本發(fā)明涉及細(xì)胞工程與基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種marc145細(xì)胞的改造方法。
背景技術(shù)：
1、marc145細(xì)胞系源自猴成纖維細(xì)胞系?ma104，因其對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（prrsv）具有較高的敏感性，常被用于prrsv的相關(guān)研究，是體外研究prrsv感染機(jī)制、病毒復(fù)制以及評(píng)估抗病毒策略等方面的重要細(xì)胞模型。但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，野生型的marc145細(xì)胞對(duì)prrsv病毒的敏感性及病毒顆粒釋放效率有限，制約了疫苗生產(chǎn)與病毒研究，需要進(jìn)一步的優(yōu)化。
2、通過(guò)基因工程技術(shù)改造marc145細(xì)胞的前景雖然展現(xiàn)出巨大的潛力，但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)。如通過(guò)敲除tbk1基因可以提高?marc145細(xì)胞對(duì)某些prrsv毒株的復(fù)制能力，然而，這種基因改造可能會(huì)帶來(lái)其他潛在的風(fēng)險(xiǎn)，如細(xì)胞功能的改變或?qū)ζ渌《镜拿舾行栽黾?；rnai技術(shù)可以抑制病毒復(fù)制，但可能影響細(xì)胞的正常功能。由此看來(lái)，盡管基因工程技術(shù)可以提供多種改造marc145細(xì)胞的手段，但其改造方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種marc145細(xì)胞的改造方法。
2、本發(fā)明的目的在于提供一種marc145細(xì)胞。
3、為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
4、一種marc145細(xì)胞的改造方法，所述改造方法是采用慢病毒載體介導(dǎo)多基因共表達(dá)的方式改造marc145細(xì)胞，所述基因包含marc145細(xì)胞的cd151基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv的nsp2基因和nsp11基因，所述cd151基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述nsp2基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述nsp11基因的核苷酸序列如seq?idno.3所示。
5、一種采用所述的改造方法改造的marc145細(xì)胞系。
6、一種擴(kuò)繁prrsv病毒的方法，采用所述的marc145細(xì)胞系擴(kuò)繁prrsv病毒。
7、一種所述的marc145細(xì)胞系在研究病毒致病機(jī)制與制備新型疫苗中的應(yīng)用。
8、優(yōu)選的，所述慢病毒載體介導(dǎo)多基因共表達(dá)的方式包含以下步驟：
9、s1.?采用慢病毒載體分別與marc145細(xì)胞的cd151基因、prrsv的nsp2基因和nsp11基因連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得三個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒；
10、s2.?分別將三個(gè)重組慢病毒載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒按一定比例混合，共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，獲得三個(gè)包裝后的重組慢病毒；
11、s3.?采用步驟s2獲得的慢病毒毒液感染marc145細(xì)胞，并加入8μg/ml?聚凝胺，感染12h，更換為新鮮dmem+10%fbs培養(yǎng)基；
12、s4.?感染72小時(shí)后，加入2μg/ml嘌呤霉素篩選?2?周，傳代3-5次至生長(zhǎng)穩(wěn)定，獲得改造后的陽(yáng)性克隆，凍存。
13、優(yōu)選的，所述慢病毒載體為plv41tr-puro-cmv。
14、優(yōu)選的，步驟s2所述包裝質(zhì)粒為pspax2、pmd2.g。
15、一種所述的三個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒在提高病毒prrsv感染敏感性中的應(yīng)用。
16、相較于原有技術(shù)，現(xiàn)在發(fā)明的有益效果是：
17、本發(fā)明提供了能夠有效提高細(xì)胞對(duì)prrsv敏感性的三個(gè)質(zhì)粒，具有廣譜適用性。其中plv41tr-puro-cmv-cd151，除prrsv外，對(duì)依賴(lài)?cd151?受體的其他病毒（如登革病毒）亦有增殖促進(jìn)作用，plv41tr-puro-cmv-nsp2、plv41tr-puro-cmv-nsp11可用于提高prrsv敏感性的細(xì)胞。三個(gè)基因不同的組合轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，對(duì)prrsv效價(jià)提升有不同程度的影響。其中nsp11可抑制宿主免疫，nsp2可以促進(jìn)復(fù)制，nsp2/nsp11/cd151共表達(dá)可同時(shí)增強(qiáng)病毒吸附，較單一基因改造提升效價(jià)0.75-1.25?log10tcid50，篩選單克隆細(xì)胞可進(jìn)一步提高收獲病毒效價(jià)。
18、本發(fā)明提供的基因工程改造細(xì)胞的方法可以應(yīng)用于多種動(dòng)物細(xì)胞，且可用于病毒致病機(jī)制與制備新型基因工程疫苗的研究。本發(fā)明的提出為豬藍(lán)耳病的防治提供了新的技術(shù)手段，為家畜病的疫苗研發(fā)開(kāi)拓了思路，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。
19、在prrsv病毒感染細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞受體起著關(guān)鍵作用。受體cd151作為細(xì)胞表面四次跨膜蛋白，參與病毒吸附與侵入，對(duì)深入理解prrsv的感染機(jī)制具有重要意義。
20、傳統(tǒng)細(xì)胞馴化方法周期長(zhǎng)、隨機(jī)性高。慢病毒載體可定向改造細(xì)胞，作為一種常用的基因傳遞工具，具有能夠高效感染多種類(lèi)型細(xì)胞、可將外源基因穩(wěn)定整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)。在prrsv研究領(lǐng)域，慢病毒載體可用于將特定基因?qū)雖arc-145細(xì)胞，從而在細(xì)胞水平上深入研究這些基因?qū)rrsv感染、復(fù)制以及細(xì)胞免疫應(yīng)答等過(guò)程的影響。通過(guò)利用慢病毒載體構(gòu)建相關(guān)的細(xì)胞模型，有助于進(jìn)一步揭示prrsv與宿主細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)prrsv的新型抗病毒策略，如設(shè)計(jì)更有效的疫苗、研發(fā)抗病毒藥物等提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.一種marc145細(xì)胞的改造方法，其特征在于，所述改造方法是采用慢病毒載體介導(dǎo)多基因共表達(dá)的方式改造marc145細(xì)胞，所述基因包含marc145細(xì)胞的cd151基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv的nsp2基因和nsp11基因，所述cd151基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述nsp2基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述nsp11基因的核苷酸序列如seqid?no.3所示。
2.一種采用權(quán)利要求1所述的改造方法改造的marc145細(xì)胞系。
3.一種擴(kuò)繁prrsv病毒的方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求2所述的marc145細(xì)胞系擴(kuò)繁prrsv病毒。
4.一種權(quán)利要求2所述的marc145細(xì)胞系在研究病毒致病機(jī)制與制備新型疫苗中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的marc145細(xì)胞的改造方法，其特征在于，所述慢病毒載體介導(dǎo)多基因共表達(dá)的方式包含以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的marc145細(xì)胞的改造方法，其特征在于，所述慢病毒載體為plv41tr-puro-cmv。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的marc145細(xì)胞的改造方法，其特征在于，步驟s2所述包裝質(zhì)粒為pspax2、pmd2.g。
8.一種如權(quán)利要求5所述的三個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒在提高病毒prrsv感染敏感性中的應(yīng)用。