本發(fā)明屬于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，具體涉及一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
1、體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)是縮短世代間隔、進(jìn)行品種改良的重要技術(shù)手段，而卵母細(xì)胞體外成熟是該環(huán)節(jié)的第一步，獲得高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞是體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)成敗的關(guān)鍵。
2、卵母細(xì)胞體外成熟是指從卵巢卵泡上獲取未成熟的卵母細(xì)胞，將其置于體外培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，使卵母細(xì)胞成熟并具備受精能力的技術(shù)。卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中極易受到各種因素的影響，例如卵巢運(yùn)輸溫度、卵巢質(zhì)量、卵泡大小、培養(yǎng)液成分及培養(yǎng)時(shí)間等。與體內(nèi)成熟不同的是，體外卵母細(xì)胞與卵泡分離，使得微環(huán)境中camp（環(huán)磷酸腺苷）濃度驟然降低，卵母細(xì)胞自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂進(jìn)程，極大概率出現(xiàn)核質(zhì)成熟不一致現(xiàn)象，導(dǎo)致體外成熟的卵母細(xì)胞發(fā)育潛能差；另一方面，卵母細(xì)胞中過(guò)量產(chǎn)生的ros（活性氧）會(huì)造成氧化應(yīng)激，損害卵母細(xì)胞質(zhì)量，使得成熟率較低。因此，提高體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量是推動(dòng)體外胚胎生產(chǎn)的重中之重。
3、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（bdnf）作為一種被廣泛研究的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，也被稱為卵巢內(nèi)分泌因子。大量研究證據(jù)表明，bdnf在卵巢卵泡發(fā)育中發(fā)揮作用。bdnf通過(guò)與特異性親和受體trkb結(jié)合調(diào)控卵泡發(fā)育，其在卵丘和卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)水平的高低取決于卵泡發(fā)育的不同階段，在中腔卵泡中表達(dá)最高。
4、bdnf-trkb可保護(hù)神經(jīng)元免受ros誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；但未有相關(guān)證據(jù)表明bdnf可作為一種成熟促進(jìn)因子，應(yīng)用在牛卵母細(xì)胞體外成熟中?；诖耍F(xiàn)有技術(shù)中亟需一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，以提高體外成熟牛卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高早期胚胎發(fā)育能力，利于提高牛體外胚胎生產(chǎn)效率、加快良種擴(kuò)繁。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的第一目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，以提高體外成熟牛卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高早期胚胎發(fā)育能力。
2、本發(fā)明的第一目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，包括牛卵母細(xì)胞體外成熟液和bdnf，在所述培養(yǎng)液中，所述bdnf的濃度為10-100ng/ml。
3、進(jìn)一步的，在所述培養(yǎng)液中，所述bdnf的濃度為50?ng/ml。
4、進(jìn)一步的，所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液包括m199培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1％的青霉素和鏈霉素混合液、0.02?iu/ml?促卵泡激素（fsh）及0.02?iu/ml促黃體生成素（lh）。
5、本發(fā)明的第二目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法，以提高體外成熟牛卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高早期胚胎發(fā)育能力。
6、本發(fā)明的第二目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下內(nèi)容：將卵母細(xì)胞加入到所述的促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)前，所述促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液需在38?.5℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中預(yù)平衡2h以上。
7、本發(fā)明的第三目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供bdnf促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的應(yīng)用。
8、本發(fā)明的第三目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：bdnf在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用，將bdnf與牛卵母細(xì)胞體外成熟液配置成促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，在該培養(yǎng)液中，所述bdnf的濃度為50?ng/ml；所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液包括m199培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1％的青霉素和鏈霉素混合液、0.02?iu/ml?促卵泡激素及0.02?iu/ml?促黃體生成素；將卵母細(xì)胞加入到促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。
9、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能顯著提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率，顯著促進(jìn)皮質(zhì)顆粒和線粒體的正確分布，顯著提高線粒體拷貝數(shù)，顯著提高卵母細(xì)胞線粒體膜電位水平，從而提高體外成熟牛卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高早期胚胎發(fā)育能力。
1.一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，其特征在于：包括牛卵母細(xì)胞體外成熟液和bdnf，在所述培養(yǎng)液中，所述bdnf的濃度為10-100?ng/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，其特征在于：在所述培養(yǎng)液中，所述bdnf的濃度為50ng/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，其特征在于：所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液包括m199培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1％的青霉素和鏈霉素混合液、0.02?iu/ml?促卵泡激素（fsh）及0.02?iu/ml?促黃體生成素（lh）。
4.一種促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下內(nèi)容：將卵母細(xì)胞加入到權(quán)利要求3所述的促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)前，所述促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液需在38?.5℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中預(yù)平衡2h以上。
5.bdnf在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用，其特征在于：將bdnf與牛卵母細(xì)胞體外成熟液配置成促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，在該培養(yǎng)液中，所述bdnf的濃度為50ng/ml；所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液包括m199培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1％的青霉素和鏈霉素混合液、0.02?iu/ml?促卵泡激素及0.02?iu/ml?促黃體生成素；將卵母細(xì)胞加入到促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。