本發(fā)明涉及植物培育領域，具體而言，涉及一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法。
背景技術：
：栝樓，葫蘆科栝樓屬多年生草本植物，別名瓜蔞、吊瓜、野葫蘆等?！吨腥A醫(yī)藥》記載，其果實、根是常用的名貴中藥，栝樓有解熱止渴、利尿、鎮(zhèn)咳祛痰等作用。種子含脂花肪油；果實含三萜皂苷、有機酸、樹脂、糖類、色素；根含蛋白質、皂苷、酸類。栝樓是治療肺熱、腫痛的特效藥，近些年發(fā)現(xiàn)其還有調節(jié)免疫、抗心肌缺血、抗癌抗衰老等醫(yī)療和保健作用。目前，栝樓的繁殖主要為無性繁殖方式，即采用塊根小段無性繁殖；但栝樓在無性繁殖過程中，容易感染病毒，使優(yōu)良品種退化。因此，為培育無病毒的栝樓優(yōu)良種系，特提出本專利技術。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法易于控制實施，可在較短的時間內繁殖得到大量的無病毒的優(yōu)良種系，提高栝樓種苗的品質。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，其包括：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個葉原基的莖尖接種到第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出含20～30個小芽的芽叢；將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1～2cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到組培苗。一種栝樓的脫毒培養(yǎng)方法，其包括：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個葉原基的莖尖接種到第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出含20～30個小芽的芽叢；其中，第一培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.45～0.55mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本公開內容提供的這種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，采用帶有1～2個葉原基的莖尖進行愈傷組織培養(yǎng)，使其生長、分化形成無病毒的栝樓苗。該方法是基于病毒在植物體內分布不均勻的理論，即植物的莖尖分生組織一般不帶病毒的，所以通常采用0.1毫米左右的莖尖分生組織，帶1-2個葉原基，進行培養(yǎng)，即可得到無病毒種苗，故而無需進行病毒鑒定工作即可進行擴大繁殖。該培養(yǎng)方法易于控制實施，操作相對較簡單，成苗時間短，可在較短的時間內繁殖得到大量的無病毒的優(yōu)良種系，提高栝樓種苗的品質。通過這種培養(yǎng)方法培育的無病毒栝樓，具有生長健壯、不帶病毒、品質優(yōu)良的特性，從而大幅提高栝樓藥材的質量和藥效。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。本實施方式提供一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，其包括下述步驟：步驟s1初代培養(yǎng)：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個葉原基的莖尖接種到第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出含20～30個小芽的芽叢。在本實施方式中，栝樓苗既可以為無菌苗，也可以為大田兩年生的正常苗，都可以滿足初代培養(yǎng)的植株取材需求。較為具體的，將栝樓苗在無菌條件和解剖顯微鏡下剝取莖尖分生組織，以帶有1～2個葉原基的莖尖為度，莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中。值得強調的是，由于本實施方式提供的培養(yǎng)方法，選用的植物組織為莖尖分生組織，該分生組織一般不帶病毒，所以采用0.1毫米左右的帶1～2個葉原基的莖尖分生組織，進行培養(yǎng)，即可得到無病毒苗，故而無需進行病毒鑒定工作即可進行擴大繁殖?？蛇x擇的，培養(yǎng)莖尖的條件為：環(huán)境溫度23～28℃、日照時間13～14h、光照強度1200～1300lx、相對濕度75～85％。進一步優(yōu)選的，培養(yǎng)莖尖的條件為：環(huán)境溫度24～27℃、日照時間13.4～13.7h、光照強度1230～1280lx、相對濕度78～82％；更為具體的培養(yǎng)條件為：環(huán)境溫度25℃、日照時間13.5h、光照強度1250lx、相對濕度80％。在這些條件下，進行莖尖分生組織的培養(yǎng)，莖尖所處的環(huán)境適宜，生長和分化速度快，能夠在相對較短的時間內長出小芽，形成芽叢，發(fā)芽率高、培養(yǎng)周期短。進一步的，第一培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.45～0.55mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的；或者第一培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.5mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。第一培養(yǎng)基采用ms培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，其中，ms培養(yǎng)基具有無機鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基。ms培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術中的配方進行配置。當然，也可以用其他配比的ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明較佳的實施例中，發(fā)明人經過多次實踐探索之后，優(yōu)選得到的ms培養(yǎng)基的重量百分比組分為：30-35％的硝酸銨、40-42％的硝酸鉀、7-8％的硫酸鎂、8-10％的二水氯化鈣、3.5-4％的磷酸二氫鉀、1.2-1.5％的鐵鹽、0.05-0.1％的微量元素，余量為有機物。其中，鐵鹽為乙二胺四乙酸二鈉與硫酸亞鐵的混合物，二者的質量比為10～11：9。微量元素由碘化鉀、硼酸、一水硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷的一種或多種組成，有機物由肌醇、煙酸、vb6、vb1、甘氨酸的一種或多種組成。采用這種ms培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，其所含的離子濃度更加適合瓜蔞子莖尖的生長、分化。6-芐氨基嘌呤，是一種人工合成的細胞分裂素，能夠誘導芽的分化。萘乙酸，是一種光譜型的植物生長調節(jié)劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根。發(fā)明人通過調節(jié)這兩種激素的含量，得到一種能夠促進莖尖誘導和分化的培養(yǎng)基，無需分步培養(yǎng)，且生長快，分化率高。步驟s2繼代培養(yǎng)：將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1～2cm的叢生苗?？蛇x擇的，第二培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.09～0.11mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。較為優(yōu)選的，第二培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.10mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。該培養(yǎng)基適合芽叢的誘導分化，發(fā)育成叢生苗?？蛇x擇的，該培養(yǎng)方法還包括：將叢生苗分成單株后再轉入另一個第二培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗。此為擴大繁殖步驟，由于一個芽尖分化得到的芽叢數(shù)量有限，為了避免反復取材進行初代培養(yǎng)，在本發(fā)明較佳的實施例中，將繼代培養(yǎng)后得到的1～2cm的叢生苗分成單株，再重新接種至新的第二培養(yǎng)基中，進行分化培養(yǎng)，由此可得到大量的叢生苗，大幅提高培養(yǎng)效率，縮短培養(yǎng)時間以及降低培養(yǎng)成本。步驟s3生根培養(yǎng)：將叢生苗分成單株并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到組培苗。可選擇的，第三培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.18～0.22mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。較為優(yōu)選的，第三培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.20mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。吲哚丁酸，使一種植物生長激素，能夠促進植物生長，尤其是促進植物根系的生長發(fā)育。該培養(yǎng)基適合叢生苗的誘導分化，能夠促進叢生苗根系的生長。進一步的，在本發(fā)明較佳的實施例中，還包括將組培苗進行馴化培養(yǎng)。通過馴化培養(yǎng)，篩選得到長勢健壯、不帶病毒、品系優(yōu)良的栝樓植株。可選擇的，馴化培養(yǎng)包括：將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后晾置0.5～1.5h，再將組培苗插入基質中進行培養(yǎng)；其中基質為經消毒處理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。進一步的，為了提高根系的成活率，將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后，于溫度為18～22℃、濕度為78～82％的環(huán)境下晾置0.5～1.5h，優(yōu)選的，將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后，于溫度為20℃、濕度為80％的環(huán)境下晾置1h，進行移栽。更為具體的，將組培苗插入基質中，壓實組培苗基本周圍的基質，澆透水，以利幼苗基部和基質緊密接合，直至根系生出，逐漸降低濕度和土壤含水量。通過上述培養(yǎng)方法培育得到的栝樓，具有生長健壯、不帶病毒、品質優(yōu)良的特性，從而能夠大幅提高栝樓藥材的質量和藥效。以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述：實施例1本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出30個小芽的芽叢。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.45mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.09mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.22mg/l)。實施例2本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出25個小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃、日照時間14h、光照強度1200lx、相對濕度85％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。實施例3本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有2個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出20個小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為26℃，夜間溫度為23℃、日照時間13h、光照強度1300lx、相對濕度75％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.55mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出2cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.11mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.18mg/l)。實施例4本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出25個小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為27℃，夜間溫度為24℃、日照時間13.5h、光照強度1250lx、相對濕度80％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，再轉入另一個所述第二培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.將叢生苗分成單株，并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。實施例5本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出25個小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為27℃，夜間溫度為24℃、日照時間13.5h、光照強度1250lx、相對濕度80％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，再轉入另一個所述第二培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.將叢生苗分成單株，并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。e.將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后晾置1h，再將組培苗插入基質中進行培養(yǎng)；其中基質為經消毒處理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。對比例1本對比例提供一種栝樓種苗，其培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出20個小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為30℃，夜間溫度為25℃、日照時間12h、光照強度1500lx、相對濕度75％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.1mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出1cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.12mg/l)+萘乙酸(0.07mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.27mg/l)。觀察實施例1～5以及對比例1在在培養(yǎng)過程中的分化情況，并記算出芽數(shù)、分化率、出苗總數(shù)和出苗率，結果如表1所示：表1.實施例1～5以及對比例1的培養(yǎng)結果分化出芽的芽尖數(shù)(個)分化率(％)出苗總數(shù)(株)出苗率(％)實施例11470％1890％實施例21575％20100％實施例31680％24120％實施例41680％67335％實施例51785％70350％對比例1735％1575％由表1可知，本發(fā)明實施例1～5所提供的培養(yǎng)方法，用20個植物分生組織進行培養(yǎng)，分化出芽的芽尖數(shù)在14個以上，分化率(分化出芽的芽尖數(shù)/接入的芽尖數(shù)×100％)在70％以上，遠大于對比例1提供的培養(yǎng)方法(分化出芽的芽尖數(shù)為7個，分化率為35％)，由此可見，本發(fā)明實施例1～5所提供的培養(yǎng)方法，在芽尖分化培養(yǎng)階段，分化率高、且分化出芽生長快；進一步培養(yǎng)后的，實施例1～5中，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)好，培養(yǎng)條件適宜，芽生長快，植物健壯，因此出苗率(出苗數(shù)/接入的芽尖數(shù)×100％)高達90％以上。值得注意的是，實施例4～5的出苗率高達330％以上，這主要是因為在培養(yǎng)得到叢生苗之后，還將其分成單株后，進行擴大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗，從而大幅提高叢生苗的數(shù)量。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁12