專利名稱：甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及免疫學(xué)將免疫靶向治療載體與甲型流感病毒保守短肽M2e偶聯(lián)形成的綴合物。所述綴合物能交叉保護(hù)各亞型甲型流感病毒的攻擊。
背景技術(shù)：
制備通用流感疫苗是目前流感疫苗研究的熱點(diǎn)。流感是一種嚴(yán)重危害人類健康的急性呼吸道傳染病，接種流感疫苗是最有效的防護(hù)手段。目前生產(chǎn)的流感疫苗主要針對誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)但是有兩個因素制約了季節(jié)性流感疫苗在防控流感大流行中的應(yīng)用:一個是疫苗株與流行毒株是否匹配的問題，因?yàn)榧竟?jié)性流感疫苗主要通過誘發(fā)血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA的抗體起免疫保護(hù)，毒株不匹配就不會有好的保護(hù)效果；另一個是從確定疫苗毒株到最終獲得疫苗所需的較長周期和對雞胚的依賴。因此，利用甲型流感病毒的保守抗原，研制不同亞型間具有交叉保護(hù)作用的廣譜流感疫苗，就成為流感疫苗研究的重要內(nèi)容。甲型流感病毒基質(zhì)蛋白2 (Mat rixprotein 2，M2)是除HA和NA以外的第3個外膜蛋白，M2的胞外區(qū)(M2ectodomain，M2e)是M2蛋白N端23個氨基酸，M2e在甲型流感病毒特別是人源的甲型流感病毒不同亞型間高度保守，M2尤其是M2e已成為廣譜流感疫苗研究中常用的靶抗原。目前，已有四種基于M2e的疫苗進(jìn)入I期臨床研究，這些疫苗的研究結(jié)果為早日研制成功防控流感大流行的廣譜流感疫苗提供了大量的實(shí)驗(yàn)資料。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒的衣殼蛋白裝配成的不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，具有病毒的外形和免疫原性，可通過和病毒感染的途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以體液免疫為主的反應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，由于VLP缺少遺傳物質(zhì)核酸，故避免了病毒感染的風(fēng)險。VLP可以使外源表位以有序、陣列方式呈現(xiàn)，還能增加抗原的穩(wěn)定性和免疫原性，如大腸桿菌表達(dá)的HBc、番木瓜花葉病毒(PapMV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、噬菌體Q β等VLP已作為載體應(yīng)用于M2e-VLP疫苗研究。噬菌體V LP也是一種可將多肽抗原呈現(xiàn)在顆粒表面的載體。Q β-VLP可用作鼻腔免疫載體，有利于誘發(fā)局部和系統(tǒng)性免疫反應(yīng)。目前國外已經(jīng)制備出Q β噬菌體VLP病毒樣顆粒用于降壓疫苗的IIa臨床實(shí)驗(yàn)。并已有M2e化學(xué)偶聯(lián)或者基因融合的VLP進(jìn)入臨床I期實(shí)驗(yàn)。目前已有4家公司報道了 I期的基于M2e的流感疫苗的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這四家公司分別 Acambis Inc.(英國)，Cytos BiotechnologyU^fi), Merck & CoInc.(美國)，and VaxInnate Corp.(美國)。有基于融合的M2e_HBcVLP和M2e_flagellin,也有化學(xué)偶聯(lián)的M2e-0MPC和M2e_AP205VLP。Q β噬菌體和ΑΡ205噬菌體都屬于RNA病毒，其外形成球形，由衣殼蛋白組成的病毒顆粒非常適合用作疫苗載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是構(gòu)建一種基于人甲型流感基質(zhì)蛋白M2的保守序列M2e的病毒樣顆粒偶聯(lián)物(M2e)n-Qi3-VLP通用流感疫苗，偶聯(lián)的方法可以為化學(xué)偶聯(lián)或者是基因融合。偶聯(lián)的M2e肽段可以串聯(lián)為M2e-M2e或者(M2e)n其中η為1、2、3、4、5、6、7、8。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:1.病毒樣顆粒的制備:本發(fā)明 利用了已經(jīng)公開的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?201010028904.7)Q β噬菌體VLP作為偶聯(lián)用載體。這種突變的VLP具有以下特點(diǎn):(I)Qii噬菌體CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸序列AAGCTT (或者插入編碼M2e的單基因序列或者重復(fù)串聯(lián)的M2e基因序列)。并將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后克隆到原核表達(dá)載體上。(2)插入在第72位和73位氨基酸為賴氨酸和亮氨酸是Q β噬菌體衣殼蛋白刺突頂端，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識別的主要部門，即病毒樣顆粒的免疫優(yōu)勢決定區(qū)。(3)該VLP是由大腸桿菌可溶性表達(dá)的。制備噬菌體病毒樣顆粒Q β-VLP的具體步驟:菌種大腸桿菌DH5a/pETQ β-CP接種到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至適當(dāng)菌液達(dá)到OD值，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)數(shù)小時后，收集菌液，使用超聲破碎細(xì)胞，裂解后，離心分別收集上清和沉淀。對形成的多聚體，使用SepharoseCL-4B層析柱純化。2.人甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M2保守序列M2e肽段的合成:采用固相合成法利用多肽合成儀自動人甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M2的保守肽段M2e 的氨基酸序列為 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro He Arg Asn Glu Trp GlyCys Arg Cys Asn AspSer SerAsp Cys (GenBank:ACA49877.1),其中 M2e 的 C末端加入半月光氨酸Cys以便于Q β -VLP偶聯(lián)。偶聯(lián)的M2e肽段可以串聯(lián)為M2e_M2e或者(M2e)n其中η為 1、2、3、4、5、6、7、8。3.肽段M2e分別與噬菌體病毒樣顆粒Q β _VLP、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián):步驟:取50mg的Q β -VLP和5mg/mL的Sulfo-SMCClOml混合，室溫反應(yīng)2小時，并持續(xù)低速攪拌。使用0.1ΜρΗ7.2的PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時后用于偶聯(lián)。取100mgM2e肽溶于5ml偶聯(lián)緩沖液(83mM磷酸鈉緩沖液，0.1MEDTA,
0.9MNaCl，0.02% NaN3, ρΗ7.2)中，后將其與結(jié)合 Sulfo-SMCC 的 Q β -VLP 混合，室溫反應(yīng)2小時后，PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時后_80°C保存，此即為制備好的M2e-QP VLP。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1.甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物具有交叉保護(hù)各亞型甲型流感病毒的攻擊的能力，為通用型流感疫苗的研制打下基礎(chǔ)。2.甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒通過化學(xué)方法偶聯(lián)，制備時間短，且易于大規(guī)模生產(chǎn)，克服了傳統(tǒng)的用雞胚生產(chǎn)流感疫苗在研制、生產(chǎn)技術(shù)路線方面的不足。


圖1實(shí)施例二中小鼠抗血清滴度曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述:實(shí)施例一、M2e-Q β -VLP綴合物和對照品M2e_鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)物的制備
步驟1、噬菌體病毒樣顆粒Q β -VLP的制備:將菌種大腸桿菌DH5 a /pETQ β -CP接種到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至適當(dāng)菌液達(dá)到OD值，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)數(shù)小時后，收集菌液，使用超聲破碎細(xì)胞，裂解后，離心分別收集上清和沉淀。對形成的多聚體，使用SepharoseCL-4B層析柱純化。步驟2、M2e多肽的合成:采用固相合成法利用多肽合成儀自動合成人甲型流感病毒M2蛋白保守序列M2e步驟3、肽段M2e分別和噬菌體病毒樣顆粒Q β -VLP和鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)。分別取50mg的Q β -VLP和KLH，和5mg/mL的Sulfo-SMCClOml混合，室溫反應(yīng)2小時，并持續(xù)低速攪拌。使用0.1ΜρΗ7.2的PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時后用于偶聯(lián)。取100mgM2e肽溶于5ml偶聯(lián)緩沖液(83mM磷酸鈉緩沖液，0.1MEDTA，0.9MNaCl,
0.02% NaN3,pH7.2)中，后將其分別與結(jié)合Sulfo-SMCC的Q β -VLP和KLH混合，室溫反應(yīng)2小時后，PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時后_80°C保存，此即為制備好的M2e-Q β VLP和M2e_KLH。M2e_KLH為檢測M2e_Q β -VLP綴合物抗原性的對照品。實(shí)施例二、ELISA法檢測小鼠血清抗體滴度6周齡C57BL/6雌鼠，20只隨機(jī)分為4組，每組平均5只。組別分為M2e多肽組、M2e-Q0VLP組以及M2e-KLH組以及對照組。免疫方法、劑量、時間間隔、次數(shù)見下表I。表1:免疫策略
權(quán)利要求
1.甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，采用人甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M2的胞外區(qū)M2e多肽作為半抗原，以已經(jīng)公開的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?201010028904.7) Q β噬菌體病毒樣顆粒(Q β-VLP)作為載體，將I個M2e或多個M2e串聯(lián)體與Q β -VLP結(jié)合制備成綴合物(M2e)n-Q β -VLP, η為I至8的自然數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，所述的M2e多肽來自于人甲型流感病毒株基質(zhì)蛋白M2胞外區(qū)部分，所述的M2e多肽序列如SEQ N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，載體部分(Q β-VLP)采用的是已經(jīng)公開的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?201010028904.7)Qβ噬菌體病毒樣顆粒(QP-VLP)制備技術(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，所述的綴合物能用于 保護(hù)不同亞型人甲型流感病毒的攻擊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有免疫靶向治療的短肽載體Q β噬菌體病毒樣顆粒VLP與人流感病毒M2蛋白保守肽M2e的綴合物。所述綴合物主要用于預(yù)防人甲型流感。所述綴合物的偶聯(lián)方法采用Sulfo-SMCC方法。第一步制備Q β噬菌體的病毒樣顆粒VLP，第二步制備sulfo-SMMC活化的病毒樣顆粒VLP，第三步制備綴合物M2e-VLP。所述綴合物在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，并能交叉保護(hù)各亞型甲型流感病毒的攻擊。
文檔編號A61K39/145GK103083656SQ20111033089
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者姬云, 昇文國, 劉紅海, 許峰, 馬嚴(yán), 堵蕓倩 申請人:蘇州科貝生物技術(shù)有限公司