本發(fā)明涉及抗體，具體而言，涉及2種心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)的抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-type?fattyacid?binding?protein，簡稱h-fabp)是一種在心肌細胞中高度表達的蛋白質(zhì)，屬于脂肪酸結(jié)合蛋白(fabp)家族，它在脂肪酸代謝、細胞信號傳導(dǎo)以及能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。h-fabp是一種小分子量的蛋白質(zhì)，分子量約為15kda，由包含約134個氨基酸的單一多肽鏈組成。h-fabp的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的脂質(zhì)結(jié)合折疊模式，具有一個疏水性的內(nèi)部腔室，用于結(jié)合脂肪酸，與其他fabp蛋白相比，h-fabp的結(jié)構(gòu)具有更高的疏水性，使其在結(jié)合長鏈脂肪酸方面具有更高的親和力。
2、h-fabp主要在心肌細胞中表達，參與脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運和代謝，它能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)運脂肪酸進入細胞內(nèi)，促進脂肪酸的β-氧化，為心肌細胞提供能量。此外，h-fabp還參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，并在心肌細胞的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。研究表明，h-fabp的表達水平與心肌細胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)，其功能異常可能與心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。
3、h-fabp因其在心肌細胞中的高特異性和高靈敏性，被廣泛用于急性心肌梗死(ami)的早期診斷。在心肌細胞受損時，h-fabp會迅速釋放到血液中，因此其血清水平的升高可以作為心肌損傷的標(biāo)志物。與傳統(tǒng)的肌鈣蛋白檢測相比，h-fabp的檢測具有更快的診斷窗口期，能夠在發(fā)病后2-4小時內(nèi)檢測到顯著升高的水平，從而為早期診斷和治療提供重要依據(jù)。
4、此外，h-fabp還被用于評估心肌缺血的程度和預(yù)測患者的預(yù)后。研究表明，h-fabp水平的升高與心肌梗死的面積、心臟功能的惡化以及長期預(yù)后不良密切相關(guān)，因此，h-fabp在心血管疾病的診斷和管理中具有重要的臨床價值。
5、目前，h-fabp的檢測主要依賴于免疫分析技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、免疫比濁法、免疫熒光法和化學(xué)發(fā)光法等。這些方法具有高靈敏度和高特異性，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測血清或血漿中的h-fabp水平，且均需要特異性識別h-fabp且靈敏度高的h-fabp單抗才能得以實現(xiàn)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了針對心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)的單克隆抗體、試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明抗體對心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)具有高結(jié)合活性和親和力，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中痕量心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)的特異性、靈敏性、可靠性和精確性檢測。本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
2、本發(fā)明的第一個目的在于提供高質(zhì)量的心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)的抗體或其偶聯(lián)物，所述抗體或其偶聯(lián)物：
3、第一抗體包括：氨基酸序列如seq?id?no:1-3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；氨基酸序列如seq?id?no:4-6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
4、第二抗體包括：氨基酸序列如seq?id?no:11-13所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；氨基酸序列如seq?id?no:14-16所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
5、在本發(fā)明中，“cdr”、“cdrs”或“互補性決定區(qū)”是指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)，指包含一種或多種或者甚至全部的對抗體或抗原結(jié)合片段與其識別的抗原或表位的結(jié)合起作用的主要氨基酸殘基的區(qū)域。在本發(fā)明具體實施方式中，cdrs是指所述抗體的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)。
6、在本發(fā)明中，重鏈互補決定區(qū)用hcdr表示，其包括hcdr1、hcdr2和hcdr3；輕鏈互補決定區(qū)用lcdr表示，其包括lcdr1、lcdr2和lcdr3。
7、cdr的定義方法是本領(lǐng)域公知的，cdr定義方法包括：kabat定義、chothia定義、imgt定義、contact定義和abm定義。如本文所述，“kabat定義”是指kabat等，u.s.dept.ofhealth?and?human?services，“sequence?of?proteins?of?immunologicalinterest”(1983)所述的定義系統(tǒng)?！癱hothia定義”參見chothia等，j?mol?biol?196：901-917(1987)。還有其他cdr定義方法可能不嚴(yán)格遵循上述方案之一，但仍會與kabat定義的cdr區(qū)的至少一部分重疊，盡管根據(jù)特定殘基或殘基組的預(yù)測或?qū)嶒灲Y(jié)果可能會縮短或延長它們。
8、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述hcdr1，hcdr2，hcdr3，lcdr1，lcdr2或lcdr3由kabat、chothia、imgt、abm或contact任意一種系統(tǒng)或多種系統(tǒng)組合定義。
9、在本發(fā)明中，抗體偶聯(lián)物由抗體與標(biāo)記物或固相載體偶聯(lián)。所述標(biāo)記物選自酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光染料標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光染料標(biāo)記、納米顆粒標(biāo)記、放射性標(biāo)記中的一種或多種；固相載體選自微球、板或膜。
10、在可選的實施方式中，上述標(biāo)記物是指具有能夠被肉眼直接觀察或被儀器檢測或探測到的特性例如發(fā)光、顯色、放射性等特性的一類物質(zhì)，通過該特性可以實現(xiàn)對相應(yīng)目標(biāo)物的定性或定量檢測。包括但不限于熒光染料、酶、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光試劑和納米顆粒類標(biāo)記物。
11、在實際的使用過程中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)檢測條件或?qū)嶋H需要選擇合適的標(biāo)記物，無論使用何種標(biāo)記物，其均屬于本發(fā)明的保護范圍。
12、在可選的實施方式中，所述熒光染料包括但不限于熒光素類染料及其衍生物(例如包括但不限于異硫氰酸熒光素(fitc)羥基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其類似物)、羅丹明類染料及其衍生物(例如包括但不限于紅色羅丹明(rbitc)、四甲基羅丹明(tamra)、羅丹明b(tritc)等或其類似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其類似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其類似物)和蛋白類染料及其衍生物(例如包括但不限于藻紅蛋白(pe)、藻藍蛋白(pc)、別藻藍蛋白(apc)、多甲藻黃素-葉綠素蛋白(precp)等)。
13、在可選的實施方式中，所述酶包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶以及6-磷酸葡萄糖脫氧酶。
14、在可選的實施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212bi、131i、111in、90y、186re、211at、125i、188re、153sm、213bi、32p、94mtc、99mtc、203pb、67ga、68ga、43sc、47sc、110min、97ru、62cu、64cu、67cu、68cu、86y、88y、121sn、161tb、166ho、105rh、177lu、172lu和18f。
15、在可選的實施方式中，所述化學(xué)發(fā)光試劑包括但不限于魯米諾及其衍生物、光澤精、甲殼動物熒光素及其衍生物、聯(lián)吡啶釕及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧環(huán)乙烷及其衍生物、洛粉堿及其衍生物和過氧草酸鹽及其衍生物。
16、在可選的實施方式中，所述納米顆粒類標(biāo)記物包括但不限于納米顆粒、膠體、有機納米顆粒、磁性納米顆粒、量子點納米顆粒和稀土絡(luò)合物納米顆粒。
17、在可選的實施方式中，所述膠體包括但不限于膠體金屬、膠體碳、分散型染料、染料標(biāo)記的微球和乳膠。
18、在可選的實施方式中，所述膠體金屬包括但不限于膠體金、膠體銀和膠體硒。
19、在可選的實施方式中，所述膠體金屬為膠體金。
20、在可選的實施方式中，上述抗體偶聯(lián)物還包括與所述抗體或其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)的固相載體。
21、在可選的實施方式中，所述固相載體選自微球、板和膜。
22、在可選的實施方式中，所述固相載體包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑膠微粒、微孔板、玻璃、毛細管、尼龍和硝酸纖維素膜。
23、在本發(fā)明中，所述抗體為全長抗體或其抗原結(jié)合區(qū)域；所述抗原結(jié)合區(qū)域選自fab片段、f(ab)2片段、fv片段、(fv)2片段、scfv片段和sc(fv)2片段中的至少一種。
24、本發(fā)明所述第一抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.8所示。
25、本發(fā)明所述第二抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.17所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.18所示。
26、本發(fā)明實施例中第一抗體的重鏈氨基酸序列如seq?id?no.9所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.10所示。
27、本發(fā)明實施例中第二抗體的重鏈氨基酸序列如seq?id?no.19所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.20所示。
28、本發(fā)明的第二個目的在于提供一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)的檢測試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒包括上述第一抗體和/或第二抗體。
29、在可選的實施方式中，所述試劑包括捕獲試劑和檢測試劑，所述捕獲試劑和檢測試劑中各包括一種不同序列的心型脂肪酸結(jié)合蛋白的抗體或其偶聯(lián)物，所述不同序列的心型脂肪酸結(jié)合蛋白抗體為針對不同抗原表位的抗體，在具體實施例中的組合方式包括：1)捕獲試劑中包括第一抗體或其偶聯(lián)物；2)捕獲試劑中包括第二抗體或其偶聯(lián)物；3)檢測試劑中包括第一抗體或其偶聯(lián)物；4)檢測試劑中包括第二抗體或其偶聯(lián)物；5)捕獲試劑中包括第一抗體或其偶聯(lián)物，檢測試劑中包括第二抗體或其偶聯(lián)物；6)捕獲試劑中包括第二抗體或其偶聯(lián)物，檢測試劑中包括第一抗體或其偶聯(lián)物。
30、在可選的實施方式中，所述試劑可以用于免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、膠乳免疫比濁法等涉及到利用心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)和其抗體特異性結(jié)合性能的檢測。例如，在熒光免疫層析法中，樣品中的抗原與熒光標(biāo)記的第一抗體在結(jié)合墊上結(jié)合，溶液因吸水墊的虹吸作用發(fā)生層析，向吸水墊方向移動。當(dāng)復(fù)合物移動到檢測線時，與t線上的包被抗體結(jié)合，形成“三明治”型復(fù)合物并富集在t線上。在化學(xué)發(fā)光法中，樣品中的抗原與包被在磁珠上的第一抗體結(jié)合，清洗后再與酶標(biāo)記的第二抗體(通常為辣根過氧化物酶hrp或堿性磷酸酶ap)結(jié)合，形成“固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”夾心復(fù)合物?？梢岳斫獾氖?，第一、第二抗體在此處并非特指本發(fā)明的某一具體序列，理論上，只要形成“雙抗夾心”免疫復(fù)合物的兩株抗體分別結(jié)合抗原的不同表位，因此，捕獲試劑和檢測試劑中的兩株抗體理論上并不是特定的，可以互換。
31、本發(fā)明的第三個目的在于提供第一和/或第二抗體或其偶聯(lián)物在制備檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)產(chǎn)品中的用途。