專利名稱：苦楝皮在制備抑制甲型h1n1流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從2009年3月18日墨西哥發(fā)現(xiàn)首例甲型Hmi流感病例，2009年4月27日美國在一名加利福尼亞州患者身上獲得并分離得到的病毒基因序列。研究表明這種病毒基因組由禽流感、豬流感和人流感病毒基因混合而成，是一種新型的甲型Hmi流感病毒，它所引起的流感具有高度傳染、傳播迅速、易流行的特點甲型流感病毒傳染性高、傳播迅速、易發(fā)生流行、變異速度快，而疫苗研究和生產(chǎn)速度較慢，使得化學(xué)藥物和流感病毒疫苗難以發(fā)揮其最佳治療和預(yù)防效果。中草藥具有抑制流感病毒復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛抗炎等綜合功效，在防治流感病毒方面具有獨特的優(yōu)勢。苦楝皮，來源于楝科植物川楝的干燥樹皮及根皮，具有如下作用1、驅(qū)蟲作用川楝、苦楝的根皮或干皮中所含的苦楝素有驅(qū)蛔作。其酒精提取物在體外對豬蛔，特別對其頭部有麻痹作用。25% 50%苦楝皮藥液在體外對小鼠蟯蟲也有麻痹作用?？嚅ぬ崛∫荷杏幸欢ǖ目寡x作用。2、抗真菌作用苦楝子乙醇浸液(1 4)在試管內(nèi)對黃色毛癬菌、同心性毛癬菌、 許蘭毛癬菌、奧杜盎小芽胞癬菌、鐵銹色小芽胞癬菌、羊毛狀小芽胞癬菌、紅色皮膚癬菌、星形奴卡菌等常見的致病性真菌，有較明顯的抑制作用。3、對肌肉收縮的作用實驗表明，川楝素對骨骼肌由直接刺激引起的收縮反應(yīng)有增強作用。4、研究表明，川楝素有抗肉毒桿菌毒素的作用.川楝素能顯著延長肉毒中毒標(biāo)本對間接刺激收縮反應(yīng)的麻痹時間，提示其能在神經(jīng)肌肉接頭處對抗肉毒的阻遏作用。迄今為止，尚未有關(guān)于苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實施的苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。所述苦楝皮為生藥材或苦楝皮提取物中的一種。所述的苦楝皮提取物的制備方法為將苦楝皮用蒸餾水浸泡過夜后，過濾，得第一次浸泡過濾后所得液體和過濾后的苦楝皮，將過濾后的苦楝皮再加入蒸餾水浸泡過夜后，以文火加熱煮中藥3-5小時，過濾，得熬煮過濾后的液體，將第一次浸泡過濾后所得液體和熬煮過濾后所得液體混合，得到混合溶液，凍干混合溶液后得到苦楝皮粉末，所述浸泡苦楝皮的溶液為甲醇或乙醇中的一種。將所述凍干后的苦楝皮粉末溶解用蒸餾水溶解至濃度為10mg/mL，得苦楝皮溶液。將神經(jīng)氨酸酶溶解在MES緩沖液(PH 6. 5)和CaCl2中，得神經(jīng)氨酸酶溶液，取神經(jīng)氨酸酶溶液和苦楝皮溶液在37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入MUNANA的緩沖溶液，立即用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm，測定時間為 8min。對0. 001-0. IU的神經(jīng)氨酸酶，對其具有抑制作用的苦楝皮溶液濃度為 31. 25-250ug/mLo本發(fā)明的原理本發(fā)明的效果主要是通過對神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，ΝΑ)的抑制能力來驗證的。NA是甲型Hmi流感病毒最重要的蛋白之一，在病毒從感染細(xì)胞中的釋放的過程中，特別是病毒復(fù)制周期后期，NA起主要作用。由于它具有酶功能，能水解細(xì)胞膜上各種糖蛋白受體末端的唾液酸，因此，NA能夠清除病毒顆粒表面糖蛋白末端的唾液酸，防止病毒的自我聚積，促使子代病毒釋放。另外，NA是一個重要的抗原，并且是病毒穿透呼吸道上皮黏液所必需的。NA—旦發(fā)生突變，可導(dǎo)致甲型Hmi流感病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑產(chǎn)生抗性作用。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明為苦楝皮發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。2、本發(fā)明以苦楝皮生藥材、苦楝皮提取物抑制甲型Hmi病毒，效果顯著，苦楝皮對神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為IC50(yg/mL) = 184. 3士 13. 1和IC50(yg/mL)= 0. 76士0. 27，本發(fā)明提供了苦楝皮在作為抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中活性成分的應(yīng)用，為今后開發(fā)出一種新的抑制甲型Hmi流感病毒的藥物奠定基礎(chǔ)。


圖1為細(xì)胞相對活力與苦楝皮溶液濃度的關(guān)系；圖2為苦楝皮溶液濃度與病毒產(chǎn)量的MTT檢測圖。
具體實施例方式以下通過實例形式的具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例1稱取IOg粉碎的苦楝皮，IOOml蒸餾水浸泡過夜，過濾，得第一次浸泡過濾后所得液體和過濾后的苦楝皮，在過濾后的苦楝皮中再加入IOOml蒸餾水，浸泡過夜后，以文火加熱煮中藥4小時，過濾，得熬煮過濾后的液體，將第一次浸泡過濾后所得液體和熬煮過濾后所得液體混合，得到混合溶液，凍干混合溶液后得到苦楝皮粉末。將苦楝皮粉末用蒸餾水溶解至濃度為10mg/mL，得苦楝皮溶液。實施例2將神經(jīng)氨酸酶(A/California/7/2009(HlNl) NYMC X-179A c 流感病毒株，經(jīng)雞胚傳代，收尿囊液，_70°C保存?zhèn)溆?溶解在32. 5mmol/L的MES緩沖液(PH 6. 5)和4mmol/L CaCl2中，得神經(jīng)氨酸酶溶液，取49 μ L神經(jīng)氨酸酶溶液和1 μ 1苦楝皮溶液在37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入終濃度為20 μ mol/L的MUNANA的緩沖溶液50 μ 1，立即用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm，測定時間為8min。檢測結(jié)果為，苦楝皮對神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為IC50(yg/mL) = 184. 3士 13. 1。
實施例3將神經(jīng)氨酸酶(Clostridiumperfringens (C. welchii)，N2876，購于 Sigma)溶解在32. 5mmol/L的MES緩沖液(PH 6. 5)和4mmol/L CaCl2中，得神經(jīng)氨酸酶溶液，取 49 μ 1神經(jīng)氨酸酶溶液和1 μ 1苦楝皮溶液在37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入終濃度為20 μ mol/L的MUNANA的緩沖溶液50 μ 1，立即用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm，測定時間為8min。抑制程度的強弱可以從加或不加苦楝皮的初始反應(yīng)速率來決定檢測結(jié)果為，苦楝皮對神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為 IC50(y g/mL) = 0. 76 士 0. 27。實施例4結(jié)合圖1圖2說明本實施例。為了檢測苦楝皮在細(xì)胞水平的抗流感作用，我們將由實施例1得到的苦楝皮溶液按梯度稀釋成不同的濃度，分別為31. 25ug/ML、62. 5ug/ML、125ug/ML和250ug/ML，將上述苦楝皮溶液分別與100TCID50的病毒等體積孵育2小時，總體積為200 μ L，并且稀釋液都用維持液(即無血清，含10ug/ml胰酶的DMEM)，然后將上述一系列苦楝皮溶液與100TCID50 的病毒的混合物接種到已經(jīng)長成單層的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)板上，2小時后，換不含F(xiàn)BS的維持液，24小時后換含2% FBS的維持液，連續(xù)觀察2-3天，用MTT法檢測細(xì)胞病變效果。同時設(shè)只加維持液、只加同稀釋度的病毒液或者只加不同濃度藥物稀釋液作為對照組，于37°C、 5% CO2培養(yǎng)，對中藥苦楝皮進(jìn)行抗病毒活性研究。結(jié)果如圖1所示，在沒有加入Hmi病毒時，細(xì)胞活力隨著苦楝皮濃度的增加呈現(xiàn)降低趨勢，說明苦楝皮提取物具有細(xì)胞毒性；在同時加入苦楝皮提取物和Hmi病毒時，隨著苦楝皮提取物濃度的增加，細(xì)胞活力也隨著增加。說明苦楝皮可以抑制流感病毒，保護(hù) MDCK細(xì)胞免受病毒破壞，而且保護(hù)效應(yīng)隨著苦楝皮提取物濃度的增加而增加即呈現(xiàn)濃度依賴性。圖2為苦楝皮溶液濃度與病毒產(chǎn)量的MTT檢測圖，由圖可見，隨藥物濃度的提高， 病毒產(chǎn)量逐漸下降，這同時輔證了苦楝皮有較好抗流感病毒作用。實施例5為了進(jìn)一步說明苦楝皮具有抗流感病毒的活性，我們做了動物實驗。將六星期大的雌性BALB/c小鼠(由長春生物制品研究所提供)用50μ1 0.2%戊巴比妥鈉麻醉，滴鼻吸入50 μ 1 A/FM/1/47 (HlNl)流感病毒(由白求恩醫(yī)科大學(xué)分子生物實驗室提供)。將小鼠分成五組，每組十只，一、二、三組每十五天分別喂飼40，80和160mg/kg的苦楝皮提取物， 第一次喂飼在小鼠被流感病毒感染之前兩天實施。每十五天觀察一下小鼠的死亡率。結(jié)果如表3所示，從中可以看出喂飼苦楝皮提取物的三組小鼠的死亡之書只數(shù)明顯小于病毒組，生存天數(shù)也明顯長于病毒組，說明苦楝皮可以增加被流感病毒感染的小鼠的存活率。表 權(quán)利要求
1.苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述苦楝皮為生藥材或苦楝皮提取物中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的苦楝皮提取物的制備方法為將苦楝皮用蒸餾水浸泡過夜后，過濾，得第一次浸泡過濾后所得液體和過濾后的苦楝皮，將過濾后的苦楝皮再加入蒸餾水浸泡過夜后，以文火加熱煮中藥3-5小時，過濾，得熬煮過濾后的液體，將第一次浸泡過濾后所得液體和熬煮過濾后所得液體混合，得到混合溶液，凍干混合溶液后得到苦楝皮粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的苦楝皮在制備抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述苦楝皮提取物的制備方法中，所述將苦楝皮用蒸餾水浸泡過夜后和將過濾后的苦楝皮再加入蒸餾水浸泡過夜后的步驟中的蒸餾水替換為甲醇或乙醇中的一種。
全文摘要
苦楝皮在制備抑制甲型H1N1流感病毒藥物中的應(yīng)用，屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實施的首先制備苦楝皮溶液，取神經(jīng)氨酸酶溶液和苦楝皮溶液在37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入MUNANA的緩沖溶液，用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。本發(fā)明為苦楝皮發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域；本發(fā)明以苦楝皮生藥材、苦楝皮提取物抑制甲型H1N1病毒，效果顯著，為今后開發(fā)出一種新的抑制甲型H1N1流感病毒的藥物奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A61K36/58GK102266389SQ20111025310
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者徐經(jīng)緯, 房學(xué)迅, 楊衛(wèi), 楊艷琴, 王晨旭, 田莉, 肖延蒙 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所