專利名稱：甲型h1n1流感病毒總抗體快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測 甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙。
背景技術(shù)：
甲型H1N1流感病毒是一種新型的流感病毒，2009年在世界范圍內(nèi)大流行，嚴(yán)重 危害人類的健康。其"Ha"指的是血球凝集素(Hemagglutinin) 、"Na"指的是神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase),甲型流感病毒H有1 15型，有1 9型。H1N1是甲型流感病毒的一 種，也是危害最大的病毒之一。在歷史上曾造成數(shù)次大流行。 目前對甲型H1N1流感檢測的主要方法是PCR基因擴(kuò)增診斷方法，鼻咽試紙抗原診 斷方法等。在抗體檢測方面，有ELISA等檢測方法，但用膠體金類免疫層析技術(shù)對甲型H1N1 總抗體進(jìn)行檢測尚未有相關(guān)報(bào)道。對H1N1總抗體檢測主要有已下作用1 :對H1N1流感進(jìn) 行輔助診斷。根據(jù)"甲型H1N1流感診療方案"第三版，甲型H1N1流感病原學(xué)檢測方法之一 為動態(tài)檢測雙份血清甲型H1N1流感病毒特異性抗體水平呈4倍或4倍以上升高，是感染 H1N1流感病毒的指標(biāo)。2 :對是否已感染H1N1進(jìn)行鑒別，隱性感染或感染過該病毒的人體 內(nèi)抗H1N1病毒總抗體將長期存在。3 :對免疫接種的效果進(jìn)行評價(jià)，從數(shù)據(jù)上看，目前H1N1 接種的有效率約為90%，尚有10%的人需要篩選出來重新接種或用其它方式進(jìn)行該病的 預(yù)防。考慮到感染和接種的人群巨大，運(yùn)用一種快速、簡便、有效的抗體檢測方法非常必要。
免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，在抗體檢測方面已得到較為廣泛運(yùn)用， 基本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對抗原或 抗體，檢測時(shí)當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié) 合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測T線， 通過檢測線的有無實(shí)現(xiàn)對結(jié)果的判定。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合 現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，采用雙抗原 夾心法制備，具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu) 點(diǎn)。 本發(fā)明提供一種甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于塑料支撐 板7 —端連接上樣墊1 ，上樣墊1的一端緊密壓接含有標(biāo)記H1N1特異性的血球凝集素Ha或 H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原的膠體金墊2，膠體金墊2 —端緊密壓 接硝酸纖維素NC膜3，硝酸纖維素NC膜3包被有相互分離的檢測T線5和質(zhì)控C線6， T線 為包被在NC膜上的的H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神 經(jīng)氨酸酶Na抗原，C線為包被在NC膜上的抗H1N1抗體，硝酸纖維素NC膜3的另一端連接 吸樣墊4形成試紙。
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所述的甲型HlNl流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的抗原為HlNl 特異性的血球凝集素(Ha)和神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原，抗原可以從H1N1病毒中純化提取或利 用基因工程重組表達(dá)。 所述的甲型HlNl流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的上樣墊1為玻 璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成4。 所述的甲型HlNl流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于，所述的抗原的包被 方法為以0. 01M pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將HlNl特異性的血球凝集素(Ha)和(或) 神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原配制成O. 5-2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)進(jìn) 行劃線，包被T線，同時(shí)在NC膜上部包被抗HlNl抗體作為C線，劃線后將NC膜在干燥間， 溫度20-25。C，濕度小于30%，干燥2-5小時(shí)。 上述的甲型HlNl流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于，所述的抗原標(biāo)記膠 體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm的膠體金溶液，制備 完成后取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0. 2MI^C03調(diào)至pH8.0，按100ml膠體金溶液加入 0. 5-2mgHlNl血球凝集素(Ha)和神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入1%牛血清 白蛋白BSA， 0. 1 %聚乙二醇PEG20000封閉20min， 12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金 工作液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置 干燥間，溫度20-25t:，濕度小于30%，干燥2-5小時(shí)，制成膠體金墊。
上述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的試紙的裝配 方法為在干燥室內(nèi)，溫度20-25°C ，濕度小于30% ，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置 在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠 體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/5 ;在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊 的1/10 ;最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條，切好的試紙條可以再裝入塑 料卡內(nèi)，形成檢測卡。 所述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于，檢測方法為將被 檢血清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入50-100ul被檢樣品， 樣品溶解膠體金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在20分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并 判定檢測結(jié)果。 本發(fā)明的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)檢測甲型H1N1流感病 毒總抗體快速檢測試紙。采用雙抗原夾心法實(shí)現(xiàn)對總抗體的檢測。采用膠體金標(biāo)記甲型 H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病青抗原實(shí)現(xiàn)對血液中抗甲型H1N1流感病毒總抗 體的檢測?？赏瑫r(shí)檢測IgG和IgM。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn) 場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。


圖1甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖符號說明 1 :上樣墊；2 :膠體金墊；3 :NC膜；4 :吸樣墊
5 :檢測(T)線;6 :質(zhì)控(C)線;7 :塑料支撐板
具體實(shí)施例方式實(shí)施例制備甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙
l主要材料 1. l特異性甲型HlNl流感病毒Ha抗原Sino Biological Inc.公司產(chǎn)品，為重組
抗原，用于膠體金標(biāo)記和NC膜T線包被；抗Ha抗體，用Ha免疫山羊自制，用于NC膜包被；
氯金酸Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜:Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，
聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純試劑。 1. 2臨床血清由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，其中在近期接種H1N1疫苗樣本80份，未
接種疫苗樣本120份。 1. 3甲型H1N1流感病毒IgG ELISA試劑盒，Sino Biological Inc.產(chǎn)品。
2方法 2. 1甲型H1N1流感病毒Ha重組抗原的膠體金標(biāo)記氯金酸_檸檬酸三鈉還原法 制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2M K2C03將溶液調(diào) 到pH7. 0、 pH8. 0和pH9. 0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100ml溶液加入 0. 5mg、lmg、1. 5mg將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，再滴加入 到終濃度為0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA進(jìn)行封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000r/m離心， 棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩沖液，pH8. O，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性劑中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按1ml溶液鋪22cm2的比例加樣于無紡 布上，在溫度20-251:，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-4小時(shí)，制成膠體金墊。
2. 2H1N1流感病毒Ha重組抗原的包被用0. 01M pH7. 2PBS將H1N1流感病毒Ha重 組抗原分別稀釋成0. 5mg/ml、 lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm進(jìn)行劃 線包被，同時(shí)在NC膜上部包被抗Ha抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將NC膜在在溫度 20-25"，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-5小時(shí)。 2. 3甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙的組裝在干燥室內(nèi)(溫度20_25°C， 相對濕度< 30% )取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜 T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭 膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);然后用裁剪機(jī)將貼好 塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成甲型H1N1流 感病毒總抗體檢測試劑卡。 2. 4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑卡平放，在 上樣墊上加入50-100ul被檢樣品，若樣品中含抗甲型HlNl流感病毒總抗體，則和樣品墊上 的標(biāo)記甲型H1N1流感病毒抗原的膠體金結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴(kuò)散到NC膜上進(jìn)一步層析， 當(dāng)遇到包被在NC膜上T線處的H1N1流感病毒Ha重組抗原時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗抗原結(jié) 合，被捕獲在包被處，當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，則形成一條肉眼可見的T 線；若血清中不含特異性抗體，則不能形成免疫復(fù)合物，亦不能形成T線，C線作為試劑的質(zhì) 控標(biāo)準(zhǔn)，陽性和陰性樣品檢測時(shí)均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在5、10、15、20、30和45分鐘內(nèi) C、 T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。 2. 5試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對，制備小樣，利 用質(zhì)控血清對試劑進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)最佳組合。
2. 6臨床血清檢測用本試劑按檢測方法對所有臨床血清進(jìn)行檢測，同時(shí)用Sino Biological Inc.甲型H1N1 ELISA抗體檢測試劑進(jìn)行對照檢測。 3結(jié)果3. l試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測結(jié)果，確定了試紙的最佳標(biāo)記pH值為 8. 0 ;重組混合抗原的最佳標(biāo)記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為10mM 硼酸酸鹽緩沖液，pH8. O，含0. 5% BSA、10X羊血清，2X蔗糖，0. 2% Tween 20 ;最佳H1N1流 感病毒Ha重組抗原包被濃度為lmg/ml。檢測結(jié)果的最佳判定時(shí)間為5_20分鐘。但以上參 數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時(shí)可能需要適當(dāng)調(diào)整。 3. 2臨床血清檢測以ELISA試劑為對照，80份近期接種甲型H1N1流感病毒疫苗 人員的樣本中，檢測出陽性70份，ELISA檢測出陽性血清72份，靈敏度二 70/72 = 97.2%; 本試劑對120份未接種H1N1疫苗人員樣本中檢出陰性為110份，ELISA試劑的檢測陰性為 112分，相對特異性為110/112 = 98. 2%。 P > 0. 05。試劑性能和ELISA試劑相比無顯著 性差異，適合臨床檢測需要。
權(quán)利要求
一種甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于塑料支撐板(7)一端連接上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原的膠體金墊(2)，膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素(NC)膜(3)，硝酸纖維素(NC)膜(3)包被有相互分離的檢測(T)線(5)和質(zhì)控(C)線(6)，T線為包被在NC膜上的的H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原，C線為包被在NC膜上的抗H1N1抗體，硝酸纖維素(NC)膜(3)的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的 抗原為H1N1特異性的血球凝集素(Ha)和神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原，抗原可以從H1N1病毒中 純化提取或利用基因工程重組表達(dá)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的 上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成(4)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于， 所述的抗原的包被方法為以0. 01M pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將H1N1特異性的血球凝 集素(Ha)和(或)神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原配制成0. 5_2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下 部以lul/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線，同時(shí)在NC膜上部包被抗H1N1抗體作為C線，劃線 后將NC膜在干燥間，溫度20-25t:，濕度小于30%，干燥2-5小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于， 所述的抗原標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm 的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0. 2M K2C03調(diào)至pH8. 0，按 100ml膠體金溶液加入0. 5-2mg H1N1血球凝集素(Ha)和神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，加入1%牛血清白蛋白BSA，O. 1X聚乙二醇PEG20000封閉20min， 12000r/m離心30 分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪22cm的比例均勻地鋪在玻璃纖 維膜或無紡布上，再置干燥間，溫度20-25°C ，濕度小于30% ，干燥2-5小時(shí)，制成膠體金墊。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，其特征在于所 述的試紙的裝配方法為在干燥室內(nèi)，溫度20-251:，濕度小于30%，取塑料支撐板板，將已 包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊 的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/5 ;在NC膜C線一側(cè)搭 接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10 ;最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條，切好的試 紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成檢測卡。
全文摘要
本發(fā)明是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種甲型H1N1流感病毒總抗體快速檢測試紙，采用雙抗原夾心法實(shí)現(xiàn)對總抗體的檢測。采用膠體金標(biāo)記甲型H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病毒抗原實(shí)現(xiàn)對血液中抗甲型H1N1流感病毒總抗體的檢測?？赏瑫r(shí)檢測IgG和IgM。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/569GK101788562SQ20101013318
公開日2010年7月28日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者李洲, 楊發(fā)青 申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司