本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)，尤其涉及cbd磁珠富集聯(lián)合rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條的單增李斯特菌檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
1、單增李斯特菌(listeria?monocytogenes)是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧的食源性嗜冷致病菌，因其獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)性和高致病性特征，已成為全球食品安全及公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大威脅。該菌可通過(guò)污染乳制品、即食肉制品等食品引發(fā)李斯特菌病，導(dǎo)致敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及妊娠期胎兒感染等嚴(yán)重臨床癥狀。該菌在1～45℃的廣泛溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，尤其在4℃冷藏環(huán)境下仍可保持增殖能力的嗜冷特性，結(jié)合其顯著的生物膜形成能力，導(dǎo)致食品生產(chǎn)鏈中的污染控制難度顯著增加。因此，建立有效的單增李斯特菌檢測(cè)體系具有重要的公共衛(wèi)生意義。
2、目前，針對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)，傳統(tǒng)培養(yǎng)法是常用手段之一，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)達(dá)3～5天，且靈敏度有限。分子檢測(cè)技術(shù)中的實(shí)時(shí)熒光pcr雖提升了檢測(cè)靈敏度，卻存在依賴專業(yè)設(shè)備、檢測(cè)成本高昂的問(wèn)題。近年來(lái)，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinasepolymerase?amplification，rpa)的等溫?cái)U(kuò)增特性成功擺脫了傳統(tǒng)pcr對(duì)熱循環(huán)儀器的依賴，與量子點(diǎn)免疫層析(qd-lfa)協(xié)同構(gòu)建的技術(shù)體系展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物與免疫探針的偶聯(lián)效率，能將核酸擴(kuò)增及結(jié)果判讀全流程壓縮至30min內(nèi)，大幅突破傳統(tǒng)分子檢測(cè)技術(shù)的時(shí)間瓶頸，量子點(diǎn)熒光信號(hào)放大效應(yīng)還可使檢測(cè)靈敏度較常規(guī)膠體金法提升2個(gè)數(shù)量級(jí)。
3、然而，由于食品中食源性致病菌檢測(cè)面臨樣品基質(zhì)復(fù)雜、現(xiàn)有檢測(cè)方法靈敏度受限、痕量樣品易漏檢，以及傳統(tǒng)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備依賴性強(qiáng)等問(wèn)題，現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)仍難以滿足快速、準(zhǔn)確檢測(cè)單增李斯特菌的需求。為此，本發(fā)明提出cbd磁珠富集聯(lián)合rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條的單增李斯特菌檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供cbd磁珠富集聯(lián)合rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條的單增李斯特菌檢測(cè)方法，旨在解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。
2、本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
3、一種用于單增李斯特菌檢測(cè)的cbd118-500重組蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.1所示，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
4、一種重組表達(dá)載體，包含上述所述的cbd118-500重組蛋白編碼基因，且所述基因通過(guò)限制性內(nèi)切酶ndei和xhoi位點(diǎn)插入至原核表達(dá)載體pet28a(+)中，并保留載體上的his標(biāo)簽。
5、一種重組菌株，其特征在于，由上述所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)中獲得，用于表達(dá)cbd118-500重組蛋白。
6、一種cbd功能化磁珠，通過(guò)碳二亞胺法將上述所述的cbd118-500重組蛋白與羧基磁珠偶聯(lián)制備而成。
7、一種rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條，包括試紙條載體、包被有鏈霉親和素的t線、包被有羊抗鼠igg的c線、地高辛抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)熒光微球以及用于檢測(cè)單增李斯特菌的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物，所述rpa擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)生物素和地高辛雙標(biāo)記。
8、一種rpa擴(kuò)增引物對(duì)，其特征在于，其序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
9、一種單增李斯特菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
10、使用上述所述的cbd功能化磁珠富集樣品中的單增李斯特菌；
11、提取富集后的樣品dna；
12、使用上述所述的rpa擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行rpa擴(kuò)增；
13、將地高辛抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)熒光微球、rpa擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液混合，滴加至上述所述的rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條上進(jìn)行層析反應(yīng)，通過(guò)觀察t線和c線的熒光情況判斷樣品中是否含有單增李斯特菌。
14、一種單增李斯特菌檢測(cè)體系，結(jié)合上述所述的cbd功能化磁珠富集方法和上述所述的單增李斯特菌的檢測(cè)方法，用于食品樣品中單增李斯特菌的快速檢測(cè)。
15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
16、本發(fā)明成功建立了cbd磁珠富集聯(lián)合rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條的單增李斯特菌檢測(cè)體系。該體系通過(guò)表達(dá)具有高親和力的cbd118-500重組蛋白構(gòu)建功能化磁珠，能有效富集樣品中86.58％的目標(biāo)菌，結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)與量子點(diǎn)免疫層析(qd-lfa)技術(shù)后，在加標(biāo)肉樣中的檢測(cè)限低至9.1×100cfu/ml，較富集前降低約兩個(gè)數(shù)量級(jí)；對(duì)16份市售肉類食品樣本的檢測(cè)結(jié)果與pcr結(jié)果一致，在食品復(fù)雜基質(zhì)中可實(shí)現(xiàn)低容量富集、可視化快速判讀，為食源性李斯特菌現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)提供創(chuàng)新方案，其模塊化設(shè)計(jì)思路還可拓展到其他食源性病原體快速檢測(cè)領(lǐng)域，對(duì)完善食品安全防控網(wǎng)絡(luò)意義重大。
1.一種用于單增李斯特菌檢測(cè)的cbd118-500重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的cbd118-500重組蛋白編碼基因，且所述基因通過(guò)限制性內(nèi)切酶ndei和xhoi位點(diǎn)插入至原核表達(dá)載體pet28a(+)中，并保留載體上的his標(biāo)簽。
3.一種重組菌株，其特征在于，由權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)中獲得，用于表達(dá)cbd118-500重組蛋白。
4.一種cbd功能化磁珠，其特征在于，通過(guò)碳二亞胺法將權(quán)利要求1所述的cbd118-500重組蛋白與羧基磁珠偶聯(lián)制備而成。
5.一種rpa-量子點(diǎn)熒光試紙條，其特征在于，包括試紙條載體、包被有鏈霉親和素的t線、包被有羊抗鼠igg的c線、地高辛抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)熒光微球以及用于檢測(cè)單增李斯特菌的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物，所述rpa擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)生物素和地高辛雙標(biāo)記。
6.一種rpa擴(kuò)增引物對(duì)，其特征在于，其序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
7.一種單增李斯特菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.一種單增李斯特菌檢測(cè)體系，其特征在于，結(jié)合權(quán)利要求4所述的cbd功能化磁珠富集方法和權(quán)利要求7所述的單增李斯特菌的檢測(cè)方法，用于食品樣品中單增李斯特菌的快速檢測(cè)。