTCAGGATGTAdTdT-3‘，SEQ ID NO. 3對照siRNA :5' -TTCTCCGAACGTGTCACGTdTdT-3‘，SEQ ID NO. 4IFN-β的ELISA分析的結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，siRNA介導(dǎo)的Lrrfipl缺失能夠抑制腹腔巨噬細(xì)胞中VSV誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)(**，P < 0. 01)。該結(jié)果表明，Lrrfipl可增強(qiáng)VSV誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生。實施例2 =Lrrfipl增強(qiáng)雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生在7巨噬細(xì)胞系(購自ATCC)中，轉(zhuǎn)染雙鏈病毒核酸模擬物(雙鏈 RNA, dsRNA)能顯著誘導(dǎo)干擾素-PmRNA的表達(dá)。小鼠巨噬細(xì)胞系7細(xì)胞以 LrrfiplsiRNA轉(zhuǎn)染(如實施例1所述)。轉(zhuǎn)染后M 小時，以 5. Ομ g/ml poly (I C) (dsRNA，購自 Amersham 公司)處理 4 小時，實時定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)IFN- β mRNA表達(dá)水平(所用試劑盒購自日本Τ0Υ0Β0公司)。 IFN-β 引物參照文獻(xiàn)An，H.等，Nat Immunol. 2008 ;9 :542-550。PCR 參數(shù)為94°C， 30Sec ；58°C,30Sec ；72°C,30Sec ；共30循環(huán)。以對照siRNA(如實施例1所述)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IFN- β mRNA表達(dá)水平作為1。IFN-β mRNA表達(dá)水平的實時定量PCR檢測結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，siRNA介導(dǎo)的Lrrfipl缺失能抑制dsRNA誘導(dǎo)的IFN-β mRNA的表達(dá)(**，P < 0. 01)。結(jié)果表明， Lrrfipl的存在可促進(jìn)雙鏈病毒核酸模擬物誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)。實施例3 =Lrrfipl介導(dǎo)VSV誘導(dǎo)的β -連環(huán)蛋白活化連環(huán)蛋白是一種參與多種基因轉(zhuǎn)錄共活化的多功能蛋白。為了研究連環(huán)蛋白是否作為Lrrfipl介導(dǎo)IFN-β表達(dá)的下游途徑，以LrrfiplsiRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞(如實施例1所述)。轉(zhuǎn)染后48小時，以VSV感染細(xì)胞(Μ0Ι為50)。采用Western印跡法檢測細(xì)胞內(nèi) β-連環(huán)蛋白磷酸化活化水平，并以總β-連環(huán)蛋白含量作為上樣對照。所用Western印跡化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Pierce公司；所用β -連環(huán)蛋白抗體購自Santa Cruz公司；所用磷酸化β-連環(huán)蛋白(Ser552)抗體購自Cell SignalingTechnology公司。磷酸化β-連環(huán)蛋白的Wfestern印跡分析結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示Lrrfipl缺失抑制VSV感染引起的β -連環(huán)蛋白第552位絲氨酸的磷酸化。因此，結(jié)果表明Lrrfipl促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生可能是通過促進(jìn)β -連環(huán)蛋白活化來完成的。實施例4 β-連環(huán)蛋白促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生，延長VSV感染小鼠的生存期β_連環(huán)蛋白基因缺陷小鼠的制備將表達(dá)IFN誘導(dǎo)性Mx啟動子調(diào)控的Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(Mx_Cre，購自美國 Jackson實驗室)與含有IoxP側(cè)翼序列β-連環(huán)蛋白基因的小鼠(β _連環(huán)蛋白lMp/1°xp，購自美國Jackson實驗室)雜交得到Mx-Cre χ β-連環(huán)蛋白1μρΛ°χρ小鼠。將250 yg poly(I: C)(購自Amersham公司)腹腔內(nèi)注射到β-連環(huán)蛋白loxp/loxp 和Mx-Cre χ β _連環(huán)蛋白lrap/1°xp小鼠中，每2天一次，共5次，以誘導(dǎo)β -連環(huán)蛋白缺陷 [Cobas, Μ.等，J Exp Med. 2004 ； 199 221-229]0末次注射后4天，小鼠腹腔注射巰基乙酸鹽(thioglycolate)提取腹腔巨噬細(xì)胞，或用VSV感染(Μ0Ι為10)。PCR檢測確認(rèn)Mx-Cre χ β -連環(huán)蛋白1μρΛ°χρ小鼠基因組中β -連環(huán)蛋白基因缺失 [Cobas,Μ.等，J Exp Med. 2004 ； 199 :221_229。因此將poly(I:C)處理的Mx-Cre χ β-連環(huán)蛋白1ΜΡ/1°ΧΡ小鼠命名為β-連環(huán)蛋白K°。poly (I: C)處理的β-連環(huán)蛋白1μρΛ°χρ小鼠則作為連環(huán)蛋白基因正常表達(dá)的對照小鼠。小鼠VSV感染后血清IFN-β含量的測定小鼠的VSV感染方法參照文獻(xiàn)Wang，C.等，Nat Immunol. 2009 ；10 :744_752。最后一次poly(I:C)處理后4天，β-連環(huán)蛋白^或β-連環(huán)蛋白1—小鼠靜脈內(nèi)注射VSV 或紫外線滅活的VSV(VSV-UV) (lxl06PFU/g)。感染后6小時，ELISA檢測血清中的IFN-β含量(所用試劑盒購自R&D公司)。小鼠VSV感染后生存期的測定最后一次poly (I: C)處理后4天，β -連環(huán)蛋白κ°或β -連環(huán)蛋白lrapA°xp小鼠(每組10只小鼠)靜脈內(nèi)注射VSV(lxl07PFU/g)。感染后檢測小鼠的生存期。血清IFN-β含量的ELISA檢測結(jié)果如圖4A所示。結(jié)果顯示β -連環(huán)蛋白敲除的腹腔巨噬細(xì)胞中VSV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生均顯著減少。這些結(jié)果表明β-連環(huán)蛋白調(diào)控了巨噬細(xì)胞中I型干擾素的表達(dá)。小鼠VSV感染后生存期的測定結(jié)果如圖4Β所示。結(jié)果顯示，與對照組在VSV注射M小時后80%生存率相比，β-連環(huán)蛋白缺陷小鼠的生存率僅20%。這些結(jié)果表明中 β-連環(huán)蛋白信號途徑可促進(jìn)天然抗病毒免疫反應(yīng)。結(jié)合實施例3中Lrrfipl可促進(jìn)β -連環(huán)蛋白活化的結(jié)論，Lrrfipl可通過β -連環(huán)蛋白信號途徑促進(jìn)天然抗病毒免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抗病毒的目的。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.富亮氨酸重復(fù)相互作用蛋白Lrrfipl及其編碼序列在制備用于預(yù)防和/或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人 獲得性免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述Lrrfipl蛋白選自(a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；(b)與SEQID NO :2氨基酸序列同源，且具有抑制病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀的活性的多肽；以及(c)(a)或(b)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的、且具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述Lrrfipl蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；( )在嚴(yán)格條件下與(i)限定的序列雜交、且具有預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/ 或征狀的分子；或(iii)與⑴或( )中的互補(bǔ)的分子。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述富亮氨酸重復(fù)相互作用蛋白Lrrfipl及其編碼序列來自選自下組的對象人、小鼠、大鼠、犬、兔或牛。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、 復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述預(yù)防和/或治療病毒感染相關(guān)疾病和/ 或征狀是通過促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生實現(xiàn)的。
8.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白和/或其編碼序列；以及(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中Lrrfipl蛋白及其編碼序列占藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%。
10.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的Lrrfipl蛋白和/或其編碼序列；(B)預(yù)防或治療病毒感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)；以及(C)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型病原體識別分子的抗病毒作用。具體而言，本發(fā)明涉及一種新型病原體識別分子Lrrfip1(富亮氨酸重復(fù)相互作用蛋白)的抗病毒作用、實施方法及用途。本發(fā)明提供這種分子在抗病毒感染過程中的應(yīng)用方法及相應(yīng)的免疫學(xué)原理，公開了這種分子在抗病毒感染中的用途和策略，特別是應(yīng)用于病毒感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。Lrrfip1分子可以促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生，并且延長病毒感染后個體生存期，從而用于抗病毒治療。
文檔編號A61P31/14GK102247605SQ201010177059
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者安華章, 曹雪濤, 李楠, 楊鵬遠(yuǎn) 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)