本發(fā)明屬于生物，涉及一種檢測(cè)lox基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、賴氨酰氧化酶（lysyl?oxidase，lox）是一種重要的銅依賴的酶。其經(jīng)典的生物學(xué)功能是通過氧化多肽鏈中的賴氨酸殘基，促進(jìn)膠原蛋白、彈性蛋白及組蛋白等形成共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而生成不溶性的纖維或聚合物，在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2、人類lox基因定位于染色體5q23.1-q23.2區(qū)域，全長由15,166個(gè)核苷酸組成，包含七個(gè)外顯子，共同編碼lox蛋白的完整功能結(jié)構(gòu)。有諸多研究證據(jù)表明，lox的表達(dá)水平與腫瘤、纖維化疾病、血管性疾病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

3、現(xiàn)有研究報(bào)道指出，lox基因的多態(tài)性與多種人類疾病存在關(guān)聯(lián)。lox基因具有眾多單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide?polymorphism,?snp）等位基因位點(diǎn)。這些snp廣泛分布于編碼區(qū)、非編碼區(qū)及基因間區(qū)，例如rs1800449、rs2956538和rs2979862等，每個(gè)位點(diǎn)的突變對(duì)lox蛋白的功能均產(chǎn)生不同的影響。鑒于位點(diǎn)變異對(duì)lox功能的影響，對(duì)其開展高效的檢測(cè)顯得尤其重要。

4、與其他基因分型方法相比，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerasechainreaction-restriction?fragment?length?polymorphism,?pcr-rflp）具有操作簡便、實(shí)驗(yàn)成本較低及適用于已知多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。然而，在lox基因g473a（rs1800449）位點(diǎn)的檢測(cè)中，現(xiàn)有pcr-rflp方法仍存在一定的局限性。例如現(xiàn)有技術(shù)（沈艷青.賴氨酰氧化酶基因多態(tài)性與肺癌和結(jié)直腸癌相關(guān)關(guān)系的研究[d].河北聯(lián)合大學(xué)，2015.）中使用pcr-rflp法對(duì)lox基因g473a進(jìn)行基因分型(該研究的基因分型采用的lox引物序列命名為44號(hào)，序列號(hào)為：lox-f44：5'-ttccaagctggctactcgac-3'?(seq?id?no.87)；lox-r44：5'-caggtctgggcctttcataa-3'?(seq?id?no.88))，存在兩種條帶的重疊，導(dǎo)致基因分型錯(cuò)誤率較高。另一現(xiàn)有技術(shù)（pichu?s?,?sathiyamoorthy?j?,?vimalraj?s?,et?al.impact?oflysyl?oxidase?(g473a)?polymorphism?on?diabetic?foot?ulcers[j].internationaljournal?of?biological?macromolecules,?2017,?103:242-247.doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.05.050）使用的引物特異性差，存在非特異性擴(kuò)增等問題，從而影響分型結(jié)果的可靠性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)lox基因多態(tài)性的引物和試劑盒及其應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效的lox基因g473a多態(tài)性檢測(cè)，并預(yù)測(cè)癲癇的易感性。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

3、一種引物在制備用于檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的試劑中的應(yīng)用，所述引物的序列如下：

4、lox-f31：5'-ccaagctggctactcgacat-3'（seq?id?no.61）；

5、lox-r31：5'-cttactcctcacccttcgcc-3'（seq?id?no.62）。

6、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)一種引物在制備預(yù)測(cè)癲癇易感性的試劑中的應(yīng)用，所述引物的序列如下：

7、lox-f31：5'-ccaagctggctactcgacat-3'（seq?id?no.61）；

8、lox-r31：5'-cttactcctcacccttcgcc-3'（seq?id?no.62）。

9、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)一種用于檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性或預(yù)測(cè)癲癇易感性的試劑盒，包括所述引物。

10、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，每份所述試劑盒中包括上游引物和下游引物各0.4μl。

11、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，每份所述試劑盒還包括2×?rapid?taq?master?mix5μl，ddh2o?3.45μl。

12、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶notⅰ。

13、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，每份所述試劑盒中包括限制性內(nèi)切酶notⅰ0.25μl。

14、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，每份所述試劑盒還包括10x?speedyone?buffer?1μl，nuclease-free?water?3.75μl。

15、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)所述試劑盒在制備用于檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性或預(yù)測(cè)癲癇易感性的試劑中的應(yīng)用。

16、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的試劑在制備預(yù)測(cè)癲癇易感性的試劑中的應(yīng)用。

17、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述lox基因g473a攜帶a等位基因型的個(gè)體癲癇易感性更高。

18、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的試劑為檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的引物。

19、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的引物的序列如下：

20、lox-f31：5'-ccaagctggctactcgacat-3'（seq?id?no.61）；

21、lox-r31：5'-cttactcctcacccttcgcc-3'（seq?id?no.62）。

22、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)一種非治療目的的檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的方法，包括以下步驟：

23、（1）提取樣品的基因組dna；

24、（2）以所述引物對(duì)樣品的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

25、（3）使用限制性內(nèi)切酶notⅰ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲取酶切產(chǎn)物；

26、（4）通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并判斷l(xiāng)ox基因g473a多態(tài)性。

27、通過瓊脂糖凝膠電泳，判斷l(xiāng)ox基因g473a的各基因型的標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)電泳后出現(xiàn)唯一條帶為aa基因型，兩個(gè)條帶為gg基因型，三個(gè)條帶為ga基因型。

28、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃?3min預(yù)變性；然后依次95℃15?sec變性，62℃?20?sec退火，72℃?25?sec延伸；共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃?7min再延伸，最終保持在4℃。

29、本發(fā)明公開了一種lox基因多態(tài)性的引物和試劑盒。該試劑盒中含有檢測(cè)lox基因g473a位點(diǎn)的引物和限制性內(nèi)切酶，所述引物能擴(kuò)增出包含lox基因g473a位點(diǎn)的基因序列。一種非治療目的的檢測(cè)lox基因g473a多態(tài)性的方法，包括以下步驟：提取人外周血的基因組dna；提供擴(kuò)增人lox基因g473a位點(diǎn)附近序列的正向和反向引物，以提取的待測(cè)人基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；使用限制性內(nèi)切酶對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，判斷l(xiāng)ox基因g473a的各基因型。

30、同時(shí)，本發(fā)明的引物采用pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳后即可進(jìn)行基因型的鑒定，在實(shí)際運(yùn)用中具有很大的靈活性，并且檢測(cè)方法簡單可行，是一種可行的單堿基突變位點(diǎn)基因型鑒定的方法。本發(fā)明提供的lox基因g473a位點(diǎn)多態(tài)性的方法提高了lox基因g473a分型準(zhǔn)確性，適用于對(duì)lox基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測(cè)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用pcr-rflp法可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行dna序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，具有高通量、低成本的特點(diǎn)，操作極為簡便，有助于后續(xù)在臨床上的順利推廣與運(yùn)用，有利于實(shí)現(xiàn)與lox基因g473a位點(diǎn)突變相關(guān)疾病的早期篩查、預(yù)防及評(píng)判疾病預(yù)后情況。