本技術(shù)涉及生物，特別涉及具有人類高度重復(fù)序列的mb級別基因組dna片段的從頭組裝合成策略。

背景技術(shù)：

1、合成生物學(xué)作為新興的交叉學(xué)科，打破了自然進(jìn)化的限制，以dna組裝技術(shù)為核心，在生物、醫(yī)藥、新材料等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。dna組裝技術(shù)是合成生物學(xué)領(lǐng)域近年來的關(guān)鍵技術(shù)，對于構(gòu)建大型代謝途徑和基因組起著決定性作用，其主要分為體內(nèi)組裝和體外組裝兩種方式。小片段dna因易于操作、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，通常采用體外組裝，但現(xiàn)有的各類體外dna組裝方法，在面對幾百kb的dna分子時，組裝難度大、操作流程繁瑣，并且多數(shù)方法在體外組裝完成后，仍需轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)進(jìn)行克隆和表達(dá)，這使得體外組裝技術(shù)的應(yīng)用受到較大限制。因此，大片段dna的組裝更多地依賴于具有高效同源重組能力的微生物體內(nèi)組裝。

2、目前，釀酒酵母、大腸桿菌等是常用的體內(nèi)dna組裝宿主菌。釀酒酵母具備高效的同源重組能力，在組裝微生物基因組等超大dna片段時具有顯著優(yōu)勢，但當(dāng)組裝300?kb的dna片段時，容易出現(xiàn)dna斷裂的問題，在克隆富含重復(fù)序列的片段時，還常發(fā)生片段丟失現(xiàn)象，導(dǎo)致合成錯誤率升高。大腸桿菌雖然具有易培養(yǎng)、分子操作簡便、對同源序列要求短，使得dna組裝周期短且便于轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，但大腸桿菌的遺傳物質(zhì)為游離的dna，無法實現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳。

3、人工合成釀酒酵母基因組計劃（sc2.0）致力于釀酒酵母全基因組的重新設(shè)計與化學(xué)再造，其核心目標(biāo)是實現(xiàn)12?mb釀酒酵母基因組的人工全合成，目前已成功設(shè)計合成8.5條完整的人工合成染色體。在這一過程中，基因組組裝是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。然而，由于釀酒酵母是真核生物，基因組片段長，組裝難度極大。當(dāng)前釀酒酵母染色體的組裝，短片段多通過體外構(gòu)建并利用大腸桿菌復(fù)制富集，稍長片段依賴酵母內(nèi)源同源重組機(jī)制，采用層級組裝方法。但這些方法存在組裝過程復(fù)雜、片段易丟失等問題，尤其是對于含有高度重復(fù)序列的區(qū)域，錯配現(xiàn)象頻發(fā)，難以滿足準(zhǔn)確合成完整染色體的需求。具體地：

4、（1）高度重復(fù)序列導(dǎo)致的錯配：在從頭合成人類基因組dna的研究中，超大片段dna的合成是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常規(guī)的超大片段dna合成常采用eswap-in同源臂連接的方式（參見圖1）。然而，當(dāng)面對基因組中含有高度重復(fù)序列的基因時，現(xiàn)有技術(shù)暴露出明顯的缺陷。例如，人類基因組中276?kb的synb區(qū)域，其內(nèi)部存在超過68個相似的基因片段。在使用傳統(tǒng)同源臂連接進(jìn)行合成時，這些高度相似的重復(fù)序列極易發(fā)生錯配，從而導(dǎo)致整個基因合成錯誤（參見圖2、圖3）。

5、（2）底盤生物選擇存在缺陷：現(xiàn)有的體內(nèi)組裝技術(shù)主要依賴于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及釀酒酵母等模式生物底盤。在大腸桿菌體系中，雖然研究者通過lambda-red系統(tǒng)開發(fā)出一系列構(gòu)建大片段dna的系統(tǒng)，如jason?chin團(tuán)隊開發(fā)的rexer和conexer系統(tǒng)結(jié)合crispr/cas9技術(shù)，實現(xiàn)了在大腸桿菌中組裝1.1?mb大小的人類基因組片段，但大腸桿菌作為原核生物，其遺傳物質(zhì)為裸露的環(huán)狀dna，缺乏細(xì)胞核，在處理復(fù)雜基因組時，無法很好地保留高級結(jié)構(gòu)，不利于含高度重復(fù)序列基因的穩(wěn)定合成。

6、因此，亟需一種簡便、高效且準(zhǔn)確的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)在合成含有高度重復(fù)序列基因的超大片段dna時的難題，實現(xiàn)對釀酒酵母完整染色體的精準(zhǔn)組裝。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本技術(shù)提供了具有人類高度重復(fù)序列的mb級別基因組dna片段的從頭組裝合成策略，采用酵母醋酸鋰組裝的方法組裝小片段，增加同源臂，>10倍的壓縮片段個數(shù)（每次組裝>10個片段），實現(xiàn)多個小片段的同步組裝，減少錯誤組裝發(fā)生；采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)多個大片段（40~100?kb）的拼接組裝；采用酵母有性生殖與cripsr介導(dǎo)的體內(nèi)組裝，避免體外提取易斷裂、再次導(dǎo)入細(xì)胞效率低的困難。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本技術(shù)提供以下技術(shù)方案：

3、本技術(shù)提供了一種超大片段人類高度重復(fù)序列的基因組dna的從頭合成方法，包括：大片段dna組裝和超大片段dna組裝；

4、其中，所述大片段dna組裝的步驟包括：

5、步驟（i）：合成長度為2~8?kb（可以是2,000?bp、2,500?bp、3,000?bp、3,500?bp、4,000?bp、4,500?bp、5,000?bp、5,500?bp、5,600?bp、5,700?bp、5,800?bp、5,900?bp、6,000bp、6,100?bp、6,200?bp、6,300?bp、6,400?bp、6,500?bp、6,600?bp、6,700?bp、6,800?bp、6,900?bp、7,000?bp、7,100?bp、7,200?bp、7,300?bp、7,400?bp、7,500?bp、7,600?bp、7,700bp、7,800?bp、7,900?bp或8,000?bp）的連續(xù)的一級dna片段，其中每個一級dna片段的3’末端含有與下一個一級dna片段的5’末端具有40~3,000?bp（可以是50?bp、60?bp、70?bp、80bp、90?bp、100?bp、200?bp、300?bp、400?bp、410?bp、420?bp、430?bp、440?bp、450?bp、460bp、470?bp、480?bp、490?bp、500?bp、510?bp、520?bp、530?bp、540?bp、550?bp、560?bp、570bp、580?bp、590?bp、600?bp、700?bp、800?bp、900?bp、1,000?bp、2,000?bp或3,000?bp）堿基序列相同的同源臂；

6、步驟（ii）：將步驟（i）中的相鄰的8~15個一級dna片段分別轉(zhuǎn)入n個釀酒酵母細(xì)胞染色體中，一級dna片段在釀酒酵母細(xì)胞中通過同源臂連接形成多級dna片段；

7、步驟（iii）：提取步驟（ii）的多級dna片段；

8、步驟（iv）：以步驟（iii）中的多級dna片段作為新的一級dna片段，并重復(fù)步驟（ii）、步驟（iii)直至形成長度為300~800?kb的大片段dna；

9、所述超大片段dna組裝的步驟包括：

10、步驟（v）：將步驟（iv）中的大片段dna每兩個一組分別轉(zhuǎn)入一對釀酒酵母染色體中，其中所述一對釀酒酵母中分別含有cas9表達(dá)質(zhì)粒和sgrna表達(dá)質(zhì)粒；

11、步驟（vi）：將步驟（v）中的所述一對釀酒酵母交配得到二倍體，所述二倍體中的sgrna與釀酒酵母染色體的特定位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)cas9進(jìn)行切割，所述釀酒酵母染色體在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到超大片段dna；

12、步驟（vii）：提取步驟（vi）中的超大片段dna；

13、步驟（viii）：以所述超大片段dna為新的大片段dna，重復(fù)步驟（v）~步驟（vii）直到得到完整的超大片段人類高度重復(fù)序列的基因組dna。

14、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的步驟（ii）為：以所述相鄰的8~15個一級dna片段為一組，每組與線性化pcc1bac一并轉(zhuǎn)入釀酒酵母中同源重組形成人工染色體；

15、步驟（iii）為：酶切人工染色體去除骨架分離出多級dna片段。

16、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的步驟（ii）的所述轉(zhuǎn)入包括通過醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入。

17、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的步驟（ii）的所述釀酒酵母細(xì)胞包括by4741。

18、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的步驟（v）的所述一對釀酒酵母分別為vl6-48和vl6-48a。

19、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的步驟（v）所述一對釀酒酵母中一者僅含有cas9表達(dá)質(zhì)粒，另一者僅含有sgrna表達(dá)質(zhì)粒。

20、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的步驟（v）為：將大片段dna與人工染色體骨架（prs414或prs416）通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中同源重組形成人工染色體；

21、步驟（vi）為：將步驟（v）中的所述一對釀酒酵母交配得到二倍體，所述二倍體中的sgrna與所述人工染色體的特定位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)cas9進(jìn)行切割，所述人工染色體在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到超大片段dna。

22、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法中識別所述特定位點(diǎn)的所述sgrna的序列如seq?id?no:?5、seq?id?no:?6、seq?id?no:?7或seq?id?no:?8所示。

23、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述從頭合成方法的所述cas9所識別的位點(diǎn)的序列如seq?id?no:?1、seq?id?no:?2、seq?id?no:?3或seq?id?no:?4所示。

24、本技術(shù)還提供了一種超大片段人類高度重復(fù)序列的基因組dna（可以是0.8~1.2mb、0.9~1.1?mb或1?mb）的組裝方法，包括：

25、使不同交配型的釀酒酵母a與釀酒酵母b交配，得到二倍體，所述二倍體中的sgrna與人工染色體a和人工染色體b的特定位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)cas9進(jìn)行切割，所述人工染色體a和人工染色體b在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到超大片段人類高度重復(fù)序列的基因組dna。

26、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法包括：

27、使不同交配型的釀酒酵母a與釀酒酵母b交配，釀酒酵母a或釀酒酵母b是何種交配型不作具體限定，只要交配型不相同且可以交配即可，交配后得到二倍體，所述二倍體中的sgrna與人工染色體a和人工染色體b的特定位點(diǎn)（即sgrna的靶標(biāo)位點(diǎn)）結(jié)合，介導(dǎo)cas9進(jìn)行切割，所述人工染色體a和人工染色體b在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到超大片段人類高度重復(fù)序列的基因組dna；

28、所述人工染色體a和sgrna來自釀酒酵母a，所述人工染色體b和cas9來自釀酒酵母b；

29、所述sgrna由sgrna表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)，所述cas9由cas9表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)；

30、所述人工染色體a具有500,000~600,000?bp（可以是500,000?bp、510,000?bp、520,000?bp、530,000?bp、540,000?bp、550,000?bp、560,000?bp、570,000?bp、580,000?bp、590,000?bp或600,000?bp）的合成片段a，所述人工染色體b具有500,000~600,000?bp（可以是500,000?bp、510,000?bp、520,000?bp、530,000?bp、540,000?bp、550,000?bp、560,000bp、570,000?bp、580,000?bp、590,000?bp或600,000?bp）的合成片段b，所述合成片段a與合成片段b具有同源臂；

31、所述特定位點(diǎn)不作具體限定，只要能夠讓所述人工染色體a和人工染色體b在釀酒酵母中發(fā)生可控的、預(yù)期內(nèi)的同源重組即可；

32、所述同源臂與所述靶標(biāo)位點(diǎn)可以是包含、重疊或相距0~100?bp的關(guān)系，可以是2bp、3?bp、4?bp、5?bp、6?bp、7?bp、8?bp、9?bp、10?bp、15?bp、20?bp、25?bp、50?bp或75?bp；

33、所述人工染色體a的組裝方法包括：使不同交配型的釀酒酵母a1與釀酒酵母a2交配，得到二倍體，所述二倍體中的sgrna與人工染色體a1和人工染色體a2的特定位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)cas9進(jìn)行切割，所述人工染色體a1和人工染色體a2在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到人工染色體a；

34、所述人工染色體a1和sgrna來自釀酒酵母a1，所述人工染色體a2和cas9來自釀酒酵母a2；

35、所述人工染色體a1具有200,000~400,000?bp（可以是200,000?bp、210,000?bp、220,000?bp、230,000?bp、240,000?bp、250,000?bp、260,000?bp、270,000?bp、280,000?bp、290,000?bp、300,000?bp、310,000?bp、320,000?bp、330,000?bp、340,000?bp、350,000?bp、360,000?bp、370,000?bp、380,000?bp、390,000?bp或400,000?bp）的合成片段a1，所述人工染色體a2具有200,000~400,000?bp（可以是200,000?bp、210,000?bp、220,000?bp、230,000bp、240,000?bp、250,000?bp、260,000?bp、270,000?bp、280,000?bp、290,000?bp、300,000bp、310,000?bp、320,000?bp、330,000?bp、340,000?bp、350,000?bp、360,000?bp、370,000bp、380,000?bp、390,000?bp或400,000?bp）的合成片段a2，所述合成片段a1與合成片段a2具有同源臂；

36、所述人工染色體b的組裝方法包括：使不同交配型的釀酒酵母b1與釀酒酵母b2交配，得到二倍體，所述二倍體中的sgrna與人工染色體b1和人工染色體b2的特定位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)cas9進(jìn)行切割，所述人工染色體b1和人工染色體b2在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到人工染色體b；

37、所述人工染色體b1和sgrna來自釀酒酵母b1，所述人工染色體b2和cas9來自釀酒酵母b2；

38、所述人工染色體b1具有200,000~400,000?bp（可以是200,000?bp、210,000?bp、220,000?bp、230,000?bp、240,000?bp、250,000?bp、260,000?bp、270,000?bp、280,000?bp、290,000?bp、300,000?bp、310,000?bp、320,000?bp、330,000?bp、340,000?bp、350,000?bp、360,000?bp、370,000?bp、380,000?bp、390,000?bp或400,000?bp）的合成片段b1，所述人工染色體b2具有200,000~400,000?bp（可以是200,000?bp、210,000?bp、220,000?bp、230,000bp、240,000?bp、250,000?bp、260,000?bp、270,000?bp、280,000?bp、290,000?bp、300,000bp、310,000?bp、320,000?bp、330,000?bp、340,000?bp、350,000?bp、360,000?bp、370,000bp、380,000?bp、390,000?bp或400,000?bp）的合成片段b2，所述合成片段b1與合成片段b2具有同源臂；

39、所述同源臂的長度為40~3,000?bp（可以是40?bp、50?bp、60?bp、70?bp、80?bp、90bp、100?bp、150?bp、200?bp、250?bp、300?bp、350?bp、400?bp、410?bp、420?bp、430?bp、440bp、450?bp、460?bp、470?bp、480?bp、490?bp、500?bp、510?bp、520?bp、530?bp、540?bp、550bp、560?bp、570?bp、580?bp、590?bp、600?bp、700?bp、800?bp、900?bp、1,000?bp、2,000?bp或3,000?bp）。

40、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述人工染色體a1、所述人工染色體a2、所述人工染色體b1或所述人工染色體b2的組裝方法包括：

41、將人工染色體載體骨架a和中等長度片段通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入釀酒酵母c，在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到所述人工染色體a1、所述人工染色體a2、所述人工染色體b1或所述人工染色體b2；

42、所述中等長度片段為4~7段，每段長度為40,000~71,000?bp（可以是40,000?bp、45,000?bp、50,000?bp、55,000?bp、60,000?bp、65,000?bp、71,000?bp或75,000?bp），首尾具有同源臂，能夠使各個中等長度片段之間首尾通過同源重組相接，組成合成片段c；

43、所述合成片段c與所述人工染色體載體骨架a具有同源臂，可使其相接成環(huán)；

44、所述同源臂的長度為40~3,000?bp（可以是40?bp、50?bp、60?bp、70?bp、80?bp、90bp、100?bp、150?bp、200?bp、250?bp、300?bp、350?bp、400?bp、450?bp、500?bp、550?bp、600bp、700?bp、800?bp、900?bp、1,000?bp、2,000?bp或3,000?bp）。

45、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述中等長度片段的組裝方法包括：

46、將人工染色體載體骨架b和小片段通過醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入釀酒酵母d，在釀酒酵母中發(fā)生同源重組，得到所述中等長度片段；

47、所述小片段為8~12段，每段長度為2,000~6,000?bp（可以是2,000?bp、2,500?bp、3,000?bp、3,500?bp、4,000?bp、4,500?bp、5,000?bp、5,500?bp、5,600?bp、5,700?bp、5,800bp、5,900?bp或6,000?bp），首尾具有同源臂，能夠使各個小片段之間首尾通過同源重組相接，組成合成片段d；

48、所述合成片段d具有酶切位點(diǎn)，能經(jīng)酶切形成粘性末端與線性化的所述人工染色體載體骨架b相接成環(huán)；

49、所述同源臂的長度為40~3,000?bp（可以是40?bp、50?bp、60?bp、70?bp、（可以是80bp、90?bp、100?bp、150?bp、200?bp、250?bp、300?bp、350?bp、400?bp、450?bp、500?bp、550bp、600?bp、700?bp、800?bp、900?bp、1,000?bp、2,000?bp或3,000?bp）。

50、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述釀酒酵母a、釀酒酵母b、釀酒酵母a1、釀酒酵母a2、釀酒酵母b1、釀酒酵母b2和/或釀酒酵母c為by4741菌株。

51、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的釀酒酵母d為by4741。

52、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述人工染色體載體骨架a為酵母人工染色體，可以是prs414和/或prs416。

53、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述人工染色體載體骨架b為pcc1bac。

54、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述酶切位點(diǎn)為noti。

55、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述人工染色體a具有ura3標(biāo)記，所述人工染色體b具有trp1標(biāo)記。

56、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的所述人工染色體a1具有ura3標(biāo)記，所述人工染色體a2具有trp1標(biāo)記，所述人工染色體b1具有ura3標(biāo)記，所述人工染色體b2具有trp1標(biāo)記。

57、在本技術(shù)的一些具體實施方案中，上述組裝方法的釀酒酵母可以替換為其他真核單細(xì)胞。

58、本發(fā)明有以下有益效果：

59、（1）提高合成準(zhǔn)確性：相比swap-in方法。本發(fā)明通過先合成中等長度片段，再逐步組裝成超大長度片段的策略，有效減少了高度重復(fù)序列在合成過程中的錯配概率，顯著提高了含有高度重復(fù)序列基因的超大片段dna合成的準(zhǔn)確性；

60、（2）相比現(xiàn)有的大腸桿菌合成體系，本發(fā)明利用酵母體系優(yōu)勢，充分發(fā)揮酵母作為真核生物在穩(wěn)定遺傳、具有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)以及保留dna高級結(jié)構(gòu)等方面的優(yōu)勢，為dna片段的準(zhǔn)確組裝提供了良好的環(huán)境，進(jìn)一步保障了合成過程的可靠性；

61、（3）拓展應(yīng)用范圍：本發(fā)明方法為從頭合成基因組領(lǐng)域提供了一種高效、準(zhǔn)確的技術(shù)手段，有助于推動對含有復(fù)雜重復(fù)序列基因組的研究，在合成生物學(xué)、基因治療、生物制藥等多個領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。