本發(fā)明與皿培式牛樟芝(antrodiacinnamomea)中活性成分有關(guān)，更詳而言之是指一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法者。

背景技術(shù)：

牛樟芝子實體所含的多種化合物、三萜類活性成分，已被不少研究證實具有抗腫瘤、抑制癌細(xì)胞生長的功效，如刊登在“活體外毒理學(xué)(toxicologyinvitro)”期刊的馬偕一號(mmh01)(“去氫硫色多孔菌酸化合物(dehydrosulphurenicacid)”)，及登載在“國際老人醫(yī)學(xué)期刊(internationaljournalofgerontology)”的馬偕二號(mmh02)(羊毛甾烷(lanostane)三萜類成分)等，而已知生產(chǎn)牛樟芝的技術(shù)中，利用皿培方式生產(chǎn)牛樟芝，不僅生長速度快，且萃取物的抗癌效果更得到提升，并可減少牛樟樹被砍伐、加強民眾的環(huán)保意識。

已知關(guān)于牛樟芝抗癌成分、化合物制備的專利甚多，例如，中國專利cn102232944b、cn102000047b、cn102232945b、cn102232940b、cn102232943b、cn102232942b、cn102232941b、cn102443613、cn104177240a，及美國專利us8546366等，已揭露牛樟芝萃取物中的化合物可抑制癌細(xì)胞生長。

其次，已知自牛樟芝中萃取三萜類化合物成分的專利亦不少，例如，中國專利cn102614195a與美國公開第2010/0210869a1號公開案，以乙醇溶液、正己烷溶液或乙酸乙酯溶液，依次對牛樟芝子實體進(jìn)行麥角甾醇(ergosterol)與羊毛甾醇(lanosterol)三萜類成分的萃取。美國專利us7994158b2以水或有機溶劑(如醋酸、乙酸乙酯、苯、醇類、二氯甲烷等)對牛樟芝進(jìn)行萃取，得到的水或有機溶劑萃取物，再經(jīng)硅膠、sephadex吸收、濃縮和純化。中國發(fā)明公開cn101555436與中華民國發(fā)明第i487531號專利，利用溶劑(乙醇)混合于超臨界co2，再通入置放有固態(tài)牛樟芝的萃取槽中進(jìn)行萃取，不是萃取過程沒有達(dá)成穩(wěn)定狀態(tài)，牛樟芝的機能成分會不穩(wěn)定地被萃取出來，即是采固液分離且批式的萃取方式，無法純化其機能成分、生產(chǎn)成本高。

由上可知，已知牛樟芝三萜類活性成分的萃取方法，大多是利用有機溶劑萃取后再進(jìn)行濃縮、分離與純化，制作過程冗長繁復(fù)，且有機溶劑易殘留，造成毒害與安全性疑慮，而已知超臨界流體萃取是將溶劑與co2直接混合后進(jìn)入 進(jìn)行萃取，需要大量的測試及工作經(jīng)驗，且需經(jīng)過純化步驟。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的即在提供一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其在超臨界狀態(tài)下，以最少量的乙醇溶劑與超臨界二氧化碳流體即可達(dá)到平衡，并有最大的分離效果，可達(dá)到萃取與分離出三萜類化合物活性成分的功效，且通過多種細(xì)胞檢測技術(shù)，證實所制備的三萜類化合物活性成分確實具有抗癌效果，實為安全、環(huán)保與節(jié)能的有效方式。

于是，為達(dá)成前述的目的，本發(fā)明提供一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其步驟至少包含有：備取牛樟芝：將1-2kg的皿培式牛樟芝放置于一萃取槽內(nèi)；萃取與分離：在操作壓力2000-4000psi、溫度40-60℃的操作條件下，將超臨界狀態(tài)溶劑以3-9l/hr流速通入該萃取槽進(jìn)行萃取，超臨界狀態(tài)溶劑為超臨界co2流體與乙醇以1：0.1-0.2(v/v)的體積比例混合至飽和狀態(tài)，萃取30-60分鐘后，將牛樟芝萃取物通入一層析管柱，利用該層析管柱將牛樟芝萃取物分離出雜質(zhì)與三萜類化合物，雜質(zhì)可自該層析管柱的底部去除，另自該層析管柱的頂部取出高濃度三萜類化合物；檢測：通過細(xì)胞毒性試驗、細(xì)胞形態(tài)變化分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測及細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析，檢測三萜類化合物的抗癌效果。

更進(jìn)一步地，檢測的步驟中，細(xì)胞毒性試驗的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一96孔培養(yǎng)盤(10,000cells/well)內(nèi)200μl的完全培養(yǎng)基(mccoy’s5a)中，預(yù)定時間后將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物0.25-1.0mg/ml的完全培養(yǎng)基，并加入到96孔培養(yǎng)盤的不同孔中；另外，對照組則只加入200μl的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)預(yù)定時間后，以四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，mtt)

比色法分析測定每孔中的活細(xì)胞數(shù)量比值，并以免疫酵素分析儀(elisareader)在570nm下測定吸光值。

更進(jìn)一步地，為1天后將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后以四甲基偶氮唑鹽比色法測定每孔中的活細(xì)胞數(shù)量比值。

更進(jìn)一步地，檢測的步驟中，細(xì)胞形態(tài)變化分析的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一培養(yǎng)盤，預(yù)定時間待細(xì)胞貼底后，給予適量含有三萜類化合物1.0mg/ml的樣品，并置于培養(yǎng)盤中預(yù)定時間后，以倒立顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

更進(jìn)一步地，該培養(yǎng)盤為皮氏培養(yǎng)皿，等待細(xì)胞貼底時間為1天，而細(xì)胞貼 底后給予含有三萜類化合物樣品并置于培養(yǎng)盤的時間為2、7、14、21、28天。

更進(jìn)一步地，檢測的步驟中，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測的方式，為將大腸癌細(xì)胞株經(jīng)三萜類化合物1.0mg/ml處理后，以胰蛋白-乙二胺四乙酸處理細(xì)胞，與培養(yǎng)液一起收集，離心后去掉上清液，并以4℃磷酸鹽緩沖溶液清洗后，加入1ml冰冷的75％酒精，放入4℃冰箱預(yù)定時間以固定細(xì)胞。離心后，續(xù)以1ml磷酸鹽緩沖溶液懸浮，加入50mg/ml的碘化丙錠避光作用預(yù)定時間，以532nm波長激發(fā)后，在590±40nm波長偵測細(xì)胞熒光含量，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

更進(jìn)一步地，所述避光作用為10分鐘。

更進(jìn)一步地，檢測的步驟中，細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一6孔培養(yǎng)盤(800,000cells/well)內(nèi)，培養(yǎng)于2ml的完全培養(yǎng)基，預(yù)定時間后，先用200μl滴管尖頭畫出一條直線，再將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物0.25-1.0mg/ml的完全培養(yǎng)基加到培養(yǎng)盤的不同孔中，并在100倍顯微鏡下拍照記錄day0的直線寬度。另外，對照組則只置換成2ml的完全培養(yǎng)基、無其他添加物，將該培養(yǎng)盤靜置24小時，并拍照記錄day1直線寬度密合的程度，最后以一量測軟件測量每張圖上任意5點的寬度變化，每個條件可得至少25個測量數(shù)據(jù)，比較day0與day1的平均數(shù)據(jù)，即可計算出細(xì)胞爬行比率。

更進(jìn)一步地，將大腸癌細(xì)胞株培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基內(nèi)為1天，該量測軟件為imagej軟件。

此外，本發(fā)明更提供一種抗癌成分三萜類化合物，為依據(jù)前述方法所制備。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法及該三萜類化合物，該方法在超臨界狀態(tài)下，以最少量的乙醇溶劑與超臨界二氧化碳流體即可達(dá)到平衡，并有最大的分離效果，可達(dá)到萃取與分離出三萜類化合物活性成分的功效，且通過多種細(xì)胞檢測技術(shù)，證實其卻有抗癌效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一較佳實施例的流程圖。

圖2為本發(fā)明一較佳實施例所制備的三萜類化合物與已知乙醇萃取的hplc圖譜圖。

圖3a為已知乙醇萃取組在48小時內(nèi)下大腸癌細(xì)胞株(hct116cells)在不同稀釋濃度的存活率比例圖。

圖3b為本發(fā)明一較佳實施例所制備的三萜類化合物(sfefractionation)在48小時內(nèi)下大腸癌細(xì)胞株(hct116cells)在不同稀釋濃度的存活率比例圖。

圖4a為在對照組作用下大腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。

圖4b為在乙醇萃取組作用下大腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。

圖4c為在本發(fā)明一較佳實施例所制備的三萜類化合物作用下大腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。

圖5a為對照組在不同作用時間下使大腸癌細(xì)胞株變化的細(xì)胞數(shù)量-直徑分析的細(xì)胞周期產(chǎn)生變化圖。

圖5b為乙醇萃取組在不同作用時間下使大腸癌細(xì)胞株變化的細(xì)胞數(shù)量-直徑分析的細(xì)胞周期產(chǎn)生變化圖。

圖5c為本發(fā)明一較佳實施例所制備的三萜類化合物在不同作用時間下使大腸癌細(xì)胞株變化的細(xì)胞數(shù)量-直徑分析的細(xì)胞周期產(chǎn)生變化圖。

圖6a為對照組在24小時內(nèi)大腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞爬行能力顯微圖。

圖6b為乙醇萃取組在24小時內(nèi)大腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞爬行能力顯微圖。

圖6c為本發(fā)明一較佳實施例所制備的三萜類化合物在24小時內(nèi)大腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞爬行能力顯微圖。

具體實施方式

首先，如圖1所示，本發(fā)明一較佳實施例的制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法100，為可制備具抗癌功效的抗癌成分三萜類化合物，其第一步驟為備取牛樟芝110：為將1-2kg的皿培式牛樟芝放置于一萃取槽內(nèi)，該萃取槽為已知半徑0.036m-0.125m，高度0.5m的不銹鋼管柱。

本發(fā)明的第二步驟為萃取與分離120：為在操作壓力2000-4000psi、溫度40-60℃的操作條件下，將超臨界狀態(tài)溶劑以3-9l/hr流速通入該萃取槽進(jìn)行萃取，超臨界狀態(tài)溶劑為超臨界co2流體與乙醇以1：0.1-0.2(v/v)的體積比例混合至飽和狀態(tài)，萃取30-60分鐘后，將牛樟芝萃取物通入一層析管柱，利用該層析管柱將牛樟芝萃取物分離出雜質(zhì)與三萜類化合物，雜質(zhì)可自該層析管柱的底部去除，另自該層析管柱的頂部取出高濃度三萜類化合物。

該層析管柱內(nèi)為半徑0.036m-0.125m，高度1.0m的不銹鋼槽體，其內(nèi)充填有如pro-pakprotrudedmetal、saddles、rings、structuredpacking或knittedpacking等不銹鋼單體片。

本發(fā)明的第三步驟為檢測130：為通過細(xì)胞毒性試驗、細(xì)胞形態(tài)變化分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測及細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析，檢測三萜類化合物的抗癌效果。

其中，細(xì)胞毒性試驗的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一96孔培養(yǎng)盤(10,000cells/well)內(nèi)200μl的完全培養(yǎng)基中，1天后，再將培養(yǎng)基置換成含三萜類 化合物0.25-1.0mg/ml的完全培養(yǎng)基，并加入到96孔培養(yǎng)盤的不同孔中。另外，對照組則只加入200μl的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天之后，以四甲基偶氮唑比色法分析測定每孔中的活細(xì)胞數(shù)量比值，并以免疫酵素分析儀在570nm下測定吸光值(opticaldensity)。

其次，細(xì)胞形態(tài)變化分析的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一培養(yǎng)盤(皮氏培養(yǎng)皿(petridish))，1天后待細(xì)胞貼底，給予適量含有三萜類化合物(1.0mg/ml)的藥物濃度，置于培養(yǎng)盤中預(yù)定時間(2、7、14、21或28天)后，以倒立顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測的方式，為將大腸癌細(xì)胞株經(jīng)三萜類化合物(1.0mg/ml)處理后，以胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-edta)處理細(xì)胞，與培養(yǎng)液一起收集，離心后去掉上清液，并以磷酸鹽緩沖溶液清洗后，加入1ml冰冷的70％酒精，放入4℃冰箱過夜，以固定細(xì)胞。離心后，續(xù)以1ml磷酸鹽緩沖溶液懸浮，加入50mg/ml的碘化丙錠(propidiumiodide)避光作用10分鐘，以532nm波長激發(fā)后，在590±40nm波長偵測細(xì)胞熒光含量，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

而細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一6孔培養(yǎng)盤(cultureplate)(800,000cells/well)內(nèi)，培養(yǎng)于2ml的完全培養(yǎng)基，隔夜，先用200μl滴管尖頭(pippetttip)畫出一條直線，再將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物(0.25-1.0mg/ml)的完全培養(yǎng)基加到培養(yǎng)盤的不同孔中，并在100倍顯微鏡下拍照記錄day0的直線寬度。另外，對照組則只置換成2ml的完全培養(yǎng)基、無其他添加物，將該培養(yǎng)盤靜置24小時，并拍照記錄day1直線寬度密合的程度，最后以一量測軟件(imagej軟件)測量每張圖上任意5點的寬度變化，每個條件可得至少25個測量數(shù)據(jù)，相比day0與day1的平均數(shù)據(jù)，即可計算出細(xì)胞爬行比率。

以下，茲詳細(xì)說明本發(fā)明方法所制備的三萜類化合物的相關(guān)分析，以及將所制備的三萜類化合物進(jìn)行抗癌細(xì)胞試驗的分析，可得知本發(fā)明方法所制備的三萜類化合物確實具有抗癌功效：

首先，將已知利用乙醇萃取與本發(fā)明制備的三萜類化合物含量進(jìn)行測量，以熊果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長548nm測吸光度，換算標(biāo)準(zhǔn)品含量，定量單位以mg/ml表示。三萜類化合物的個別成分與含量的測量，以hplc搭配c18管柱進(jìn)行定量分析，單位為mg/ml。

如圖2所示，利用hplc比較牛樟芝中三萜類化合物的含量，已知利用乙醇萃取(ethanolextract)的萃取物(三萜類化合物)波峰高度較低，而利用超臨 界流體萃取分餾(sfefractionation)的萃取物(三萜類化合物)波峰高度高出許多，顯示運用超臨界流體萃取分餾技術(shù)的本發(fā)明方法可獲得含量較高的三萜類化合物。

其次，三萜類化合物的抗癌細(xì)胞試驗分析詳述如下：

如圖3a和圖3b所示，圖3a為大腸癌細(xì)胞株在乙醇萃取物不同稀釋濃度下的存活率，圖3b為大腸癌細(xì)胞株在本發(fā)明所制備三萜類化合物不同稀釋濃度下的存活率，比較相同稀釋濃度下大腸癌細(xì)胞株的存活率，本發(fā)明比已知乙醇萃取更低，顯示本發(fā)明所制備的三萜類化合物更有殺死癌細(xì)胞的能力。又，比較不同稀釋濃度，隨著濃度的增加，大腸癌細(xì)胞株的死亡率隨的增加，表示三萜類化合物濃度愈高，愈有抑制癌細(xì)胞增生能力。

其次，如圖4a、圖4b和圖4c所示，比較本發(fā)明、對照組與乙醇萃取組的細(xì)胞形態(tài)變化與存活率，結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的三萜類化合物對大腸癌細(xì)胞株有明顯抑制作用，可使大腸癌細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞外觀基本全部變圓，且細(xì)胞數(shù)量明顯減少，因此本發(fā)明制備的三萜類化合物明顯有抑制癌細(xì)胞生長的效果。

如圖5a、圖5b和圖5c所示，細(xì)胞周期反映了細(xì)胞的狀態(tài)，癌變的細(xì)胞往往有異常的分裂周期，導(dǎo)致細(xì)胞生長較正常細(xì)胞快速，而增加了腫瘤惡化的情形，因此抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期也為一種抗腫瘤的方法。三萜類化合物使大腸癌細(xì)胞株細(xì)胞周期產(chǎn)生變化，檢測結(jié)果顯示，大腸癌細(xì)胞株細(xì)胞的s期細(xì)胞比例減少，g0/g1期細(xì)胞比例也減少，但g2/m期細(xì)胞比例增加，與對照組和乙醇萃取組比較差異，有統(tǒng)計學(xué)上的意義(p＜0.05)。由此得知，本發(fā)明制備的三萜類化合物有抑制癌細(xì)胞的作用，使癌細(xì)胞的生長變慢或停滯。

其次，傷口愈合試驗是一種簡單又快速的方法，大腸癌細(xì)胞株在有加三萜類化合物的情況下，爬行能力會受到多少影響，以此結(jié)果可以推測出癌癥惡化性(tumorigenicity)的改變程度，甚至癌癥轉(zhuǎn)移侵襲的基本能力。如圖6a、圖6b和圖6c所示，觀察24小時之后的大腸癌細(xì)胞株細(xì)胞爬行能力，顯示對照組和乙醇萃取組無法抑制癌細(xì)胞增生，使癌細(xì)胞有回復(fù)爬行的能力，而本發(fā)明制備的三萜類化合物會抑制癌細(xì)胞生長，其爬行程度明顯小于對照組和乙醇萃取組，因此，可證明本發(fā)明制備的三萜類化合物具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

由上可知，本發(fā)明所提供制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其利用飽和狀態(tài)的超臨界狀態(tài)溶劑將皿培式牛樟芝充分萃取后，再利用具有分離效果的層析管柱進(jìn)行分離，在超臨界狀態(tài)下，以最少量的乙醇溶劑與超 臨界二氧化碳流體即可達(dá)到平衡，并有最大的分離效果，可達(dá)到萃取與分離出三萜類化合物的功效，且通過細(xì)胞毒性試驗(cytotoxicity)、細(xì)胞形態(tài)變化分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測及細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析的檢測技術(shù)，證實本發(fā)明所制備的三萜類化合物確實具有抗癌效果，實為安全、環(huán)保與節(jié)能的有效方式。