翻白草三萜化合物的制備方法
【專利摘要】翻白草三萜化合物的制備方法，本發(fā)明提出(20S)?3α?羥基?29?二甲氧基?27?白樺酸的提取方法，包括：(i)粗提工序：干燥翻白草(Potentilla discolor Bunge)全草，用70體積％以上的乙醇水溶液加熱提取，減壓蒸去乙醇，得到粗提物；(ii)萃取工序：用水混懸上述粗提物，依次經(jīng)石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取部分；(iii)柱層析工序：先將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿?甲醇梯度洗脫，收集30?50體積％氯仿?甲醇的洗脫流分；接著進(jìn)行小孔樹脂柱層析，甲醇?水梯度洗脫，收集70?90體積％甲醇水洗脫的流分；然后進(jìn)行反相C18柱層析，丙酮?水梯度洗脫，收集50?70體積％丙酮?水洗脫的流分；(iii)純化工序：用葡聚糖凝膠柱純化，得到(20S)?3α?羥基?29?二甲氧基?27?白樺酸。
【專利說明】
翻白草三萜化合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種翻白草三萜化合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥翻白草是薔薇科委陵菜屬植物翻白草(Potentilla discolor Bunge)的干燥 全草，始載于《救荒本草》。翻白草廣泛分布于北半球的溫帶和寒帶，我國以山東、遼寧、安徽 三省該藥材產(chǎn)量最大，此外，河北、河南、內(nèi)蒙古、湖南、江蘇和廣西等省份也有分布。其性 甘、苦、平，具有清熱解毒、止血消腫之功效，可用于治療痢疾、瘧疾、肺癰等癥。
[0003] 目前國內(nèi)外對翻白草的研究集中于單一環(huán)節(jié)的療效評價方面，針對翻白草的化學(xué) 成分、提取工藝、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、物質(zhì)代謝的系統(tǒng)性研究開展較少，有待進(jìn)一步深入。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人對翻白草(Potentilla discolor Bunge)的化學(xué)成分、提取方法、藥理活性 進(jìn)行了系統(tǒng)研究。從翻白草提取分離出10個三萜類化合物(化合物1~10)。其中，化合物5為 新化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，命名為(20S )-3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸，其結(jié)構(gòu)如式（I)所 示：
[0005]
[0006]本發(fā)明還研究了翻白草總?cè)频奶崛》椒ㄒ约笆剑↖)所示三萜化合物的提取方 法。
[0007]即，本發(fā)明提供一種式（I)所示的三萜化合物的提取方法，包括：
[0008] (i)粗提工序：干燥翻白草(Potentilla discolor Bunge)全草，用70體積％以上 的乙醇水溶液加熱提取，減壓蒸去乙醇，得到粗提物；
[0009] (ii)萃取工序：用水混懸上述粗提物，依次經(jīng)石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，得到乙 酸乙酯萃取部分；
[0010] (iii)柱層析工序:先將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度 洗脫，收集30-50體積％氯仿-甲醇的洗脫流分；
[0011]接著進(jìn)行小孔樹脂柱層析，甲醇-水梯度洗脫，收集70-90體積％甲醇水洗脫的流 分；
[0012]然后進(jìn)行反相C18柱層析，丙酮-水梯度洗脫，收集50-70體積％丙酮-水洗脫的流 分；
[0013] (iii)純化工序:用葡聚糖凝膠柱純化，得到式(I)的化合物。
[0014] 本發(fā)明還提供一種翻白草總?cè)频奶崛》椒ǎ龇撞菘側(cè)剖前剑↖)所 示的三砲化合物的混合物，該提取方法包括：
[0015] 干燥翻白草(Potentilla discolor Bunge)全草，用90體積％乙醇水溶液加熱提 取，提取液蒸去乙醇，用水混懸，依次經(jīng)過石油醚萃取、乙酸乙酯萃?。?br>[0016] 將乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析，用體積比1:0-0:1的氯仿-甲醇梯度洗脫，收集 30-50體積％和50-70體積％的氯仿-甲醇的洗脫流分；
[0017] 進(jìn)行小孔樹脂柱層析，甲醇-水梯度洗脫，收集70-90體積％甲醇水洗脫的流分。
【附圖說明】
[0018] 圖1為翻白草提取分離過程示意圖；
[0019] 圖2-1、2-2為(20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸咕NMR譜圖；
[0020] 圖3-1、3-2、3-3為(20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸 13C NMR譜圖；
[0021] 圖 4-1、4-2 為（20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸 2D-NMR 譜圖；
[0022] 圖 5-1、5-2、5-3 為(20S) -3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸 R0ESY譜圖。
【具體實(shí)施方式】 [0023](一)化合物的提取 [0024] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0025] 1.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料
[0026]熔點(diǎn)用X-4型雙目鏡顯微熔點(diǎn)測定儀(溫度未校正，北京泰克儀器有限公司制造） 測定;UV用Shimadzu UV-2501PC型可見-紫外分光光度計(jì)測定;NMR:Bruker AV-500型核磁 共振儀，δ為ppm，J為Hz。
[0027] 薄層層析硅膠H、薄層色譜硅膠GF254、柱層析硅膠（100-200目，200-300目，青島海 洋化工廠）；反相C18柱，即0DS柱(40-60ym，F(xiàn)uji公司），Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(購自 Pharmacia公司）;MCI柱（日本三菱化工株式會社）。
[0028]所用試劑均為分析純級。
[0029] 如無特殊說明，本發(fā)明所指比例以及百分比均指體積。
[0030] 1.2植物來源
[0031] 翻白草(Potentilla discolor Bunge)藥材采自廣西，植物標(biāo)本經(jīng)鑒定為薔薇科 委陵菜屬植物翻白草，標(biāo)本存放于中國藥科大學(xué)中藥分析教研室。
[0032] 1.3提取分離
[0033]干燥翻白草全草14kg，用90 %乙醇水溶液加熱提取3次，每次3h合并提取液，減壓 蒸去大部分乙醇，用水混懸，然后用石油醚萃取三次，回收溶劑后得到石油醚部分160g，然 后用乙酸乙酯萃取三次，回收溶劑后，得乙酸乙酯部分300g。
[0034] 乙酸乙酯部分（300g)用400g硅膠（100-300目）拌樣，3.0kg(200-300目）進(jìn)行硅膠 柱層析，氯仿-甲醇（10:0-0:10， V:V)梯度洗脫，薄層色譜檢測合并相同流分。
[0035] 將30-50體積％和50-70體積％的流分合并后減壓干燥，進(jìn)行小孔(MCI)柱層析，用 水-甲醇（10:0-0:10，^^)梯度洗脫，收集70%-90%甲醇洗脫的成分。減壓回收溶劑至浸膏 狀，再用甲醇溶解，進(jìn)行反向C18柱層析，丙酮-水(0:10-10:0，v:v)梯度洗脫，葡聚糖凝膠柱 (Sephadex LH-20)反復(fù)純化，得化合物l(17mg)，2(25mg)，3(8mg)，4(20mg)，5(8mg)，6 (lOOmg)，7(5mg)，8(4mg)，9(5mg)，10(120mg)。
[0036]化合物5較多地來自于反相C18柱層析的50-70體積％丙酮-水洗脫的流分。
[0037]翻白草分離流程如圖1所示。
[0038] 依據(jù)與對照品TLC比對以及各種譜圖數(shù)據(jù)[n^MS、1!! NMR、13C NMR和2D NMR(HMQC、 HMBC、C0SY)]最終確證了所得到的化合物別為:薔薇酸(euscaphic acid, 1)、2α-羥基烏蘇 酸（corosolic acid, 2)、2α，3β, 19α-三羥基-熊果酸（tormentic acid，3)、3α，30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸（3〇,30-(1讓7扣(《71卯-20(29)-611-27-〇1。3(^(1，4)、（205)-3〇-羥 基-29-二甲氧基-27-白樺酸（（20S)-3a-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-〇ic acid，5)、 熊果酸（ursolic acid,6)、山植酸（maslinic acid,7)、19α-羥基熊果酸（pomolic acid, 8)、2α，3α-二羥基-12-稀-28-烏蘇酸（2α，3a-dihydroxyurs-12-en-28-〇ic acid,9)、齊墩 果酸（oleanolic acid，10)〇
[0039] 其中，化合物（20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸（（205)-3〇-1^乜(《7-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid，5)未見文獻(xiàn)報(bào)道，為新化合物。
[0040] 1.4翻白草總?cè)频奶崛?br>[0041] 干燥翻白草(Potentilla discolor Bunge)全草，用90體積％乙醇水溶液加熱提 取，減壓蒸去大部分乙醇，用水混懸，依次經(jīng)過石油醚萃取、乙酸乙酯萃取。
[0042]硅膠柱層析:填裝200-300目的硅膠柱，將乙酸乙酯萃取部分用硅膠（100-300目） 拌樣，上樣，用體積比1:0-0:1的氯仿-甲醇梯度洗脫，采用上述1.3中分離得到的三萜類化 合物1-10作為對照品，經(jīng)薄層色譜分析，顯示上述各三萜類化合物在30-50體積％、50-70體 積％的氯仿-甲醇的洗脫流分中比較集中，收集30-50體積％、50-70體積％的氯仿-甲醇的 洗脫流分，合并。進(jìn)行小孔樹脂柱層析，甲醇-水梯度洗脫，收集70-90體積％甲醇水洗脫的 流分。
[0043] 2、結(jié)構(gòu)鑒定
[0044] 化合物5:性狀：白色無定形粉末(MeOH)，易溶于甲醇；
[0045]
[0046] 顏色反應(yīng)：10%硫酸乙醇浴液反應(yīng)Μ紫紅色，Libermann-Burchard反應(yīng)呈陽性， Molish反應(yīng)陰性，以上信息提示為三萜類化合物。HR-T0F-MS給出分子量m/z[M-H] - 517.3900(calcd for C32H53〇5,517.3898)，結(jié)合 13C-NMR和1H-NMR譜推測其分子式為 C32H54〇5 〇
[0047] IR(KBr)vmax cm-1 3447,1685；
[0048] 1H-NMR(C5D5N)，S(ppm):1.79-1.56(m，2H，H-l)，2.00-1.72(m，2H，H-2)，3.54(s，H-3)，1.73(m，lH，H-5)，1.49-1.20(m，2H，H-6)，1.99-1.96(m，2H，H-7)，2.21(m，lH，H-9)， 1.71- 1.36(m，2H，H-ll)，2.71-1.82(m，2H，H-12)，1.89(m，lH，H-13)，2.29-1.68(m，2H，H-15),1.76-1.72(m，2H，H-16)，1.61(m，lH，H-18)，1.93(m，lH，H-19)，2.50(m，lH，H-20)， 1.72- 1.50(m,2H,H-21),1.41-1.05(m,2H,H-22),1.04(s,3H,CH3-23),0.87(s,3H,CH3-24), 0.97(s,3H,CH 3-25) ,1.21(s,3H,CH3-26) ,0.88(s , 3H, CH3-28) ,4.18(d ,J = 8.15Hz , 1H,H- 29) ,1.05(d J = 5.6Hz,3H,CH3-30),3.30(s,3H,CH3-31),3.38(s,3H,CH3-32)；
[0049] 13C-匪R(C5D5N) ,δ(ρρπι) :34.23(C-1) ,26.63(02) ,75.06(03) ,38.91(04)， 49.57(C-5)，18.75(C-6)，38.21(C-7)，40.92(C-8)，51.23(C-9)，37.41(C-10)，21.20(C-11)，28.22(C-12)，38.38(C-13)，60.79(014)，25.73(C-15)，38.04(016)，42.60(017)， 50·57(C-18)，39·38(C-19)，38·07(C-20)，22.66(C-21)，40.98(C-22)，29.10(023),22.78 (C-24),16.96(C-25),17.59(C-26),178.31(C-27),18.96(C-28),108.75(C-29),9.31(C- 30) ,53.01(C-31),53.58(C-32).
[0050] 咕 MIR譜上有六個角甲基信號（如圖2-1)J0.87、0.88、0.97、1.04、1.21(s，3H, each)及1.05((1，1 = 5.60抱），另外在63.30附近還有兩個明顯的甲基單峰信號3.30(3!1，8)、 3.38(3!1，8)，提示含有兩個甲氧基。質(zhì)子信號55.30(!1，8)、4.18(!1，(1，1 = 8.15抱）、3.54(!1， s)暗示與羥基等含氧基團(tuán)相連(如圖2-2)。
[0051] 13C NMR譜中有32個碳信號，包括六個角甲基碳信號δ〇9.31、16.61、17.59、18.75、 18.96和21.20(如圖3-1)，兩個甲氧基碳信號6巧3.01、53.58(如圖3-2)，兩個連氧碳信號6〇 75.06和60.79以及一個羧基碳信號S C178.31 (如圖3-2和3-3)。
[0052] 綜合以上信息，推定該化合物為3α-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸（3a-hydroxy-29-dimethoxy-lupan_27-〇ic acid)，結(jié)構(gòu)如式（I)所不。
[0053]
[0054] 根據(jù)2D-NMR可以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證和全歸屬，如下：
[0055] 在1H-4 COSY譜中2H-1 (δ 1 · 56/1 · 79)與2H-2(δ 1 · 72/2 · 00)相關(guān)，而后者同時與H-3 (δ3·54)相關(guān);Η_5(δ1·73)與2Η-6(δ1·49/1·40)相關(guān)，同時后者也與2Η_7(δ1·96/1·99)信號 發(fā)生耦合;Η-9(δ2·21)與 2!1-1101.71/1.36)相關(guān)，2!1-1202.71/1.82)與!1-1301.89)相 關(guān)，而2!1-11(51.71/1.36)與2!1-12(52.71/1.82)也同時相關(guān)。!1-13(51.89)與!1-1901.93) 相關(guān)，后者同時與2Η-21(δ1.50/1.72)相關(guān)，同時2Η-21也與2Η-22(δ1.〇5/1.41)相關(guān)。
[0056] 在1HMBC 譜中（圖 4-l、4-2)，羧基碳信號δc178·31與H-13(δl·89)相關(guān)；δl·21(3H-26)、δl·89(H-13)及δl·61(H-18)與C-14(δ60·78)相關(guān) ；C-28(δl8·96)與H-18(δl·61)、H-22 (δ1·41)相關(guān)。
[0057] 在R0ESY譜中（圖5-1、5-2、5-3)、3〇.88(3!1-28)與130、150、160、1卵、210和22冊相 關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)，以上信息確證了該化合物為C-27羧基。
[0058] 在1Η-匪R中，Η-3(δ3 · 54，s)表明Η-3處于e鍵上。R0ESY中（圖5-1、5-2、5-3)Η_3(δ 3.54)與!1-比01.79)、!1-2002.〇)、3!1-2你0〇.87)相關(guān)，可歸屬4環(huán)上的!1，同時也確證了該 構(gòu)型。
[0059] 此外，HMBC 譜中（圖 4-l、4-2)、3H-31(S3.30，s)、3H-32(S3.38，s)與 108.7(029)相 關(guān)，表明C-29上連有兩個甲氧基。
[0060]另外，通過C-30的化學(xué)位移大小來確定C-20的絕對構(gòu)型，因?yàn)槿绻鸆-20為S構(gòu)型， 則C-30的化學(xué)位移為δ^1〇. 3;如果C-20為R構(gòu)型，則C-30的化學(xué)位移處于較低場，為δ^17.7。 因此，化合物5中C-20為S構(gòu)型。
[0061 ]綜所上述，化合物 5 的結(jié)構(gòu)確定為（SOSpSa-hydroxy-Sg-dimethoxy-lupan-ST-oic acid。 經(jīng)文獻(xiàn)檢索， 化合物 5 為一新化合物 ，波譜數(shù)據(jù)如下 (表1) 。
[0062]表 1 化合物5的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)（in CsDsNjin ppm，J in Hz).
[0063]
[0064]
[0065] 根據(jù)文獻(xiàn)查閱，從委陵菜屬中分離得到的三萜類化合物幾乎都是游離苷元，主要 是五環(huán)三萜，按其分類，主要有烏蘇烷型、齊墩果烷型和羽扇豆烷型;其結(jié)構(gòu)中大多有雙鍵、 羥基和羧基，且雙鍵的位置幾乎都是12(13)位，羧基的位置大多都是28位;其結(jié)構(gòu)的變化就 主要體現(xiàn)在羥基數(shù)量、取代位置和立體化學(xué)的變化上，最常見的羥基取代模式為2α，2β，3α， 3β，19α，23，24位，其它位置則少見。
[0066] 值得一提的是，在發(fā)明人得到的10個三萜類化合物中有兩個為羽扇豆烷型三萜 (其中一個為新化合物），且羧基都存在于C-27位。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，大多數(shù)天然存在的羽扇豆 烷型三萜多為C-28位羧基，C-27位羧基的天然化合物僅有七個，分別是從唇形科植物 Hyptis suaveolens，鼠李科植物Gouania microcarpa以及本植物翻白草中分離得到?，F(xiàn)在 發(fā)明人又從翻白草中也分離得到一個新的C-27羧基的羽扇豆烷型三萜，極大地豐富了這一 類型的化合物。
[0067](二)化合物活性研究 [0068]二、化合物活性研究
[0069] ( - )糖消耗
[0070] AMP蛋白激酶(AMPK，AMP即腺苷一磷酸）主要控制細(xì)胞新陳代謝:它會決定身體中 的脂肪是儲存還是燃燒，這主要取決于細(xì)胞中總能量。當(dāng)細(xì)胞能量水平較高時，細(xì)胞中存在 高濃度的能量分子ATP (三磷酸腺苷），因此AMPK會促使細(xì)胞進(jìn)行"合成代謝"，將多余能量作 為脂肪儲存下來；當(dāng)ATP水平較低時，AMPK將關(guān)閉合成代謝，反而激發(fā)分解代謝，讓脂肪燃燒 為能量。已有研究表明，AMPK能作為治療2型糖尿病的一種有效手段。當(dāng)AMPK探測到細(xì)胞中 ATP濃度較低時，它們會利用各種機(jī)制使細(xì)胞中的葡萄糖變?yōu)锳TP。對于嚙齒類動物的實(shí)驗(yàn) 已經(jīng)表明，AMPK對于降低血糖是有效的。
[0071]本實(shí)驗(yàn)就是利用糖消耗實(shí)驗(yàn)來探索翻白草總?cè)撇课缓推渲械娜茊误w能否通 過AMPK途徑對2型糖尿病實(shí)現(xiàn)治療作用。
[0072] 1、實(shí)驗(yàn)材料 [0073] 1.1樣品
[0074]①3α，30-二羥基-20 (29)_烯-27-白樺酸，②本發(fā)明的新化合物（即（20S)-3α-羥 基-29-二甲氧基-27-白樺酸），③科羅索酸，④翻白草總?cè)疲渲袠悠发苡蒙倭緿MS0(二甲 亞砜)溶解(確保DMS0在培養(yǎng)體系中的終濃度不大于0.1%)，再用PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋， 使細(xì)胞上清液中樣品最終濃度依次為l〇ymol/L，lOymol/L，lOymol/L和100μg/ml，二甲雙胍 用PBS溶解，使細(xì)胞上清液中樣品終濃度為lmmo 1 /L。
[0075] 1.2試劑
[0076] DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：1115806);
[0077] 應(yīng)用液另加0.06g/L青霉素(80萬單位)和0. lg/Ι硫酸鏈霉素（1〇〇萬單位)及3.7g/ L碳酸氫鈉，pH調(diào)至7.2;
[0078]注射用青霉素鈉(蘇州二葉制藥有限公司，批號100501);
[0079] 硫酸鏈霉素(南京生興生物技術(shù)有限公司，批號:0E100E10);
[0080] 碳酸氫鈉(南京化學(xué)試劑有限公司，批號：11022610211);
[0081 ] 新生小牛血清（Newborn calfserum，NCS)(上海微科生化試劑有限公司，批號： A10110-0904)；
[0082] 胰蛋白酶（Sunshine公司，批號：1C221H04);
[0083] DMS0(Snshine公司，批號：2A022A02);
[0084] 二甲雙胍(ALEXIS BI0CHEMICALS，批號：L20508/a)
[0085] 葡萄糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:F20101115);
[0086] 葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號:20120701);
[0087] 1.3細(xì)胞株
[0088]前脂肪細(xì)胞3T3-L1，小鼠源。
[0089] 1.4動物
[0090] ICR小鼠，雄性，18-22g，由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供。
[0091] 2、實(shí)驗(yàn)過程
[0092] 2.1條件培養(yǎng)液 CM( conditioned-medium)的制備
[0093] 取小鼠脫頸椎處死，75%的酒精中浸泡3-5min，移至超凈臺中，腹腔注射PBS 5ml/ 只，輕揉小鼠的腹部2min，用移液槍吸出以6 X 105接種于6孔板內(nèi)，于5 %C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng) 箱內(nèi)孵育，4h后吸棄未貼壁細(xì)胞，以PBS洗2次，貼壁細(xì)胞換以1(冊(1^ 61^'-1^叫打'8-Hense 1 ei t)液培養(yǎng)，每孔加 KRH液2ml，并在每孔加入10μ1的LPS (終溶度為5μg/ml)，48h后收 集上清液作為巨卩策細(xì)胞條件培養(yǎng)液(〇〇11(1;[1:;[0116(1-1116(1;[11111，01)，濾菌，分裝，|￡于-70 <€超低 溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0094] 2.2細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
[0095]取出凍存的3T3-L1細(xì)胞置37°C水浴中，使其快速融化，轉(zhuǎn)入5ml含10%新生小牛血 清的DMEM培養(yǎng)基中，重懸細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入75ml培養(yǎng)瓶中于5 %⑶2，37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每天換液。前脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，接種后1-2天，表現(xiàn)為單層密集生長，細(xì)胞呈 梭形，有分支。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，用PBS清洗兩遍，0.25%胰蛋白酶消化30s，按1:6傳 代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，臺盼藍(lán)排斥法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為l〇6/ml接種于48 孔培養(yǎng)板，5 % C02，37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，當(dāng)細(xì)胞基本融合時，用KRH清洗兩遍換用KRH 液饑餓，每孔200yL饑餓4h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0096] 2.3藥物處理與測定 [0097] 2.3.1生理?xiàng)l件下篩選
[0098] 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、樣品組及陽性對照(二甲雙胍)組。先將饑餓好的細(xì)胞用KRH液清洗 兩遍，然后用KRH體系加樣品，培養(yǎng)板孔內(nèi)分別加入預(yù)定濃度的樣品①②③④(①②③終濃 度lOymol/L，④終濃度100μg/ml)和二甲雙胍(終濃度25ymol/L)，空白組加入同體積的KRH 液;各組均加入葡萄糖溶液，使其終濃度為1 lmmo 1/L，5 %⑶2，37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用 葡萄糖試劑盒測定。
[0099] 2.3.2炎性條件下篩選
[0100] 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、模型組、樣品組及陽性對照(二甲雙胍)組。培養(yǎng)板孔內(nèi)分別加入預(yù) 定濃度的樣品①②③④(①②③終濃度lOymol/L，④終濃度100μg/ml)和二甲雙胍(終濃度 lmmo 1 /L)，5 %⑶2，37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5h，培養(yǎng)板孔內(nèi)模型組、樣品組及陽性對照加 入相同體積的C Μ，空白組加入同體積的K R Η液，各組均加入葡萄糖溶液，使其終濃度為 1 lmmol/L，5 % C02，37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，用葡萄糖試劑盒測定。
[0101] 2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0102] 2.4.1生理?xiàng)l件下篩選結(jié)果
[0103]細(xì)胞孵育4h后，用葡萄糖測定試劑盒于492nm波長下測0D值，由此，計(jì)算出細(xì)胞上 清中的糖含量，進(jìn)而得出糖消耗量。結(jié)果見表2-1。
[0104] 表2-1生理?xiàng)l件下糖消耗量(n = 6)
[0105]
[0106] *與空白組相比P〈0.05
[0107] 2.4.2炎性條件下篩選結(jié)果
[0108]細(xì)胞孵育4h后，用葡萄糖測定試劑盒于492nm波長下測0D值，由此，計(jì)算出細(xì)胞上 清中的糖含量，進(jìn)而得出糖消耗量。結(jié)果見表2-2。
[0109]表2-2炎性條件下糖消耗量(n = 8)
[0110]
[0111]
[0112] *與模型組相比P〈0.05
[0113] 3、結(jié)論
[0114] 由表2-1可看出，陽性對照組與空白組有顯著差異，提示了實(shí)驗(yàn)的可靠性。四種樣 品與空白組相比，糖消耗均有升高。二甲雙胍為AMPK特異性抑制劑，抑制生理?xiàng)l件下糖的消 耗，提示這一途徑與AMPK活化有關(guān)系。
[0115] 由表2-2可看出，模型組與空白組有顯著差異，顯示造模成功，提示實(shí)驗(yàn)的可靠性。 四種樣品中，①、②號樣品的糖消耗量升高，且與模型組相比有顯著差異，說明它們在炎性 條件下顯著促進(jìn)3T3-L1對葡萄糖的攝取，提示這兩種樣品在炎性條件下可能激活A(yù)MPK，進(jìn) 而促進(jìn)糖消耗。④樣品的糖消耗與模型組相比降低，但并無顯著差異，說明其在炎性條件下 可能無激活A(yù)MPK的作用。二甲雙胍作為一胰島素敏感性具有AMPK活性，同時亦具有抗炎活 性(可能通AMPK途徑所介導(dǎo)），作為一陽性藥，顯著增加糖消耗，提示了 AMPK途徑的參與。 [0116]糖消耗實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)的是非胰島素狀態(tài)下脂肪細(xì)胞對糖的攝取利用，這一過程主要是 通過AMPK途徑而介導(dǎo)。炎性刺激可通過抑制AMPK的活化而抑制細(xì)胞對糖的氧化利用。
[0117](二)細(xì)胞毒活性研究
[0118] 腫瘤是全世界醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)，目前使用的抗腫瘤藥物多是通過干擾細(xì)胞的生 長、死亡、分化以及功能等相關(guān)的機(jī)制，來達(dá)到抑制細(xì)胞的生長甚至殺死細(xì)胞的目的?？鼓[ 瘤藥物的篩選包括體內(nèi)和體外兩種方法。對于樣品量極少時，一般以樣品對體外培養(yǎng)的腫 瘤細(xì)胞生長的抑制作用作為初篩。由于癌細(xì)胞生長具有相對的獨(dú)立性，故可在體外建立具 有無限增殖能力的細(xì)胞系，該法具有耗藥量少(2-10mg)，周期短，費(fèi)用低等特點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)中 我們采用MTT法研究從翻白草中分離得到的三萜成分化合物(20S)-3a_羥基-29-二甲氧基_ 27-白樺酸和3〇,30-二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸對人體此?62，1?^-7和!^1 &癌細(xì)胞株系 的細(xì)胞毒性。
[0119] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0120] 1.1儀器及設(shè)備
[0121] 超凈工作臺（吳縣實(shí)驗(yàn)動物器材廠）恒溫⑶2培養(yǎng)箱（德國HeraeUS)96孔培養(yǎng)板 (NUNCL0N)酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise)倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)全自動雙蒸水機(jī)(上 海玻璃儀器一廠)超速離心機(jī)0PTIMAXL-100K(貝克曼公司）。
[0122] 1.2試劑與化合物
[0123] RPMI1640培養(yǎng)基（GIB⑶）；胰蛋白酶（SIGMA);胎牛血清（HYCLONE) ;MTT(SIGMA); DMS0(SIGMA)〇
[0124] 3α，30-二羥基-20 (29)_烯-27-白樺酸由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，化合物經(jīng)HPLC分析， 純度彡98%。
[0125] (20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，化合物經(jīng)HPLC分 析，純度多98%。
[0126] 1.3細(xì)胞株及培養(yǎng)
[0127] 人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)和人肝癌細(xì)胞株(HepG2)(均由 北京協(xié)和藥物所提供)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，含10%小牛血清，37°C，5%C0 2。
[0128] 2、實(shí)驗(yàn)部分
[0129] 2.1實(shí)驗(yàn)原理
[0130] MTT比色法是一種經(jīng)典的檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒 體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而 死細(xì)胞無此功能。二甲基亞礬(DMS0)能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長 處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì) 胞數(shù)成正比。該方法己廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、 細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。
[0131] 2.2實(shí)驗(yàn)過程
[0132] 分別取處于對數(shù)生長期的貼壁人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株(Hela)、 人肝癌細(xì)胞株(HepG2)，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成5000個/ ml的細(xì)胞懸液，以8 X 103個/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種200μ1，37°C，5 %⑶2培 養(yǎng)24小時。設(shè)置一系列不同濃度，同時對照組換含有等體積的PBS培養(yǎng)基，每組設(shè)3平行孔， 37°C，5 %C02培養(yǎng)2天。1500r/min離心，棄去上清液，每孔加入5mg/ml新鮮配置的含MTT工作 液20μ1，37°C，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。小心棄去上清液，用胰酶消化后，每孔加入150μ1 DMS0溶解 ΜΤΤ甲臜沉淀，用微型超聲震蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長為490nm測定光密度值。按 下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率:腫瘤細(xì)胞生長抑制率=(1_藥物組A490值/對照組 Am) X 100%。然后求得該化合物的半數(shù)殺傷濃度IC50。
[0133] 3、結(jié)果
[0134] 經(jīng)過初步的細(xì)胞毒活性測試，計(jì)算得3α，30_二羥基-20(29)-烯-27-白樺酸對人乳 腺癌細(xì)胞株(10?-7)、人子宮癌細(xì)胞株(此1 &)、人肝癌細(xì)胞株(!1叩62)的1(：5()分別為24.9， 17.5和20.1111111〇1/1，（203)-3€[-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸對人乳腺癌細(xì)胞株(10^-7)、 人子宮癌細(xì)胞株(Hela)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)的IC 5Q分別為21.7，13.8和14.9臟01/1。提示 (20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸對人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人子宮癌細(xì)胞株 (Hela)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)具有良好的抑制活性，可用于乳腺癌、子宮癌、肝癌的臨床治 療。
[0135] 表3翻白草三萜化合物的細(xì)胞毒活性(n = 8)
[0136]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. (20S)-3a-羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸的提取方法，包括： (i) 粗提工序：干燥翻白草(Potentilla discolor Bunge)全草，用70體積％以上的乙 醇水溶液加熱提取，減壓蒸去乙醇，得到粗提物； (ii) 萃取工序：用水混懸上述粗提物，依次經(jīng)石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙 酯萃取部分； (iii) 柱層析工序:先將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫， 收集30-50體積％氯仿-甲醇的洗脫流分； 接著進(jìn)行小孔樹脂柱層析，甲醇-水梯度洗脫，收集70-90體積％甲醇水洗脫的流分； 然后進(jìn)行反相C18柱層析，丙酮-水梯度洗脫，收集50-70體積％丙酮-水洗脫的流分； (iii)純化工序:用葡聚糖凝膠柱純化，得到(20S)-3a_羥基-29-二甲氧基-27-白樺酸。2. -種翻白草總二砲的制備方法，所述翻白草總二砲是包含（20S) _3α-羥基-29-二甲 氧基-27-白樺酸的混合物，該方法包括： 干燥翻白草(Potentilla discolor Bunge)全草，用70體積％以上的乙醇水溶液加熱 提取，減壓蒸去乙醇，用水混懸，依次經(jīng)過石油醚萃取、乙酸乙酯萃取； 將乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析，用體積比1:0-0:1的氯仿-甲醇梯度洗脫，收集30-50 體積％和50-70體積％的氯仿-甲醇的洗脫流分； 進(jìn)行小孔樹脂柱層析，甲醇-水梯度洗脫，收集70-90體積％甲醇水洗脫的流分。3. 如權(quán)利要求2所述的翻白草總?cè)频闹苽浞椒ǎ龇撞菘側(cè)七€包含薔薇酸、2 α-羥基烏蘇酸、2α，3β，19α-三羥基-熊果酸、3α，30-二羥基-20 (29)_烯-27-白樺酸、熊果酸、 山楂酸、19α-羥基熊果酸、2α，3α-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸、齊墩果酸。
【文檔編號】A61P35/00GK106083986SQ201610513073
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】談景福, 俞磊明, 朱光明, 朱俊杰, 王立會
【申請人】上海市藥材有限公司