專利名稱：一種從動物糞便中提取高分子量基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物的分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從動物糞便中提取高分子量基因組的方法。
背景技術(shù)：
動物胃腸道內(nèi)龐大多樣的微生物群落與動物的食性、機體的免疫功能、疾病與健康等有著密切聯(lián)系，越來越引起重視并成為研究熱點。然而采用傳統(tǒng)方法破環(huán)性的采集胃腸道樣品對其進行研究受到很大制約，且對于野生保護動物并不可取，因此很多研究都以動物的糞便作為研究樣品。目前，分子生物學(xué)技術(shù)已成為研究和開發(fā)動物胃腸道微生物資源的核心技術(shù)，而從糞便樣品中提取高質(zhì)量、完整和有代表性的基因組DNA則是整個技術(shù)的基礎(chǔ)。目前，研究者們常采用酚/氯仿抽提法、Chelex-IOO煮沸法、微珠振蕩法以及一些大型公司推出的商業(yè)試劑盒，如QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen等從動物糞便中提取基因組。這些方法所提取的基因組DNA雖然可以滿足微生物分子生態(tài)多樣性研究、分子鑒定、目的基因擴增等研究的需要，但所得基因組DNA分子量一般難以達到40kb以上，因此無法用于大片段宏基因文庫的構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、經(jīng)濟、簡單且易于操作的從動物糞便中提取高分子量基因組的方法，用以從動物糞便樣品中提取高分子量的微生物基因組DNA，滿足微生物分子生態(tài)多樣性、分子鑒定、目的基因擴增及構(gòu)建宏基因組文庫等研究的需要。為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明的技術(shù)方案中，先通過離心和過濾去除糞便中的食物殘渣，收集菌體細胞；然后分別采用溶菌酶和消色肽酶對菌體進行破壁，以使動物糞便中對溶菌酶有抗性的革蘭氏陽性菌得以裂解，從而提高糞便樣品中DNA的產(chǎn)率和種類數(shù)量；經(jīng)過全方位的裂解細胞釋放核酸，再利用酚、氯仿、異戊醇混合液及氯仿、異戊醇混合液提取；再加入異丙醇及醋酸鈉沉淀，RNA酶去除RNA后得到微生物基因組DNA。為避免機械力對DNA 造成損傷，在菌體細胞開始裂解以后的步驟中，均采用輕柔的動作進行操作，避免用槍頭來回吹打，并且將吸取溶液的槍頭尖剪成大口。本發(fā)明的方法具體步驟包括
(I)樣品處理用無菌PBS緩沖液溶解收集的動物糞便樣品，徹底混勻后先低速離心去除大的食物殘渣，然后依次用孔徑為100Mffl、70Mffl、40Mffl的滅菌細胞過濾器進行過濾，并用 PBS緩沖液對截留在濾網(wǎng)上的雜質(zhì)進行多次沖洗；濾液置于離心機中離心，收集菌體；菌體依次用PBS緩沖液和TE緩沖液洗滌、離心收集菌體，用TE緩沖液懸浮菌體。(2)菌體細胞裂解:①向菌體懸浮液中加入高濃度的溶菌酶至終濃度15mg/ml，輕柔混勻后37°C水浴Ih ;②加入消色肽酶至終濃度3mg/ml，輕柔混勻后37°C水浴30min加入蛋白酶K至終濃度2mg/ml，輕柔混勻后55°C水浴5min ;④加入濃度為10%的SDS (中文)，輕柔混勻后55°C水浴lh。(3)抽提DNA :①在上述處理后的細胞裂解液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液,輕柔混勻后離心收集上清液;②加入等體積的氯仿/異戊醇混合液,輕柔混勻后離心收集上清液加入I倍體積異丙醇、1/10體積醋酸鈉，輕柔混勻后室溫沉淀30min以上； ④離心收集沉淀，用濃度為70%的乙醇洗滌沉淀，離心后收集沉淀； 沉淀置于室溫或真空干燥后，用TE或無菌去離子水溶解，并用RNA酶37°C水浴30min消解去除RNA，即為基因組 DNA提取液；
所述 PBS 緩沖液為137 mmol/L NaCl, 2. 7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2P04, pH 7. 4 ；
所述 TE 緩沖液為10 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，I mmol/L EDTA (pH 8.0)；
所述酚/氯仿/異戊醇混合液的體積比為25:24:1 ;
所述氯仿/異戊醇混合液的體積比為24: I。本發(fā)明方法簡便，適合從各種動物糞便中提取微生物基因組DNA，得到的DNA分子量較大。本發(fā)明方法可用于微生物分子生態(tài)多樣性、分子鑒定、目的基因擴增及構(gòu)建宏基因組文庫等的研究。


圖I為本發(fā)明實施例中提取的倭蜂猴糞便微生物基因組DNA的普通電泳圖。其中 I 為基因組 DNA IM-I ;2 為基因組 DNA 5M-I ;Marker 為 lamda DNA-Z/i/ d III digest marker。圖2為本發(fā)明實施例中提取的倭蜂猴糞便微生物基因組DNA的脈沖場電泳圖； Marker 為 Low Range PFG Marker。
具體實施例方式實施例
I、樣品處理
(1)無菌條件下稱取倭蜂猴糞便樣品lg，移入體積為50ml的無菌帶蓋離心管中，加入 15ml無菌PBS緩沖液，充分渦旋振蕩后IOOg離心15min，棄沉淀；
(2)上清用孔徑為IOOMffl的滅菌細胞過濾器進行過濾，并用無菌PBS緩沖液多次沖洗截留在濾網(wǎng)上的雜質(zhì)，收集濾液；
(3)濾液用孔徑為70Mm的滅菌細胞過濾器進行過濾，并用無菌PBS緩沖液多次沖洗截留在濾網(wǎng)上的雜質(zhì)，收集濾液；
(4)濾液用孔徑為40Mm的滅菌細胞過濾器進行過濾，并用無菌PBS緩沖液多次沖洗截留在濾網(wǎng)上的雜質(zhì)，收集濾液，以5000g離心lOmin，收集菌體沉淀；
(5)依次分別加入15ml無菌PBS緩沖液和TE緩沖液洗滌、同上離心收集菌體，用3 ml TE緩沖液充分懸浮菌體，并將懸浮液均分于8個體積為1.5 ml的小離心管中。2、菌體細胞裂解
(I)向每管菌體懸浮液中加入100mg/ml的溶菌酶至終濃度15mg/ml,輕柔混勻后37°C水浴lh，中間每隔IOmin混勻一次；
(2)加入50mg/ml的消色肽酶至終濃度3mg/ml,輕柔混勻后37°C水浴30min；
(3)加入20mg/ml蛋白酶K至終濃度2mg/ml,輕柔混勻后55°C水浴5min；
(4)加入濃度為10%的SDS50μ1，輕柔混勻后55°C水浴lh，中間每隔IOmin混勻一次。3、抽提 DNA
(1)在上述處理后的細胞裂解液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(V/V/V=25:24:1)， 輕柔混勻后12000g離心5min，收集上清液并轉(zhuǎn)入新的離心管中；
(2)加入等體積的氯仿/異戊醇(V/V=24:1)，輕柔混勻后12000g離心5min，收集上清液并轉(zhuǎn)入新的離心管中；
(3)加入I倍體積異丙醇、1/10體積醋酸鈉，輕柔混勻后室溫沉淀30min以上；
(4)12000g離心15min，棄上清，收集沉淀，用濃度為70%的乙醇洗滌沉淀，同上離心后收集沉淀；
(5)沉淀置于室溫或真空干燥后，用適量TE或無菌去離子水溶解，并加入10mg/mlRNA 酶至終濃度lmg/ml，37°C水浴30min消解去除RNA，即為基因組DNA提取液。所述PBS 緩沖液為137 mmol/L NaCl, 2. 7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2P04, pH 7. 4。所述TE 緩沖液為10 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，I mmol/L EDTA (pH 8. 0)。
權(quán)利要求
1.一種從動物糞便中提取高分子量基因組的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)樣品處理用無菌PBS緩沖液溶解收集的動物糞便樣品，徹底混勻后先低速離心去除大的食物殘渣，然后依次用孔徑為100Mffl、70Mffl、40Mffl的滅菌細胞過濾器進行過濾，并用 PBS緩沖液對截留在濾網(wǎng)上的雜質(zhì)進行多次沖洗；濾液置于離心機中離心，收集菌體；菌體依次用PBS緩沖液和TE緩沖液洗滌、離心收集菌體，用TE緩沖液懸浮菌體；(2)菌體細胞裂解Φ向菌體懸浮液中加入高濃度的溶菌酶至終濃度15mg/ml，輕柔混勻后37°C水浴Ih ;②加入消色肽酶至終濃度3mg/ml，輕柔混勻后37°C水浴30min 加入蛋白酶K至終濃度2mg/ml，輕柔混勻后55°C水浴5min 加入濃度為10%的SDS’輕柔混勻后55°C水浴Ih ；(3)抽提DNA:①在上述處理后的細胞裂解液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液，輕柔混勻后離心收集上清液;②加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，輕柔混勻后離屯收集上清液；③加入I倍體積異丙醇、1/10體積醋酸鈉，輕柔混勻后室溫沉淀30min以上4 離心收集沉淀，用濃度為70%的乙醇洗滌沉淀，離心后收集沉淀；⑤沉淀置于室溫或真空干燥后，用TE或無菌去離子水溶解，并用RNA酶37°C水浴30min消解去除RNA，即為基因組 DNA提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從動物糞便中提取高分子量基因組的方法，其特征在于所述 PBS 緩沖液為137 mmol/L NaCl, 2. 7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2P04, pH 7. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從動物糞便中提取高分子量基因組的方法，其特征在于所述 TE 緩沖液為10 mmol/L Tris-HCl (pH 8· 0)，I mmol/L EDTA (pH 8. 0)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從動物糞便中提取高分子量基因組的方法，其特征在于所述酚/氯仿/異戊醇混合液的體積比為25:24: I。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從動物糞便中提取高分子量基因組的方法，其特征在于所述氯仿/異戊醇混合液的體積比為24: I。
全文摘要
本發(fā)明是一種從動物糞便中提取高分子量基因組的方法。包括樣品處理、菌體細胞裂解和抽提DNA。用無菌PBS緩沖液溶解動物糞便樣品，通過低速離心和過濾去除糞便中的食物殘渣，收集菌體細胞，采用溶菌酶+消色肽酶+蛋白酶+SDS對菌體進行破壁，再經(jīng)酚、氯仿、異戊醇混合液及氯仿、異戊醇混合液抽提，異丙醇及醋酸鈉沉淀、洗滌干燥、溶解后用RNA酶消解RNA。本發(fā)明操作簡單，提取的基因組DNA分子量達到40kb以上，可滿足微生物分子生態(tài)多樣性、分子鑒定、目的基因擴增及構(gòu)建宏基因組文庫等的研究。
文檔編號C12N15/10GK102586234SQ20121006243
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者唐湘華, 李俊俊, 楊云娟, 楊富亞, 許波, 黃遵錫 申請人:云南師范大學(xué)