本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)，其包含用于介導(dǎo)細(xì)胞靶向的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，它們組合在一起，使得所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)鄰近細(xì)胞毒性蛋白的氨基端。本發(fā)明的蛋白具有例如用于選擇性殺傷特定細(xì)胞類型、將外源物質(zhì)遞送到靶細(xì)胞內(nèi)部、標(biāo)記靶細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室和作為治療分子用于治療多種疾病、病癥和病患(包括癌癥、腫瘤、免疫病癥和微生物感染)的應(yīng)用。

背景

從毒素研發(fā)有效用作治療劑的合成的融合蛋白幾十年來挑戰(zhàn)著科學(xué)家(Pastan I，等，Annu Rev Med 58：221-37(2007))。一個障礙是來源于細(xì)菌和植物毒素的合成的細(xì)胞毒性蛋白的酶促毒性結(jié)構(gòu)部分必須達(dá)到其細(xì)胞溶膠內(nèi)的靶標(biāo)底物才能殺傷細(xì)胞。對于多種重組細(xì)胞毒性蛋白，細(xì)胞毒性的功效取決于細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送的分子效率(Pirie C等，J Biol Chem 286：4165-72(2011))；然而，對毒素怎樣指導(dǎo)其自身從內(nèi)體到細(xì)胞溶膠的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的理解仍是科學(xué)探究的挑戰(zhàn)(Antignani A，F(xiàn)itzgerald D，Toxins 5：1486-502(2013))。

多種蛋白包含稱為結(jié)構(gòu)域的保守的多肽序列，其形成蛋白結(jié)構(gòu)自我包含的折疊單位，所述折疊單位能夠獨(dú)立于完整蛋白或在重組成直向同源蛋白時行使功能(Kirshner M，Gerhart J，Proc Natl Acad Sci USA 95：8420-7(1988))。在產(chǎn)生新型蛋白時，使用模塊式蛋白結(jié)構(gòu)域提供幾乎無限的可能性(Nixon A等，Proc Natl Acad Sci USA.94：1069-73(1997))。一種可能性是由靶向性結(jié)構(gòu)域和蛋白毒素結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的嵌合分子的分子改造。已經(jīng)將天然存在的毒素或截短的毒素片段通過化學(xué)綴合或重組蛋白工程技術(shù)連接或融合到免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或受體配體上，以希望產(chǎn)生細(xì)胞靶向性治療劑分子(Moolten F，Cooperband S，Science 169：68-70(1970)；Thorpe P等，Nature 271：752-5(1978)；Krolick K等，Proc Natl Acad Sci USA 77：5419-23(1980)；Krolick K等，Cancer Immunol Immunother 12：39-41(1981)；Blythman H等，Nature 290：145-46(1981)；Chaudhary V等，Nature 339：394-7(1989)；Strom T等，Semin Immunol 2：467-79(1990)；Pastan I等，Annu Rev Biochem 61：331-54(1992)；Foss F等，Curr Top Microbiol Immunol 234：63-81(1998))。所述分子改造的一個目的是設(shè)計具有下述雙重功能的嵌合分子：1)在系統(tǒng)性施用后，將毒素遞送至生物體內(nèi)的特定細(xì)胞類型或位置；和2)利用在真核細(xì)胞中有效的強(qiáng)細(xì)胞毒性機(jī)制實(shí)現(xiàn)針對特定細(xì)胞的靶向細(xì)胞毒性。

志賀毒素家族相關(guān)的蛋白毒素，即，從痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)和大腸桿菌(E.coli)分離的毒素，由多種天然存在的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的毒素構(gòu)成(Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。例如，志賀毒素家族包括從痢疾志賀氏菌血清型1分離的真正志賀毒素(Stx)、從腸出血性大腸桿菌的血清型分離的志賀樣毒素1變體(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)以及從腸出血性大腸桿菌的血清型分離的志賀樣毒素2變體(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1與Stx僅有一個殘基不同，并且二者被稱為維羅細(xì)胞毒素(Verocytotoxins)或維羅毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien A等，Curr Top Microbiol Immunol 180：65-94(1992))。志賀毒素家族的成員共有相同的整體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制(Engedal N等，Microbial Biotech 4：32-46(2011))。例如，Stx、SLT-1和SLT-2在不含細(xì)胞的系統(tǒng)中表現(xiàn)出不可區(qū)分的酶活性(Head S等，J Biol Chem 266：3617-21(1991)；Tesh V等，Infect Immun 61：3392-402(1993)；Brigotti M等，Toxicon 35：1431-1437(1997))。志賀毒素家族成員包含優(yōu)先結(jié)合某些宿主細(xì)胞表面上存在的特定的鞘糖脂的靶向性結(jié)構(gòu)域和在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后能夠使核糖體永久失活的酶結(jié)構(gòu)域(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。

在感染宿主過程中，志賀毒素家族的成員被細(xì)菌用作毒力因子(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。在被感染的宿主中，由于毒素有效的抑制蛋白合成和促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡的能力，志賀毒素是細(xì)胞毒性的(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。志賀毒素對宿主細(xì)胞的有效的細(xì)胞毒性作用可以導(dǎo)致出血性大腸炎和溶血性尿毒性綜合征(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。

志賀毒素家族的成員共有以志賀蛋白亞基的A(B)₅排列為特征的相同的、多中心的蛋白結(jié)構(gòu)(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。每種志賀毒素由兩種蛋白亞基A和B組成，其以A(B)₅排列結(jié)合形成全毒素蛋白復(fù)合物。志賀毒素A亞基是32KD的包含酶結(jié)構(gòu)域的單體，志賀毒素B亞基是7.7KD的亞基，其與另外四個志賀毒素B亞基結(jié)合形成志賀毒素B亞基的五聚體。B亞基的五聚體與一個A亞基結(jié)合形成志賀全毒素，其約為70KD(O’Brien A，Holmes，R，Microbiol Rev 51：206-20(1987))。

志賀毒素家族的成員共有使宿主細(xì)胞中毒的相同的過程，其可以分成五個主要的階段：細(xì)胞表面結(jié)合，胞吞，倒退的亞細(xì)胞運(yùn)動到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到細(xì)胞溶膠，和在細(xì)胞溶膠中酶失活核糖體。第一，通過B亞基特異性結(jié)合外質(zhì)膜小葉上存在的鞘糖脂球形三脂?；拾按糋b3(也稱為CD77)的能力而將志賀全毒素引導(dǎo)至特定宿主細(xì)胞的細(xì)胞表面(Ling，H等，Biochemistry 37：1777-88(1998)；Thorpe C等，Infect Immun 67：5985-93(1999)；Soltyk A等，J Biol Chem 277：5351-59(2002))。第二，志賀全毒素利用宿主細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入到該宿主細(xì)胞中，在其中，該全毒素開始被包含在內(nèi)體中(Sandvig K等，J Cell Biol 108：1331-43(1989)；Sandvig K等，Histochem Cell Biol 117：131-141(2002))。第三，志賀全毒素利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并且獲得進(jìn)入細(xì)胞溶膠的通路(Nichols B等，J Cell Biol 153：529-41(2001)；Lauvrak S等，J Cell Sci 117：2321-31(2004)；Saint-Pol A等，Dev.Cell 6：525-38(2004))。第四，志賀全毒素的酶活性片段從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔逆移位到細(xì)胞溶膠中(Yu M，Haslam D，Infect Immun 73：2524-32(2005)；LaPointe P等，J Biol Chem 280：23310-18(2005)；Falguieres T，Johannes L，Biol Cell 98：125-34(2006)；Tam P，Lingwood C，Microbiology 153：2700-10(2007))。第五，志賀毒素酶活性片段的細(xì)胞溶膠級分通過使宿主細(xì)胞的核糖體失活而引起細(xì)胞毒性(Tam，Microbiology 153：2700-10(2007))。

在志賀毒素中毒過程中，志賀毒素A亞基在保守的精氨酸殘基和甲硫氨酸殘基之間(例如，在StxA和SLT-1A中的Arg251-Met252)被弗林蛋白酶(宿主細(xì)胞的內(nèi)切蛋白酶)蛋白水解切割(等，JBiol Chem 270：10817-21(1995))。弗林蛋白酶切割的志賀毒素A亞基的氨基端片段稱為志賀毒素“A1片段”(或Stxn-A1，SLTn-A1，SLT-nA1)。志賀毒素A1片段是包含志賀毒素的催化結(jié)構(gòu)域的28KD的蛋白(Fraser M等，Nat Struct Biol 1：59-64(1994))。志賀毒素針對宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性機(jī)制主要是通過A1片段對真核核糖體有效的催化滅活和對蛋白合成的細(xì)胞范圍的抑制作用(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。

志賀毒素A1片段通過其對真核核糖體的28S核糖體RNA的α-sarcin-蓖麻毒蛋白環(huán)中位置4,324的通用保守腺嘌呤核堿基的有效的去嘌呤活性而抑制蛋白翻譯(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。在閾值數(shù)量的核糖體被失活后，預(yù)測宿主細(xì)胞經(jīng)歷充分的蛋白合成減少，從而通過凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(Iordanov M等，Mol Cell Biol 17：3373-81(1997)；Smith W等，Infect Immun 71：1497-504(2003)；Lee S等，Cell Microbiol 10：770-80(2008)；Tesh V，F(xiàn)uture Microbiol 5：431-53(2010))。

使核糖體失活的A-B毒素可以以約1,500個核糖體/分鐘的速度在同一個細(xì)胞內(nèi)一個接一個地永久破壞核糖體(Endo Y，Tsurugi K，Eur J Biochem 171：45-50(1988)；Endo Y等，J Biol Chem 263：8735-9(1988))。據(jù)報道，A-B毒素的功效是極高的，以致少至一個毒素分子就能夠殺死細(xì)胞(Yamaizumi M等，Cell 15：245-50(1978)；Antignani，毒素5：1486-502(2013))。相信單個A-B毒素分子可以在35分鐘內(nèi)不可逆地使300個核糖體失活，并且足以殺死癌細(xì)胞(Weldon J，Pastan I，F(xiàn)EBS Journal 278：4683-700(2011))。對志賀毒素A亞基進(jìn)一步預(yù)測該水平的細(xì)胞毒性功效，對其已經(jīng)表明移位到細(xì)胞溶膠內(nèi)的一個分子將足以殺死細(xì)胞(Tam，Microbiology 153：2700-10(2007))。

預(yù)測志賀毒素家族的全毒素對于作為治療劑的非靶向應(yīng)用毒性太高(Jain，R，Tumor physiology and antibody delivery，F(xiàn)ront Radiat Ther Oncol 24：32-46(1990))。然而，志賀毒素家族的成員具有通過合理的改變毒素結(jié)構(gòu)、特征和生物學(xué)活性而被合成改造用于治療應(yīng)用的潛力(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010)；Engedal，Microbiαl Biotech 4：32-46(2011))。志賀全毒素具有由兩個非共價連接的模塊部分構(gòu)成的二分結(jié)構(gòu)(bipartite structure)：包含酶活性A1片段的A結(jié)構(gòu)部分和包含針對細(xì)胞表面靶標(biāo)Gb3的結(jié)合位點(diǎn)的B結(jié)構(gòu)部分。由于志賀毒素亞基是模塊式的，已經(jīng)假定可以基于A和B結(jié)構(gòu)部分的分開的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生治療組合物(美國申請20090156417A1；Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010)；Engedal，Microbial Biotech 4：32-46(2011)；E.P.application 2402367 A1；U.S.application 20130196928 A1，其通過引用完全結(jié)合在本文中)。

志賀毒素家族成員的A結(jié)構(gòu)部分是穩(wěn)定的、酶活性的和細(xì)胞毒性的，其獨(dú)立于任何B結(jié)構(gòu)部分(Engedal，Microbial Biotech 4：32-46(2011))。志賀毒素1A亞基即使在截短或融合到其他蛋白結(jié)構(gòu)域上時也是催化活性的，能夠在體外酶失活核糖體，并且是細(xì)胞毒性的(Haddad J等，J Bacteriol 175：4970-8(1993)；Al-Jaufy A等，Infect Immun 62：956-60(1994)；Al-Jaufy A等，Infect Immun 63：3073-8(1995)；LaPointe P等，J Biol Chem 280：23310-18(2005)；Di R等，Toxicon 57：535-39(2011))。志賀樣毒素1A亞基截短在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時是催化活性的，能夠在體外酶促失活核糖體，并且是細(xì)胞毒性的(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。

將毒素連接到靶向性結(jié)構(gòu)域以制得選擇性殺死癌細(xì)胞的嵌合分子的想法不是新的(Strebhardt K，Ullrich A，Nat Rev Cancer 8：473-80(2008))。例如，自20試劑70年代以來，已經(jīng)使用下述三種主要的毒素候選物研發(fā)了免疫毒素：細(xì)菌白喉毒素，細(xì)菌假單胞菌(Pseudomonas)外毒素和以蓖麻毒蛋白示例的植物毒素(Antignani，Toxins 5：1486-502(2013))。然而，至2013年，這三種毒素仍然是“免疫毒素研發(fā)的首要選擇(Antignani，Toxins 5：1486-502(2013))。迄今為止，還沒有人描述能夠特異性和選擇性殺傷被靶向的細(xì)胞型的包含與細(xì)胞靶向性免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)組合的來源于志賀毒素的氨基酸序列的細(xì)胞毒性蛋白。

志賀毒素構(gòu)建體的細(xì)胞毒素功效取決于其到達(dá)細(xì)胞溶膠的有效性(Tam，Microbiology 153：2700-10(2007))；然而，目前對毒素按路線運(yùn)送到細(xì)胞溶膠的分子機(jī)制的了解仍然是科學(xué)探究的挑戰(zhàn)(Antignani，Toxins 5：1486-502(2013))。具有包含志賀毒素亞基A來源的區(qū)域的細(xì)胞靶向性細(xì)胞毒性蛋白是合乎需要的，所述志賀毒素亞基A來源的區(qū)域自我指導(dǎo)其自身的細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送，并且展現(xiàn)有效的細(xì)胞毒性，用于涉及特定細(xì)胞型的靶向性殺傷的應(yīng)用和用作治療多種疾病的治療劑，所述疾病諸如例如癌癥、腫瘤、免疫病癥和微生物感染。因此，在本領(lǐng)域中，仍然需要改造細(xì)胞毒性蛋白的方式，所述細(xì)胞毒性蛋白包含在被連接到用于細(xì)胞靶向的異源多肽結(jié)合區(qū)后保留效應(yīng)子功能(諸如自我指導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送和細(xì)胞毒性)的志賀毒素亞基A來源的區(qū)域。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供多種包含下述的蛋白：1)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，諸如來自免疫球蛋白的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，和2)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，諸如來自SLT1A的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)與志賀毒素亞基A來源的多肽區(qū)的連接能夠允許改造志賀毒素細(xì)胞毒性的細(xì)胞型特異性靶向，并且當(dāng)組合這兩個區(qū)域使得所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)相對于志賀毒素區(qū)不鄰近蛋白的氨基端時，細(xì)胞毒性最高。本發(fā)明的蛋白具有下述應(yīng)用，例如，用于靶向性細(xì)胞殺傷，遞送外源物質(zhì)，作為診斷劑，和作為治療多種疾病、病癥和病患(包括癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥和微生物感染)的治療劑分子。

本發(fā)明的蛋白包含：(a)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其包含一個或多個多肽并且能夠特異性結(jié)合至少一種細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子，和(b)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其包含來源于志賀毒素家族至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽；其中所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)在細(xì)胞毒性蛋白內(nèi)物理排列或定向，使得所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的氨基端。

本發(fā)明的蛋白包含：(a)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其包含一個或多個多肽并且能夠特異性結(jié)合至少一種細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子，和(b)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其包含來源于志賀毒素家族至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽；其中所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)在細(xì)胞毒性蛋白內(nèi)物理排列或定向，使得所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)相對于所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)不鄰近蛋白的氨基端。

在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含：(a)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其包含一個或多個多肽并且能夠特異性結(jié)合至少一種細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子，和(b)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其包含來源于志賀毒素家族至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽；其中所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)在細(xì)胞毒性蛋白內(nèi)物理排列或定向，使得所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)鄰近蛋白的氨基端。

對于本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)包含選自由下述組成的組的多肽：免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)(sdAb)片段，納米抗體，從駱駝科動物(camelid)來源的重鏈抗體結(jié)構(gòu)域(V_HH片段)，從軟骨魚(cartilaginous fish)來源的重鏈抗體結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白新抗原受體(IgNARs)，V_NAR片段，單鏈可變片段(scFv)，抗體可變片段(Fv)，互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)片段，受限的FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽，F(xiàn)d片段，小模塊免疫藥物(SMIP)結(jié)構(gòu)域，抗原結(jié)合片段(Fab)，纖維連接蛋白-來源的第10個纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域(10Fn3)(例如單抗體(monobody))，生腱蛋白III型結(jié)構(gòu)域(例如TNfn3)，錨蛋白重復(fù)基序結(jié)構(gòu)域(ARD)，低密度脂蛋白受體來源的A-結(jié)構(gòu)域(LDLR的A結(jié)構(gòu)域或LDLR-A)，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(anticalins)，Kunitz結(jié)構(gòu)域，蛋白-A-來源的Z結(jié)構(gòu)域，γ-B結(jié)晶-來源的結(jié)構(gòu)域，泛蛋白-來源的結(jié)構(gòu)域，Sac7d-來源的多肽(affitins)，F(xiàn)yn-來源的SH2結(jié)構(gòu)域，小蛋白(miniprotein)，C-型凝集素-樣結(jié)構(gòu)域支架，經(jīng)工程改造的抗體模擬物，以及任何前述物質(zhì)的保留結(jié)合功能性的任何遺傳操作的對應(yīng)物。

對于某些實(shí)施方案，當(dāng)將本發(fā)明的蛋白施用給與所述蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞時，所述蛋白能夠引起該細(xì)胞的死亡。在某些其他實(shí)施方案中，當(dāng)將本發(fā)明的蛋白施用給相對于細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的存在或水平不同的兩種不同的細(xì)胞類型群體時，所述蛋白能夠以比針對沒有與所述蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞類型的CD₅₀至少三倍或更小的CD₅₀引起與所述細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的細(xì)胞死亡。對于某些實(shí)施方案，當(dāng)將本發(fā)明的蛋白施用給其成員與所述蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的第一細(xì)胞群體和其成員不與結(jié)合區(qū)的任何細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的第二細(xì)胞群體時，相對于所述第二細(xì)胞群體的成員，細(xì)胞靶向性分子針對所述第一細(xì)胞群體的成員的細(xì)胞毒性作用至少3倍高。對于某些實(shí)施方案，當(dāng)將本發(fā)明的蛋白施用給其成員與顯著量的所述蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的第一細(xì)胞群體和其成員不與顯著量的結(jié)合區(qū)的任何細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的第二細(xì)胞群體時，相對于所述第二細(xì)胞群體的成員，細(xì)胞靶向性分子針對所述第一細(xì)胞群體的成員的細(xì)胞毒性作用至少3倍高。對于某些實(shí)施方案，當(dāng)將本發(fā)明的蛋白施用給第一靶標(biāo)生物分子陽性細(xì)胞群體和其成員不在細(xì)胞表面上表達(dá)顯著量的所述蛋白結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子的第二細(xì)胞群體時，相對于所述第二細(xì)胞群體的成員，細(xì)胞靶向性分子針對所述第一細(xì)胞群體的成員的細(xì)胞毒性作用至少3倍高。

在某些實(shí)施方案中，設(shè)計或選擇所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子結(jié)合的能力，所述細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子選自由下述組成的組：CD20，CD22，CD40，CD74，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAM，EphB2，前列腺特異性的膜抗原，Cripto，CDCP1，內(nèi)皮糖蛋白，成纖維細(xì)胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體(ROR1或NTRKR1)，碳酸酐酶IX，葉酸結(jié)合蛋白，神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3，神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，神經(jīng)節(jié)苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANK，F(xiàn)AP，生腱蛋白，CD64，間皮素(mesothelin)，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-聯(lián)蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特異性抗原，前列腺干細(xì)胞抗原，人天冬氨?；?天冬酰胺?；?β-羥化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相關(guān)的抗原，HPV-E7，EB病毒(Epstein-Barr virus)抗原，Bcr-Abl，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱腫瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305；C3AR，F(xiàn)ceRIa，半乳凝集素-9，mrp-14，程序性死亡-配體1(PD-L1)，siglec-8，siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，CD193，TLR4，F(xiàn)ceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD15，CD33，CD64，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F(xiàn)4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，I類MHC分子(任選地與肽復(fù)合)，II類MHC分子(任選地與肽復(fù)合)，CD284-TLR4，CD107-Mac3，CD195-CCR5，HLA-DR，CD16/32，CD282-TLR2，CD11c，CD123，以及前述任一種的任意免疫原性片段。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含來源于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含來源于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。在某些其他實(shí)施方案中，所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251。在某些其他實(shí)施方案中，所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含羧基端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留/回收信號基序(carboxy-terminal endoplasmic reticulum retention/retrieval signal motif)。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白保安選自由下述組成的組的羧基端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留/回收信號基序：KDEL，HDEF，HDEL，RDEF，RDEL，WDEL，YDEL，HEEF，HEEL，KEEL，REEL，KAEL，KCEL，KFEL，KGEL，KHEL，KLEL，KNEL，KQEL，KREL，KSEL，KVEL，KWEL，KYEL，KEDL，KIEL，DKEL，F(xiàn)DEL，KDEF，KKEL，HADL，HAEL，HIEL，HNEL，HTEL，KTEL，HVEL，NDEL，QDEL，REDL，RNEL，RTDL，RTEL，SDEL，TDEL，SKEL，STEL，和EDEL。

在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含含有SEQ ID NOs：4-19中任一種的氨基酸269-508或基本上由SEQ ID NOs：4-19中任一種的氨基酸269-508組成的結(jié)合區(qū)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含SEQ ID NOs：4-31中任一項(xiàng)所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs：4-31中任一項(xiàng)所示的多肽組成。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含這樣的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，相對于志賀毒素家族成員的天然存在的A亞基，其包含改變志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的酶活性的突變。在某些其他實(shí)施方案中，所述突變選自至少一個氨基酸殘基缺失、插入或置換，其降低或消除所述志賀毒素區(qū)的細(xì)胞毒性。在某些其他實(shí)施方案中，所述蛋白包含降低或消除催化活性但是保留其他志賀毒素效應(yīng)子功能(諸如例如，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化和/或指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送)的突變。在某些實(shí)施方案中，所述突變選自至少一個氨基酸殘基置換，諸如，例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的A231E，R75A，Y77S，Y114S，E167D，R170A，R176K和/或W203A。

本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的蛋白和至少一種藥用賦形劑或載體的藥物組合物；和所述蛋白或包含其的組合物在本文進(jìn)一步所述的本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，是包含任意本發(fā)明的蛋白和至少一種藥用賦形劑或載體的藥物組合物。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，是包含本發(fā)明的蛋白的診斷組合物，其還包含用于收集信息(諸如診斷上有用的關(guān)于細(xì)胞類型、組織、器官、疾病、病癥、狀況和/或患者的信息)的檢測促進(jìn)劑。

除了本發(fā)明的蛋白和組合物以外，能夠編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸也在本發(fā)明范圍內(nèi)，以及包含本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體和包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可以用在例如通過重組表達(dá)生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或其多肽組分或片段的方法中。

本發(fā)明還包括給蛋白賦予改善的細(xì)胞毒性的系統(tǒng)，所述蛋白包含：(a)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其包含一個或多個多肽并且能夠特異性結(jié)合至少一種胞外靶標(biāo)生物分子，和(b)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其包含來源于志賀毒素家族至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽；所述系統(tǒng)包括在所述蛋白內(nèi)使所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)鄰近所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的羧基端排列的步驟。本發(fā)明還包括用于給蛋白賦予改善的細(xì)胞毒性的系統(tǒng)，所述蛋白包含：(a)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其包含一個或多個多肽并且能夠特異性結(jié)合至少一種胞外靶標(biāo)生物分子，和(b)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其包含來源于志賀毒素家族至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽；所述系統(tǒng)包括相對于所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)將所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)鄰近蛋白的羧基端排列的步驟。本發(fā)明還包括用于給蛋白賦予改善的細(xì)胞毒性的系統(tǒng)，所述蛋白包含：(a)免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其包含一個或多個多肽并且能夠特異性結(jié)合至少一種胞外靶標(biāo)生物分子，和(b)志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其包含來源于志賀毒素家族至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽；所述系統(tǒng)包括將所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)鄰近蛋白的氨基端排列的步驟。

另外，本發(fā)明提供殺傷細(xì)胞的方法，所述方法包括使細(xì)胞與本發(fā)明的蛋白或包含本發(fā)明的蛋白的藥物組合物接觸的步驟。在某些實(shí)施方案中，所述接觸細(xì)胞的步驟在體外發(fā)生。在某些其他實(shí)施方案中，接觸細(xì)胞的步驟在體內(nèi)發(fā)生。在細(xì)胞殺傷方法的其他實(shí)施方案中，當(dāng)接觸關(guān)于蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞外存在和/或表達(dá)水平不同的細(xì)胞混合物時，所述方法能夠比其他細(xì)胞和/或細(xì)胞型優(yōu)先選擇性殺傷細(xì)胞和/或細(xì)胞型。

本發(fā)明還提供治療患者中的疾病、病癥和/或病患的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的蛋白或藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法治療的疾病、病癥或病患選自：癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥或微生物感染。在這些方法的某些實(shí)施方案中，要治療的癌癥選自由下述組成的組：骨癌、乳腺癌、中樞/周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、胃腸癌、生殖細(xì)胞癌、腺癌、頭頸癌、血液學(xué)癌癥、腎-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮膚癌和子宮癌。在這些方法的某些實(shí)施方案中，要治療的免疫病癥是與選自由以下組成的組的疾病有關(guān)的免疫病癥：淀粉樣變性(amyloidosis)、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘、克羅恩病(Crohn’s disease)、糖尿病、移植排斥(graft reiection)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒性綜合征(hemolytic uremic syndrome)、HIV-相關(guān)的疾病、紅斑狼瘡(lupus erythematosus)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎(polyarteritis nodosa)、多關(guān)節(jié)炎(polyarthritis)、銀屑病(psoriasis)、銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、膿毒性休克(septic shock)、舍格倫綜合征(Siorgren’s syndrome)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)和血管炎(vasculitis)。

本發(fā)明的任意組合物用于治療或預(yù)防癌癥、腫瘤、生長異常和/或免疫病癥的應(yīng)用在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是本發(fā)明的蛋白和/或其藥物組合物用于治療或預(yù)防癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥和/或微生物感染。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是本發(fā)明的蛋白和/或其藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥或微生物感染的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案可以用于將另外的外源物質(zhì)遞送進(jìn)與本發(fā)明的蛋白的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞中。另外，本發(fā)明提供了一種用于將外源物質(zhì)遞送至細(xì)胞內(nèi)部的方法，所述方法包括使體外或體內(nèi)細(xì)胞與本發(fā)明的蛋白、藥物組合物和/或診斷組合物接觸。本發(fā)明還提供了一種用于將外源物質(zhì)遞送至患者中的細(xì)胞內(nèi)部的方法，所述方法包括下述步驟：給所述患者施用本發(fā)明的蛋白(具有或不具有細(xì)胞毒性活性)，其中所述靶細(xì)胞與所述蛋白的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接。

本發(fā)明的任意組合物用于診斷、預(yù)后和/或表征疾病、病癥和/或病患的應(yīng)用在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是使用包含檢測促進(jìn)劑的本發(fā)明的蛋白和/或本發(fā)明的組合物(例如，診斷組合物)收集疾病、病癥或病患的診斷、預(yù)后或表征有用的信息的方法。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是使用本發(fā)明的蛋白和/或診斷組合物檢測細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟：使細(xì)胞與蛋白和/或診斷組合物接觸，并且檢測所述細(xì)胞靶向性分子和/或診斷組合物的存在。在某些實(shí)施方案中，所述接觸細(xì)胞的步驟在體外發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，接觸細(xì)胞的步驟在體內(nèi)發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，所述檢測細(xì)胞的步驟發(fā)生在體外。在某些實(shí)施方案中，所述檢測細(xì)胞的步驟發(fā)生在體內(nèi)。在某些其他實(shí)施方案中，所述方法包括在將所述蛋白施用給生物體后使用一種或多種成像方法檢測所述蛋白在所述生物體中的位置。例如，摻和了本文所述的檢測促進(jìn)劑的本發(fā)明的蛋白可以用于表征潛在可用本發(fā)明的藥物組合物治療的疾病。例如，本發(fā)明的某些化合物(例如蛋白)、本發(fā)明的組合物(例如，藥物組合物和診斷組合物)和本發(fā)明的方法可以用于確定患者是否屬于響應(yīng)本發(fā)明的藥物組合物的組。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是試劑盒，其包括本發(fā)明的物質(zhì)的組合物，以及任選地，使用說明書，另外的試劑，和/或藥物遞送裝置。

參考以下描述、所附權(quán)利要求和附圖，會更好地理解本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的前述要素可以單個地組合或自由地除去以便形成本發(fā)明的其它實(shí)施方案，在下文中沒有反對這樣的組合或除去的任何陳述。

附圖簡要說明

圖1顯示本發(fā)明的蛋白的一般排列，“N”和“C”分別表示蛋白或包含志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的蛋白的多肽組分的氨基端和羧基端。

圖2圖示與相反方向的αCD38scFv：：SLT-1A相比展現(xiàn)改善的細(xì)胞毒性的SLT-1A：：αCD38scFv。細(xì)胞的存活性百分?jǐn)?shù)相對于細(xì)胞毒性蛋白濃度的基于10的對數(shù)繪圖。

圖3圖示與相反方向的蛋白αHER2scFv：：SLT-1A相比，蛋白SLT-1A：：αHER2scFv改善的靶細(xì)胞型特異性細(xì)胞毒性。細(xì)胞的存活性百分?jǐn)?shù)相對于細(xì)胞毒性蛋白濃度的基于10的對數(shù)繪圖。

圖4顯示αHER2scFv：：SLT-1A和SLT-1A：：αtHER2scFv的亞細(xì)胞定位的顯微鏡圖片。該圖片顯示兩種細(xì)胞毒性蛋白在施用一小時內(nèi)進(jìn)入靶細(xì)胞。

詳述

在下文中使用示例性的、非限制性的實(shí)施方案和參照附圖更充分地描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式實(shí)施，并且不應(yīng)被理解為限于下面闡述的實(shí)施方案。相反，提供這些實(shí)施方案使得本公開內(nèi)容更透徹并且將本發(fā)明的范圍傳遞給本領(lǐng)域技術(shù)人員。

為了可以更容易地理解本發(fā)明，在下面定義某些術(shù)語。在發(fā)明詳述內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)另外的定義。

如在說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，除非上下文另外清楚地指明，術(shù)語“一個”、“一種”和“所述”包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指示物。

如在說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，當(dāng)提及兩種物質(zhì)A和B時，術(shù)語“和/或”是指A和B中的至少一種。如在說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，當(dāng)提及超過兩種物質(zhì)諸如A、B和C時，術(shù)語“和/或”是指A、B、或C中的至少一種，或A、B、或C的任何組合中的至少一種(每種物質(zhì)以單個或多個可能性存在)。

貫穿本說明書，詞語“包含”或變體諸如“包括”或“含有”應(yīng)理解為暗示包括所述的整數(shù)(或組分)或整數(shù)(或組分)的組，但是不排除任何其它整數(shù)(或組分)或整數(shù)(或組分)的組。

貫穿本說明書，術(shù)語“包括”用于指“包括、但不限于”?！鞍ā焙汀鞍?、但不限于”互換使用。

術(shù)語“氨基酸殘基”或“氨基酸”包括對結(jié)合到蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。術(shù)語“多肽”包括氨基酸或氨基酸殘基的任何聚合物。術(shù)語“多肽序列”表示在物理上構(gòu)成多肽的一系列氨基酸或氨基酸殘基?！暗鞍住笔前粋€或多個多肽或多肽“鏈”的大分子?！半摹笔浅叽缧∮诳傆?5-20個氨基酸殘基的小多肽。術(shù)語“氨基酸序列”表示在物理上構(gòu)成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸殘基，取決于長度。除非另有說明，本文中公開的多肽和蛋白序列從左至右書寫，代表它們從氨基端至羧基端的次序。

術(shù)語“氨基酸”、“氨基酸殘基”、“氨基酸序列”或“多肽序列”包括天然存在的氨基酸(包括L和D異構(gòu)體(isosteriomers))，且除非另有限制，也包括可以以與天然存在的氨基酸類似方式起作用的天然氨基酸的已知類似物，諸如硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、羥脯氨酸羥丁賴氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的簡寫名稱描述在本文中提及的氨基酸：

表A.氨基酸命名法

關(guān)于多肽的短語“保守置換”表示多肽的氨基酸組成的變化，所述變化不會實(shí)質(zhì)上改變整體多肽的功能和結(jié)構(gòu)(參見Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，New York(第2版，1992))。

本文中使用的術(shù)語“表達(dá)”(“expressed，”“expressing，”或“expresses，”)及其語法變體表示多核苷酸或核酸翻譯成多肽或蛋白。表達(dá)的多肽或蛋白可以保留在細(xì)胞內(nèi)，變成細(xì)胞表面膜的組分，或者被分泌進(jìn)細(xì)胞外空間中。

用于本文時，在至少一個細(xì)胞表面表達(dá)顯著量的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞是“靶標(biāo)陽性細(xì)胞”或“靶標(biāo)+細(xì)胞”，并且是與指定的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞。

本文中使用的符號“α”是能夠與該符號后的生物分子結(jié)合的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的簡寫。符號“α”用于表示免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的功能特性，這基于它與該符號后的生物分子結(jié)合的能力。

符號“：：”是指在它前面和后面的多肽區(qū)域物理地連接在一起以形成連續(xù)多肽。

關(guān)于細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞毒性活性的術(shù)語“選擇性的細(xì)胞毒性”是指在被靶向的細(xì)胞群體和未被靶向的旁觀(bystander)細(xì)胞群體之間細(xì)胞毒性的相對水平，其可以表示為針對被靶向的細(xì)胞型的半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)與針對未被靶向的細(xì)胞型的CD₅₀的比率，以顯示對被靶向的細(xì)胞型的細(xì)胞殺傷的優(yōu)先性。

就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“效應(yīng)子”是指提供生物活性，諸如細(xì)胞毒性、生物信號傳導(dǎo)、酶促催化、亞細(xì)胞按路線發(fā)送(subcellular routing)、和/或?qū)е乱环N或多種因子的募集的分子間結(jié)合、和/或變構(gòu)效應(yīng)。

就本發(fā)明的目的而言，短語“來源于”是指，所述多肽區(qū)域包含最初在蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，且其現(xiàn)在可能包含由原始序列的添加、缺失、截短或其它改變，使得總功能和結(jié)構(gòu)是基本上保守的。

就本發(fā)明的目的而言，志賀毒素效應(yīng)子功能是由來源于志賀毒素A亞基的多肽區(qū)賦予的生物活性。志賀毒素效應(yīng)子功能的非限制性實(shí)例包括細(xì)胞內(nèi)化、亞細(xì)胞按路線發(fā)送、催化活性和細(xì)胞毒性。志賀毒素催化活性包括，例如，核糖體失活、蛋白合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸：腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。RIPs可以使核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和polyA)和病毒核酸去嘌呤化(depurinate)(Barbieri L等，Biochem J 286：1-4(1992)；Barbieri L等，Nature 372：624(1994)；Ling J等，F(xiàn)EBS Lett 345：143-6(1994)；Barbieri L等，Biochem J 319：507-13(1996)；Roncuzzi L，Gasperi-Campani A，F(xiàn)EBS Lett 392：16-20(1996)；Stirpe F等，F(xiàn)EBS Lett 382：309-12(1996)；Barbieri L等，Nucleic Acids Res 25：518-22(1997)；Wang P，Tumer N，Nucleic Acids Res 27：1900-5(1999)；Barbieri L等，Biochim Biophys Acta 1480：258-66(2000)；Barbieri L等，J Biochem 128：883-9(2000)；Bagga S等，J Biol Chem 278：4813-20(2003)；Picard D等，J Biol Chem 280：20069-75(2005))。一些RIPs表現(xiàn)出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等，Antimicrob Agents Chemother 37：835-8(1993)；Au T等，F(xiàn)EBS Lett 471：169-72(2000)；Parikh B，Tumer N，Mini Rev Med Chem 4：523-43(2004)；Sharma N等，Plant Physiol 134：171-81(2004))。已經(jīng)在體外和在體內(nèi)觀察到志賀毒素催化活性。用于志賀毒素效應(yīng)子活性的測定可以測量多種活性，諸如，例如，蛋白合成抑制活性、去嘌呤活性、細(xì)胞生長抑制、細(xì)胞毒性、超螺旋結(jié)構(gòu)DNA松弛活性和/或核酸酶活性。

本文中使用的志賀毒素效應(yīng)子功能的保留表示，如通過具有再現(xiàn)性的適當(dāng)定量測定所測量的，與野生型志賀毒素效應(yīng)子區(qū)對照相當(dāng)?shù)闹举R毒素功能活性水平。對于核糖體抑制，志賀毒素效應(yīng)子功能是展現(xiàn)10,000皮摩爾(pM)以下的IC₅₀。對于在靶標(biāo)陽性細(xì)胞殺傷測定中的細(xì)胞毒性，取決于細(xì)胞類型和其適當(dāng)?shù)募?xì)胞外靶標(biāo)生物分子的表達(dá)，志賀毒素效應(yīng)子功能是展現(xiàn)1,000納摩爾(nM)以下的IC₅₀。

免疫毒素和配體-毒素融合物作為細(xì)胞毒性分子的有效性和功效受它們在靶細(xì)胞表面上的靶抗原的密度(參見，例如Decket T等，Blood 103：2718-26(2004)；Du X等，Blood 111：338-43(2008)；Baskar S等，mAbs 4：349-61(2012))、表位位置(Press O等，J Immunol 141：4410-7(1988)；Godal A等，In J Cancer 52：631-5(1992)；Yazdi P等，Cancer Res 55：3763-71(1995))、表面結(jié)合的細(xì)胞毒性分子的內(nèi)在化的速率(參見，例如Du X等，Cancer Res 68：6300-5(2008))和細(xì)胞內(nèi)路線(Tortorella L等，PLoS One 7：e47320(2012))的影響。

給定的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞表面表現(xiàn)和/或密度可能影響可能最適合使用本發(fā)明的某些蛋白的應(yīng)用。細(xì)胞之間給定的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞表面表現(xiàn)和/或密度的差異可能定量和定性地改變給定的本發(fā)明的蛋白的內(nèi)在化和/或細(xì)胞毒性。在靶標(biāo)生物分子陽性的細(xì)胞之間，或者甚至在細(xì)胞周期或細(xì)胞分化的不同時間點(diǎn)的同一細(xì)胞上，給定的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞表面表現(xiàn)和/或密度可能極大地不同?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定給定的靶標(biāo)生物分子在特定細(xì)胞或細(xì)胞群體上的總細(xì)胞表面表現(xiàn)，所述方法諸如熒光活化細(xì)胞分選(FACS)流式細(xì)胞計數(shù)方法。

引言

本發(fā)明解決改造有效的細(xì)胞毒性蛋白的問題，所述細(xì)胞毒性蛋白包含與用于細(xì)胞靶向的異源結(jié)合區(qū)連接的志賀毒素亞基A來源的區(qū)域，例如，保留強(qiáng)健的志賀毒素效應(yīng)子功能(如自我指導(dǎo)的向細(xì)胞溶膠的細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送和細(xì)胞毒性)的融合蛋白。本發(fā)明是基于這樣的觀察：志賀毒素亞基A來源的毒素區(qū)與異源結(jié)合區(qū)之間特定的結(jié)構(gòu)關(guān)系可以影響改造的基于志賀毒素的細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞殺傷效力。這些多肽的細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送必須足以允許酶活性的志賀毒素亞基A來源的多肽有效地到達(dá)細(xì)胞溶膠區(qū)室并且使核糖體失活，以引起細(xì)胞死亡。如在實(shí)施例中更詳細(xì)地描述，相對于異源細(xì)胞靶向性結(jié)合區(qū)，具有鄰近氨基端朝向的志賀毒素亞基A來源的毒素區(qū)導(dǎo)致的細(xì)胞殺傷比以相反方向排列的相同結(jié)構(gòu)部分顯著更強(qiáng)勁。本發(fā)明提供一種通過在細(xì)胞毒性蛋白內(nèi)使細(xì)胞靶向性結(jié)合區(qū)鄰近志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的羧基端排列而改造所述細(xì)胞毒性蛋白以實(shí)現(xiàn)此的具體方法。異源、細(xì)胞靶向性結(jié)合區(qū)與志賀毒素亞基A區(qū)以這種特異性方向的結(jié)合允許改造志賀毒素細(xì)胞毒性的更有效的細(xì)胞型特異性靶向，以及具有需要的向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或細(xì)胞溶膠的細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送的蛋白。

之前，表明志賀毒素A亞基是細(xì)胞毒性的，并且可能能夠自我指導(dǎo)其自身的細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送，以將酶活性的毒素片段遞送至細(xì)胞溶膠(Al-Jaufy，Infect Immun 62：956-60(1994)；Al-Jaufy，Infect Immun 63：3073-8(1995)；Su，蛋白Expr Purif 66：149-57(2009))。當(dāng)產(chǎn)生并檢測多種細(xì)胞毒性蛋白(志賀毒素來源的區(qū)域連接免疫球蛋白來源的靶向區(qū)的氨基端)時，這些改造的蛋白不展現(xiàn)預(yù)測水平的細(xì)胞毒性(見下文的實(shí)施例)。然而，與具有以不同構(gòu)型連接的相同多肽區(qū)的更高細(xì)胞毒性的變體相比，這些較低細(xì)胞毒性的蛋白展現(xiàn)相比表面結(jié)合和進(jìn)入，以及相似的體外酶活性和相似的結(jié)合親和性(見下文的實(shí)施例)。

如實(shí)施例中進(jìn)一步所述，通過改變定向，使免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)連接在志賀毒素區(qū)的羧基鄰近區(qū)域，改善了基于志賀毒素亞基A的、細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞毒性。然而，改造的定向并沒有改變志賀毒素來源的區(qū)域的催化活性或免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的結(jié)合動力學(xué)?；谥举R毒素的蛋白的細(xì)胞毒性(和細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送)對改造其多肽組分的定向的敏感性是出乎意料的，并且還沒有得到解釋。這些結(jié)果不能通過蛋白靶標(biāo)結(jié)合特征、細(xì)胞結(jié)合特征或催化活性的差異得到解釋。

I.本發(fā)明的蛋白的一般結(jié)構(gòu)

本發(fā)明提供多種蛋白，每種蛋白包含：1)用于細(xì)胞靶向的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，和2)用于細(xì)胞內(nèi)在化、細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送和/或細(xì)胞殺傷的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。細(xì)胞靶向性免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)與志賀毒素亞基A來源的區(qū)域的連接能夠允許改造有效的志賀毒素細(xì)胞毒性的細(xì)胞型特異性靶向。本發(fā)明的蛋白包含來源于志賀毒素家族成員的一個或多個A亞基的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，其與免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)連接，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以特異性結(jié)合與細(xì)胞物理結(jié)合的至少一種細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子，諸如在細(xì)胞表面上表達(dá)的靶標(biāo)生物分子。這種一般結(jié)構(gòu)是模塊式的，原因在于，任意數(shù)量的多樣性免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以連接到志賀毒素亞基A來源的效應(yīng)子區(qū)上，產(chǎn)生相同的一般結(jié)構(gòu)的變化。

A.免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)

本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)包含含有一個或多個能夠選擇性和特異性結(jié)合細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的多肽的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)。本文中使用的術(shù)語“免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)”表示能夠結(jié)合一個或多個靶標(biāo)生物分子(諸如抗原或表位)的多肽區(qū)域。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)在功能上由它們的結(jié)合靶分子的能力來限定。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)通常源自抗體或抗體樣結(jié)構(gòu)；但是，預(yù)見到來自其它來源的替代支架在該術(shù)語的范圍內(nèi)。

免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被稱為Ig結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。Ig結(jié)構(gòu)域的長度范圍為約70-110個氨基酸殘基并且擁有特征性Ig折疊，其中典型地7-9個反向平行的β鏈排列為兩個形成夾心樣結(jié)構(gòu)的β片層。Ig折疊通過夾心的內(nèi)表面上的疏水氨基酸相互作用和鏈中半胱氨酸殘基之間的高度保守的二硫鍵來穩(wěn)定。Ig結(jié)構(gòu)域可以是可變的(IgV或V-組)、恒定的(IgC或C-組)或中間的(IgI或I-組)。一些Ig結(jié)構(gòu)域可能與互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR，還稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”)有關(guān)，所述互補(bǔ)決定區(qū)對于抗體與它們的表位的結(jié)合的特異性而言是重要的。Ig-樣結(jié)構(gòu)域也存在于非免疫球蛋白的蛋白中，并且基于此被分類為Ig蛋白超家族的成員。HUGO基因命名委員會(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)提供了含有Ig-樣結(jié)構(gòu)域的家族的成員的清單。

免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以是抗體或其抗原結(jié)合片段的多肽序列，其中例如通過分子工程改造或通過文庫篩選進(jìn)行選擇，所述氨基酸序列已經(jīng)與天然抗體或非免疫球蛋白蛋白的Ig-樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有所不同。因?yàn)橹亟MDNA技術(shù)和體外文庫篩選在免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的產(chǎn)生中的關(guān)聯(lián)性，可以重新設(shè)計抗體以獲得期望的特征，諸如較小的尺寸、細(xì)胞進(jìn)入(cell entry)、或其它治療改善?？赡艿淖兓泻芏啵⑶曳秶梢詾閺膬H一個氨基酸的改變到例如可變區(qū)的完全重新設(shè)計。典型地，將做出可變區(qū)的改變以便改善抗原結(jié)合特征、改善可變區(qū)穩(wěn)定性、或降低免疫原性應(yīng)答的可能。

還存在眾多預(yù)見到作為本發(fā)明的蛋白的組分的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)。在某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)源自免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域，諸如能夠結(jié)合細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的抗體互補(bǔ)位。在某些其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)包含經(jīng)工程改造的多肽，所述經(jīng)工程改造的多肽并非源自任何免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，而是通過提供對細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的高親和力結(jié)合而象免疫球蛋白結(jié)合區(qū)一樣發(fā)揮作用。這種經(jīng)工程改造的多肽可以任選地包括包含來自如本文中所述的免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)或者基本上由所述互補(bǔ)決定區(qū)組成的多肽支架。

存在眾多現(xiàn)有技術(shù)中的免疫球蛋白來源的結(jié)合區(qū)和非免疫球蛋白改造的多肽，其可用于通過它們的高親和力結(jié)合特性將多肽靶向特定細(xì)胞型。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)選自單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)構(gòu)域(sdAb)、納米抗體、從駱駝科來源的重鏈抗體結(jié)構(gòu)域(V_HH片段)、二價納米抗體、從軟骨魚來源的重鏈抗體結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)、V_NAR片段、單鏈可變(scFv)片段、多聚化scFv片段(雙抗體、三抗體、四抗體)、雙特異性的串聯(lián)的scFv片段、二硫鍵穩(wěn)定化的抗體可變(Fv)片段、由V_L、V_H、C_L和C_H1結(jié)構(gòu)域組成的二硫鍵穩(wěn)定化的抗原結(jié)合(Fab)片段、二價F(ab’)2片段、由重鏈和C_H1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段、單鏈Fv-C_H3微抗體、雙特異性微抗體、二聚C_H2結(jié)構(gòu)域片段(C_H2D)、Fc抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Fcabs)、分離的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)片段、受限的構(gòu)架區(qū)3、CDR3、構(gòu)架區(qū)4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模塊免疫藥物(SMIP)結(jié)構(gòu)域、scFv-Fc融合體、多聚化scFv片段(雙抗體、三抗體、四抗體)、二硫鍵穩(wěn)定化的抗體可變(Fv)片段、由V_L、V_H、C_L和C_H1結(jié)構(gòu)域組成的二硫鍵穩(wěn)定化的抗原結(jié)合(Fab)片段、二價納米抗體、二價微抗體、二價F(ab’)₂片段(Fab二聚體)、雙特異性的串聯(lián)的V_HH片段、雙特異性的串聯(lián)的scFv片段、雙特異性納米抗體、雙特異性微抗體、以及保留它的互補(bǔ)位和結(jié)合功能的前述物質(zhì)的任何遺傳操作的對應(yīng)物(參見Saerens D等，Curr.Opin.Pharmacol 8：600-8(2008)；Dimitrov D，MAbs 1：26-8(2009)；Weiner L，Cell 148：1081-4(2012)；Ahmad Z等，Clin Dev Immunol 2012：980250(2012))。存在多種包含來源于免疫球蛋白恒定區(qū)的多肽的結(jié)合區(qū)，諸如，例如，改造的二聚體Fc結(jié)構(gòu)域、單體Fcs(mFcs)、scFv-Fcs、V_HH-Fcs、C_H2結(jié)構(gòu)域、單體C_H3s結(jié)構(gòu)域(mC_H3s)、合成重新設(shè)計的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和/或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與配體的雜化融合體(Hofer T等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.105：12451-6(2008)；Xiao J等，J Am Chem Soc 131：13616-13618(2009)；Xiao X等，Biochem Biophys Res Commun 387：387-92(2009)；Wozniak-Knopp G等，蛋白Eng Des Sel 23 289-97(2010)；Gong R等，PLoS ONE 7：e42288(2012)；Wozniak-Knopp G等，PLoS ONE 7：e30083(2012)；Ying T等，J Biol Chem 287：19399-408(2012)；Ying T等，J Biol Chem 288：25154-64(2013)；Chiang M等，J Am Chem Soc 136：3370-3(2014)；Rader C，Trends Biotechnol 32：186-97(2014)；Ying T等，Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82(2014))。

根據(jù)某些其它實(shí)施方案，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的經(jīng)工程改造的替代支架。本領(lǐng)域中已知，改造的替代支架表現(xiàn)出與免疫球蛋白來源的結(jié)構(gòu)類似的功能特征，諸如對靶標(biāo)生物分子的高親和力和特異性結(jié)合，并且可以為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域提供改善的特征，諸如例如更大穩(wěn)定性或降低的免疫原性。通常，對于免疫球蛋白的替代支架小于20KD，由單個多肽鏈組成，缺少半胱氨酸殘基，并且展現(xiàn)相對高的熱力學(xué)穩(wěn)定性。

對于本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案，所述結(jié)合區(qū)包含選自包括下述的組的替代支架：經(jīng)工程改造的、纖維連接蛋白來源的、第10個纖連蛋白III型(10Fn3)結(jié)構(gòu)域(單抗體、AdNectins^TM或AdNexins^TM)；經(jīng)工程改造的、生腱蛋白來源的、生腱蛋白III型結(jié)構(gòu)域(Centryns^TM)；經(jīng)工程改造的、含有錨蛋白重復(fù)基序的多肽(DARPins^TM)；經(jīng)工程改造的、低密度-脂蛋白-受體來源的、A結(jié)構(gòu)域(LDLR-A)(Avimers^TM)；脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(anticalins)；經(jīng)工程改造的、蛋白酶抑制劑來源的、Kunitz結(jié)構(gòu)域；經(jīng)工程改造的、蛋白-A來源的、Z結(jié)構(gòu)域(Affibodies^TM)；經(jīng)工程改造的、γ-B結(jié)晶來源的支架或經(jīng)工程改造的、泛蛋白來源的支架(Affilins)；Sac7d來源的多肽(或affitins)；經(jīng)工程改造的、Fyn來源的、SH2結(jié)構(gòu)域小蛋白；C-型凝集素-樣結(jié)構(gòu)域支架；經(jīng)工程經(jīng)工程改造的抗體模擬物；以及保留它的結(jié)合功能性的前述物質(zhì)的任何遺傳操作的對應(yīng)物(A，Plückthun A，J Mol Biol 305：989-1010(2001)；Xu L等，Chem Biol 9：933-42(2002)；Wikman M等，蛋白Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等，Nat Biotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等，Trends Biotechnol 23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，Nat Biotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352：95-109(2007)；Byla P等，J Biol Chem 285：12096(2010)；Zoller F等，Molecules 16：2467-85(2011))。

例如，已經(jīng)鑒定了多種結(jié)合細(xì)胞外受體HER2的替代支架(參見例如Wikman M等，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Orlova A等Cancer Res 66：4339-8(2006)；Ahlgren S等，Bioconjug Chem 19；235-43(2008)；Feldwisch J等，J Mol Biol 398：232-47(2010)；美國專利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,985,553；6,333,169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,480；7,560,111；7,674,460；7,815,906；7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,349,585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和美國專利申請2011/0059090)。

任何以上免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以用作本發(fā)明的組分，只要所述結(jié)合區(qū)組分對細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子具有10^-5至10^-12摩爾/升、優(yōu)選地小于200nM的解離常數(shù)即可。

細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子

本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)包含這樣的多肽區(qū)域：其能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子，優(yōu)選地其物理連接至目標(biāo)細(xì)胞類型(諸如癌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、漿細(xì)胞、被感染的細(xì)胞或攜帶細(xì)胞內(nèi)病原體的宿主細(xì)胞)的表面。

術(shù)語“靶標(biāo)生物分子”表示這樣的生物分子，通常是蛋白或通過翻譯后修飾(諸如糖基化)而修飾的蛋白：其能夠被結(jié)合區(qū)結(jié)合以使蛋白靶向生物體內(nèi)的特定細(xì)胞類型或位置。細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子可以包括多個表位，包括未修飾的多肽、通過添加生化官能團(tuán)而修飾的多肽、和糖脂(參見例如美國專利5,091,178；EP 2431743)。合乎需要的是，細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子在與本發(fā)明的蛋白相互作用以后被內(nèi)源性地內(nèi)化或容易地被迫內(nèi)化。

就本發(fā)明的目的而言，關(guān)于修飾靶標(biāo)生物分子，術(shù)語“細(xì)胞外的”表示這樣的生物分子：它的結(jié)構(gòu)的至少一部分暴露于細(xì)胞外環(huán)境。細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子包括細(xì)胞膜組分、跨膜蛋白、細(xì)胞膜錨定的生物分子、細(xì)胞表面結(jié)合的生物分子和分泌的生物分子。

關(guān)于本發(fā)明，當(dāng)用于描述靶標(biāo)生物分子時，短語“物理連接”是指將靶標(biāo)生物分子或其部分與細(xì)胞外部關(guān)聯(lián)的共價和/或非共價分子間相互作用，諸如靶標(biāo)生物分子和細(xì)胞之間的多個非共價相互作用，其中每個單獨(dú)相互作用的能量是在約1-5千卡的量級(例如靜電鍵、氫鍵、范德華相互作用、疏水力等)?？梢园l(fā)現(xiàn)所有嵌膜蛋白與細(xì)胞膜、以及周圍膜蛋白物理連接。例如，細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子可能包含跨膜區(qū)域、脂質(zhì)錨、糖脂錨和/或與包含前述任一種的因子非共價地結(jié)合(例如通過非特異性疏水相互作用和/或結(jié)合脂質(zhì)的相互作用)。

本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子可以包括在癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和感染了細(xì)胞內(nèi)病原體(諸如病毒、細(xì)菌、真菌、朊病毒或原生動物)的細(xì)胞上過比例或排他性地存在的生物標(biāo)記。

可以基于眾多標(biāo)準(zhǔn)(諸如它們的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞類型特異性的表達(dá)和/或它們的靶標(biāo)生物分子關(guān)于特定細(xì)胞類型的物理定位)來設(shè)計或選擇本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)。例如，本發(fā)明的某些蛋白包含這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域：其能夠使由僅一種細(xì)胞類型排他地表達(dá)的細(xì)胞表面靶標(biāo)結(jié)合至細(xì)胞表面。

本發(fā)明的蛋白的一般結(jié)構(gòu)是模塊式的，原因在于，多個多樣性的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以與相同的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)一起使用，以提供多種細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的多樣性靶向，并且由此使細(xì)胞毒性、白細(xì)胞淤積、診斷劑和/或外源物質(zhì)遞送靶向多種不同的細(xì)胞型。

B.來源于志賀毒素家族成員的A亞基的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)

就本發(fā)明的目的而言，短語“志賀毒素效應(yīng)子區(qū)”是指來源于志賀毒素家族的成員的志賀毒素A亞基的多肽區(qū)域，其能夠展現(xiàn)至少一種志賀毒素功能。志賀毒素功能包括，例如，細(xì)胞進(jìn)入、脂質(zhì)膜變形、指導(dǎo)亞細(xì)胞按路線發(fā)送、避免降解、催化滅活核糖體、實(shí)施細(xì)胞毒性和實(shí)施細(xì)胞生長抑制作用。

志賀毒素家族成員是指在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的天然存在的蛋白毒素、特別是從痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)和大腸桿菌(E.coli)分離的毒素的家族的任何成員(Johannes，Nat RevMicrobiol 8：105-16(2010))。例如，志賀毒素家族包括從痢疾志賀氏菌血清型1中分離的真正志賀毒素(Stx)，從腸出血性大腸桿菌的血清型分離的志賀樣毒素1變體(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)，以及從腸出血性大腸桿菌的血清型分離的志賀樣毒素2變體(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1與Stx僅一個殘基不同，并且二者都被稱為維羅細(xì)胞毒素(Verocytotoxins)或維羅毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien，Curr Top Microbiol Immunol 180：65-94(1992))。盡管SLT1和SLT2變體在氨墓酸序列水平上彼此僅有約53-60％的相似性，但是它們享有志賀毒素家族成員共有的酶活性和細(xì)胞毒性的機(jī)制(Johannes，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。已經(jīng)描述了超過39種不同的志賀毒素，如定義的亞型Stx1a、Stx1c、Stx1d、和Stx2a-g(Scheutz F等，J Clin Microbiol 50：2951-63(2012))。志賀毒素家族成員并不天然地限于任何細(xì)菌物種，因?yàn)榫幋a志賀毒素的基因可以經(jīng)由水平基因轉(zhuǎn)移在細(xì)菌物種之間傳播(Strauch E等，Infect Immun 69：7588-95(2001)；Zhaxybayeva O，Doolittle W，Curr Biol 21：R242-6(2011))。作為物種間轉(zhuǎn)移的實(shí)例，在從患者中分離的溶血不動桿菌(A.haemolyticus)的菌株中發(fā)現(xiàn)了志賀毒素(Grotiuz G等，J Clin Microbiol 44：3838-41(2006))。一旦編碼志賀毒素的多核苷酸進(jìn)入新的亞種或物種，則假定志賀毒素氨基酸序列能夠由于遺傳漂變和/或選擇壓力發(fā)展少量序列變化而同時仍然保持志賀毒素家族成員共有的細(xì)胞毒性的機(jī)制(參見Scheutz，J Clin Microbiol 50：2951-63(2012))。

本發(fā)明的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)包含源于從其天然志賀毒素B亞基的任何形式解離的志賀毒素A亞基的多肽或者基本上由其組成。此外，本發(fā)明的蛋白不含任何包含志賀毒素B亞基的功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者基本上由其組成的多肽。相反，源于志賀毒素A亞基的區(qū)域與異源免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)在功能上相關(guān)聯(lián)從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)可以包含全長志賀毒素A亞基(例如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)或SLT-2A(SEQ ID NO：3))，或者基本上由其組成，應(yīng)注意的是，天然存在的志賀毒素A亞基可以包括前體形式，所述前體形式在其氨基端含有約22個氨基酸的信號序列，所述信號序列被移除從而產(chǎn)生成熟的志賀毒素A亞基，并且是技術(shù)人員能識別的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)包含比全長志賀毒素A亞基短的截短的志賀毒素A亞基，或者基本上由其組成。

志賀樣毒素1A亞基截短是具有催化活性的，能夠在體外使核糖體酶促失活，并且當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時是具有細(xì)胞毒性的(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。展現(xiàn)出完全酶活性的最小志賀毒素A亞基片段是由Slt1A的殘基1-239組成的多肽(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。盡管報道的保持基本催化活性的志賀毒素A亞基的最小片段是StxA的殘基75-247(Al-Jaufy，Infect Immun62：956-60(1994))，在真核細(xì)胞內(nèi)從頭(de novo)表達(dá)的StxA截短僅需要至多殘基240以到達(dá)細(xì)胞溶膠并且進(jìn)行核糖體的催化失活(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。

志賀毒素效應(yīng)子區(qū)通常可以少于全長A亞基。優(yōu)選的是，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)保留從氨基酸位置77至239的多肽區(qū)(SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2))或志賀毒素家族成員的其他A亞基的等同物(例如(SEQ ID NO：3)的77-238)。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，來源于SLT-1A的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸75至251、SEQ ID NO：1的1至241、SEQ ID NO：1的1至251、或SEQ ID NO：1的氨基酸1至261，或者基本上由其組成。在某些其他實(shí)施方案中，來源于StxA的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸75至251、SEQ ID NO：2的1至241、SEQ ID NO：2的1至251、或SEQ ID NO：2的氨基酸1至261，或者基本上由其組成。在某些其他實(shí)施方案中，來源于SLT-2的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸75至251、SEQ ID NO：3的1至241、SEQ ID NO：3的1至251、或SEQ ID NO：3的氨基酸1至261，或者基本上由其組成。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的蛋白的變體，其中志賀毒素效應(yīng)子區(qū)與天然存在的志賀毒素A亞基至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多個氨基酸殘基不同(但是不多于保持至少85％、90％、95％、99％以上氨基酸序列同一性的氨基酸殘基數(shù)目)。因此，來源于志賀毒素家族成員的A亞基的多肽區(qū)可以包含增加、缺失、截短、或相對于原始序列的其他改變，只要維持與天然存在的志賀毒素A亞基至少85％、90％、95％、99％以上的氨基酸序列同一性即可。

因此，在某些實(shí)施方案中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)包含與天然存在的志賀毒素A亞基(如SLT-1A(SEQ ID NO：1)，Stx(SEQ ID NO：2)，和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3))具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％整體序列同一性的氨基酸序列，或者基本上由其組成。

任選地，志賀毒素A亞基的全長或截短形式可以包含一個或多個突變(例如置換、缺失、插入或倒置)。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)與天然存在的志賀毒素A亞基具有足夠的序列同一性，以在進(jìn)入細(xì)胞后保持細(xì)胞毒性，所述進(jìn)入細(xì)胞通過宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染或誘導(dǎo)的已知方法，或者通過與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接的細(xì)胞靶向性免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)介導(dǎo)的內(nèi)在化進(jìn)行。志賀毒素A亞基中對酶活性和/或細(xì)胞毒性最重要的殘基被繪圖定位至以下殘基位置：特別是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176(Di，Toxicon 57：535-39(2011))。在本發(fā)明的實(shí)施方案中的任一個中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)可以優(yōu)選地但不是必須地保留在下述位置的一個或多個保守氨基酸：諸如在StxA、SLT-1A的位置77、167、170和176處的保守氨基酸，或在志賀毒素家族其他成員中典型地是細(xì)胞毒性活性所需要的等價保守位置。本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白引起細(xì)胞死亡的能力，例如，其細(xì)胞毒性，可以使用本領(lǐng)域公知的多種測定中的任一種或多種進(jìn)行測量。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基可以被突變、插入或缺失，以增加志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的酶活性。例如，將StxlA中殘基位置丙氨酸-231突變?yōu)楣劝彼嵩黾悠潴w外酶活性(Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以將一個或多個氨基酸殘基突變或缺失以便降低或消除志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的催化和/或細(xì)胞毒性活性?？梢酝ㄟ^突變或截短來降低或消除志賀毒素家族成員的A亞基的催化和/或細(xì)胞毒性。已經(jīng)顯示標(biāo)記為酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置對于Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等，Proc Natl Acad Sci USA 85：2568-72(1988)；Deresiewicz R等，Biochemistry 31：3272-80(1992)；Deresiewicz R等，Mol Gen Genet 241：467-73(1993)；Ohmura M等，Microb Pathog 15：169-76(1993)；Cao C等，Microbiol Immunol 38：441-7(1994)；Suhan，Infect Immun 66：5252-9(1998))。在無細(xì)胞核糖體失活測定中，將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變消除了Slt-I A1的酶活性(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。在利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Slt-I A1的從頭表達(dá)的另一種方法中，將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變在所述表達(dá)水平上消除了Slt-I A1片段細(xì)胞毒性(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。截短分析表明，StxA的殘基75至268的片段在體外仍然保持明顯的酶活性(Haddad，J Bacteriol 175：4970-8(1993))。借助在細(xì)胞溶膠中的從頭表達(dá)，含有殘基1-239的Slt-I A1的截短片段顯示出明顯的體外酶活性和細(xì)胞毒性(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。截短至殘基1-239的Slt-I A1片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達(dá)不具有細(xì)胞毒性，因?yàn)槠洳荒苣嬉莆恢良?xì)胞溶膠中(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。

用于本文時，保留“顯著的”志賀毒素效應(yīng)子功能是指，通過具有再現(xiàn)性的適當(dāng)?shù)亩繙y定測量的，與野生型志賀毒素效應(yīng)子多肽對照相當(dāng)?shù)闹举R毒素功能活性水平。對于體外核糖體抑制，顯著的志賀毒素效應(yīng)子功能是展現(xiàn)300pM以下的IC₅₀，這取決于核糖體的來源(例如，細(xì)菌、古細(xì)菌(archaea)或真核生物(藻類，真菌，植物或動物))。與催化失活的SLT-1A 1-251雙重突變體(Y77S/E167D)的約100,000pM的IC₅₀相比，這是顯著更大的抑制作用。對于在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)物中的靶標(biāo)陽性細(xì)胞殺傷測定中的細(xì)胞毒性，顯著的志賀毒素效應(yīng)子功能是展現(xiàn)100、50或30nM以下的CD₅₀，這取決于細(xì)胞系和其對適當(dāng)?shù)募?xì)胞外靶標(biāo)生物分子的表達(dá)。與單獨(dú)的沒有細(xì)胞靶向性結(jié)合區(qū)的SLT-1A組分(其具有100-10,000nM的CD₅₀)相比，這是對適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞系顯著更高的細(xì)胞毒性，其取決于細(xì)胞系。

對于一些樣品，由于不能收集必要的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的曲線擬合，IC₅₀或CD₅₀的準(zhǔn)確值可能是不能獲得的。當(dāng)確定顯著的志賀毒素效應(yīng)子功能活性時，不應(yīng)該考慮不準(zhǔn)確的IC₅₀和/或CD₅₀值。在示例性的志賀毒素效應(yīng)子功能測定(諸如，例如，在實(shí)施例中所述的測定)的數(shù)據(jù)分析中描述為不足以準(zhǔn)確擬合曲線的數(shù)據(jù)不應(yīng)該被認(rèn)為代表實(shí)際的志賀毒素效應(yīng)子功能。例如，如果在給定樣品的濃度系列中分別不發(fā)生大于50％的核糖體抑制或細(xì)胞死亡，則理論上不可能確定IC₅₀和CD₅₀。

不能檢測志賀毒素效應(yīng)子功能的活性可能是由于不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)、多肽折疊、和/或多肽穩(wěn)定性，而不是缺少細(xì)胞進(jìn)入、亞細(xì)胞按路線發(fā)送和/或酶活性。志賀毒素效應(yīng)子功能的測定可能不需要很多本發(fā)明的多肽來測量顯著量的志賀毒素效應(yīng)子功能活性。在憑經(jīng)驗(yàn)確定低或沒有效應(yīng)子功能的潛在的原因與蛋白表達(dá)或穩(wěn)定性相關(guān)的程度上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以能夠利用本領(lǐng)域已知的蛋白化學(xué)和分子改造技術(shù)抵消這些因素，使得志賀毒素功能性效應(yīng)子活性可以被恢復(fù)并測量。例如，基于不適當(dāng)?shù)募?xì)胞的表達(dá)可以通過使用不同的表達(dá)控制序列進(jìn)行抵消；不適當(dāng)?shù)亩嚯恼郫B和/或穩(wěn)定性可以受益于穩(wěn)定末端序列、或穩(wěn)定蛋白三維結(jié)構(gòu)的非效應(yīng)子區(qū)中的補(bǔ)償性突變等。當(dāng)關(guān)于個體志賀毒素功能的新測定可用時，可以分析志賀毒素效應(yīng)子區(qū)或多肽的任意水平的這些志賀毒素效應(yīng)子功能，諸如是野生型志賀毒素效應(yīng)子多肽的活性的特定倍數(shù)的活性以內(nèi)。有意義的活性差異的實(shí)例是，例如，具有是野生型志賀毒素效應(yīng)子多肽的活性的1000-倍或100-倍以下的活性的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)；或與功能性敲低或敲除的志賀毒素效應(yīng)子多肽相比，具有3-倍至30-倍或更高的活性的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。

某些志賀毒素效應(yīng)子功能是不容易測量的，例如，亞細(xì)胞按路線發(fā)送功能。目前沒有途徑、定量測定區(qū)分志賀毒素效應(yīng)子多肽不是細(xì)胞毒性的是否是由于不正確的亞細(xì)胞按路線發(fā)送，但是，在測試可用的時候，可以與適當(dāng)?shù)囊吧椭举R毒素效應(yīng)子區(qū)相比，分析志賀毒素效應(yīng)子多肽任意顯著水平的亞細(xì)胞按路線發(fā)送。

應(yīng)該注意，即使志賀毒素效應(yīng)子多肽的細(xì)胞毒性相對于野生型減少了，在實(shí)踐中，使用減毒的志賀毒素效應(yīng)子多肽的應(yīng)用可以與使用野生型志賀毒素效應(yīng)子多肽一樣有效或更有效，原因在于，功效最高的變體可能展現(xiàn)不需要的作用，而在功效降低的變體中不需要的作用減至最小。野生型志賀毒素效應(yīng)子多肽是非常有效的，能夠僅以到達(dá)細(xì)胞溶膠的一個分子或內(nèi)在化的大約40個分子進(jìn)行殺傷。與野生型志賀毒素效應(yīng)子多肽相比，具有甚至相當(dāng)減少的志賀毒素效應(yīng)子功能(諸如，例如，亞細(xì)胞按路線發(fā)送或細(xì)胞毒性)的志賀毒素效應(yīng)子多肽，對于涉及靶向的細(xì)胞殺傷和/或特定的細(xì)胞檢測的實(shí)際應(yīng)用，可能仍然是足夠有效的。

為了本發(fā)明的目的，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)和免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的特定次序或定向是固定的，使得與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的氨基端相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)在蛋白內(nèi)更鄰近志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的羧基端(參見，例如，圖1)。

相對于彼此或整個蛋白的N-端和C-端的具體順序或定向不是固定的(例如，參見圖1)。在本發(fā)明的蛋白的上述實(shí)施方案中，結(jié)合區(qū)、志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(其可以是由細(xì)胞毒性的和/或攜帶一個或多個降低或消除催化活性和/或細(xì)胞毒性的突變)可以彼此直接連接和/或經(jīng)由一個或多個插入的多肽序列彼此適合地連接，如利用一個或多個在本領(lǐng)域內(nèi)公知的和/或本文所述的接頭連接。

C.連接本發(fā)明的多肽組分和/或它們的亞組分的連接鍵

本發(fā)明的各個多肽和/或蛋白組分，例如結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(其可以是有細(xì)胞毒性的和/或攜帶一個或多個改變、降低或消除催化活性和/或細(xì)胞毒性的突變)，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的和/或本文描述的一個或多個接頭適當(dāng)?shù)乇舜诉B接。結(jié)合區(qū)的各個多肽亞組分，例如CDR和/或ABR區(qū)，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的和/或本文描述的一個或多個接頭適當(dāng)?shù)乇舜诉B接(例如，參見Weisser N，Hall J，Biotechnol Adv 27：502-20(2009)；Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))。本發(fā)明的蛋白組分，例如，多鏈結(jié)合區(qū)域，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的一個或多個接頭適當(dāng)?shù)乇舜诉B接或連接至本發(fā)明的其它多肽組分。本發(fā)明的肽組分，例如，KDEL家族內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留/回收信號基序，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的一個或多個接頭(諸如蛋白性接頭)適當(dāng)?shù)剡B接至本發(fā)明的另一個組分。

合適的接頭通常是允許本發(fā)明的每個多肽組分以這樣的三維結(jié)構(gòu)折疊的那些接頭，所述三維結(jié)構(gòu)非常類似于在沒有任何接頭或其它組分的情況下單獨(dú)產(chǎn)生的多肽組分。合適的接頭包括單個氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一種的接頭，諸如例如各種非蛋白性的碳鏈，無論是分支的還是環(huán)狀的(例如，參見Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))。

合適的接頭可以是蛋白性的，且包含一個或多個氨基酸、肽和/或多肽。蛋白性的接頭適合用于重組融合蛋白和化學(xué)連接的綴合物。蛋白性的接頭典型地具有約2至約50個氨基酸殘基，諸如，例如，約5至約30個或約6至約25個氨基酸殘基。選擇的接頭的長度取決于多種因素，諸如，例如，選擇所述接頭所期望的一種或多種性質(zhì)(例如，參見Chen X等，Adv DrugDeliv Rev 65：1357-69(2013))。

合適的接頭可以是非蛋白性的，例如，化學(xué)接頭(例如，參見Dosio F等，Toxins 3：848-83(2011)；Feld J等，Oncotarget 4：397-412(2013))。本領(lǐng)域已知的各種非蛋白性的接頭可以用于連接結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，諸如常用于將免疫球蛋白來源的多肽綴合至異源多肽的接頭。例如，使用它們的氨基酸殘基的功能側(cè)鏈和碳水化合物結(jié)構(gòu)部分(諸如，例如，羧基、胺、巰基、羧酸、羰基、羥基和/或環(huán)狀環(huán)基)，可以連接本發(fā)明的蛋白的多肽區(qū)域。例如，二硫鍵和硫醚鍵可以用于連接兩個或更多個多肽(參見例如Fitzgerald D等，Bioconjugate Chem 1：264-8(1990)；Pasqualucci L等，Haematologica 80：546-56(1995))。另外，非天然的氨基酸殘基可以與其它功能側(cè)鏈諸如酮基一起使用(參見例如Sun S等，Chembiochem Jul 18(2014)；Tian F等，Proc Natl Acad Sci USA 111：1766-71(2014))。非蛋白性化學(xué)接頭的例子包括、但不限于：N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸酯，S-(N-琥珀酰亞胺基)硫代乙酸酯(SATA)，N-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP)，琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷甲酸酯(SMCC或MCC)，磺基琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸酯，4-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，磺基琥珀酰亞胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基)己酸酯，N-琥珀酰亞胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，磺基琥珀酰亞胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，馬來酰亞胺基己?；?MC)，馬來酰亞胺基己?；?纈氨酸-瓜氨酸-p-氨基芐氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-馬來酰亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亞胺基N-[3-(乙?；蚧?-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])，磺基二氯苯酚，2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(2-iminothiolane)，3-(2-吡啶基二硫基)-丙?；ｋ?，Ellman氏試劑，二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸(參見例如Thorpe P等，Eur J Biochem 147：197-206(1985)；Thorpe P等，Cancer Res 47：5924-31(1987)；Thorpe P等，Cancer Res 48：6396-403(1988)；Grossbard M等，Blood 79：576-85(1992)；Lui C等，Proc Natl Acad Sci USA 93：8618-23(1996)；Doronina S等，Nat Biotechnol 21：778-84(2003)；Feld J等，Oncotarget 4：397-412(2013))。

合適的接頭(無論是蛋白性的還是非蛋白性的)可以包括，例如，蛋白酶敏感的、環(huán)境氧化還原電位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或熱敏感的接頭(參見例如Dosio F等，Toxins 3：848-83(2011)；Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013)；Feld J等，Oncotarget 4：397-412(2013))。

可以選擇蛋白性的接頭用于摻入本發(fā)明的重組融合蛋白中。例如，本發(fā)明的蛋白的組分多肽或它們的亞組分可以通過一個或多個包含一個或多個氨基酸、肽和/或多肽的接頭連接。對于本發(fā)明的重組融合蛋白，接頭典型地包含約2-50個氨基酸殘基，優(yōu)選約5-30個氨基酸殘基(Argos P，JMol Biol 211：943-58(1990)；Williamson M，Biochem J 297：240-60(1994)；George R，Heringa J，Protein Eng 15：871-9(2002)；Kreitman R，AAPS J 8：E532-51(2006))。通常，蛋白性的接頭包含大多數(shù)具有極性的、不帶電荷的和/或帶電荷的殘基的氨基酸殘基，諸如，例如，蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸(參見例如Huston J等Proc Natl Acad Sci U.S.A.85：5879-83(1988)；Pastan I等，Annu Rev Med 58：221-37(2007)；Li J等，Cell Immunol 118：85-99(1989)；Cumber A等Bioconj Chem 3：397-401(1992)；Friedman P等，Cancer Res 53：334-9(1993)；Whitlow M等，Protein Engineering 6：989-95(1993)；Siegall C等，J Immunol 152：2377-84(1994)；Newton等Biochemistry 35：545-53(1996)；Ladurner等J Mol Biol 273：330-7(1997)；Kreitman R等，Leuk Lymphoma 52：82-6(2011)；U.S.4,894,443)。蛋白性的接頭的非限制性例子包括丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE)、纈氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G_2-4S)_xAM，其中G是甘氨酸，S是絲氨酸，且x是1-10的整數(shù)。

可以基于期望的性能選擇蛋白性的接頭。技術(shù)人員可以記住特定特征來選擇蛋白性的接頭，諸如以優(yōu)化融合分子的折疊、穩(wěn)定性、表達(dá)、溶解度、藥代動力學(xué)性能、藥效動力學(xué)性能和/或在融合構(gòu)建體的背景下融合的結(jié)構(gòu)域的活性(相對于相同結(jié)構(gòu)域自身的活性)中的一種或多種。例如，可以基于柔性、剛度和/或切割性選擇蛋白性的接頭(參見例如Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))。技術(shù)人員在選擇接頭時可以使用數(shù)據(jù)庫和接頭設(shè)計軟件工具?？梢赃x擇某些接頭以優(yōu)化表達(dá)(參見例如Turner D等，J Immunl Methods 205：43-54(1997))?？梢赃x擇某些接頭以促進(jìn)相同多肽或蛋白之間(以形成同型多聚體)或不同多肽或蛋白之間(以形成異型多聚體)的分子間相互作用。例如，可以選擇蛋白性的接頭，其允許本發(fā)明的蛋白的多肽組分之間的期望的非共價相互作用，諸如，例如，與二聚體和其它更高級多聚體的形成有關(guān)的相互作用(參見例如U.S.4,946,778)。

柔性的蛋白性的接頭經(jīng)常具有大于12個氨基酸殘基的長度，且富含小的、非極性的氨基酸殘基、極性的氨基酸殘基和/或親水的氨基酸殘基，諸如，例如，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(參見例如Bird R等，Science 242：423-6(1988)；Friedman P等，Cancer Res 53：334-9(1993)；Siegall C等，J Immunol 152：2377-84(1994))。可以選擇柔性的蛋白性的接頭以增加組分之間的空間分離和/或允許組分之間的分子內(nèi)相互作用。例如，多種“GS”接頭是技術(shù)人員已知的，且由多個甘氨酸和/或一個或多個絲氨酸組成，有時在重復(fù)單元中，例如(G_xS)_n，(S_xG)_n，(GGGGS)_n和(G)_n，其中x是1-6，且n是1-30(參見例如WO 96/06641)。柔性的蛋白性的接頭的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS，GSTSGSGKSSEGKG，GSTSGSGKSSEGSGSTKG，GSTSGSGKSSEGKG，GSTSGSGKPGSGEGSTKG，EGKSSGSGSESKEF，SRSSG，和SGSSC。

剛性的蛋白性的接頭經(jīng)常是堅(jiān)硬的α-螺旋結(jié)構(gòu)且富含脯氨酸殘基和/或一個或多個在戰(zhàn)略上放置的脯氨酸(參見Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))?？梢赃x擇剛性的接頭以防止連接的組分之間的分子內(nèi)相互作用。

可以選擇合適的接頭以允許組分的體內(nèi)分離，例如，由于切割和/或環(huán)境特異性的不穩(wěn)定性(參見Dosio F等，Toxins 3：848-83(2011)；Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))。體內(nèi)可切割的蛋白性的接頭能夠通過蛋白水解加工和/或還原環(huán)境(經(jīng)常在生物體內(nèi)的特定部位或在特定細(xì)胞類型內(nèi))而解連(參見例如Doronina S等，Bioconjug Chem 17：144-24(2006)；Erickson H等，Cancer Res 66：4426-33(2006))。體內(nèi)可切割的蛋白性的接頭經(jīng)常包含蛋白酶敏感的基序和/或由一個或多個半胱氨酸對形成的二硫鍵(參見例如Pietersz G等，Cancer Res 48：4469-76(1998)；The J等，J Immunol Methods 110：101-9(1998)；參見Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))?？梢詫Ⅲw內(nèi)可切割的蛋白性的接頭設(shè)計成對僅存在于生物體中的某些位置、細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室的蛋白酶敏感，和/或僅在某些生理學(xué)或病理學(xué)狀況下變得有活性(例如，具有異常高水平的蛋白酶，在某些疾病部位過表達(dá)的蛋白酶，和由病原性微生物特異性地表達(dá)的蛋白酶)。例如，存在本領(lǐng)域已知的蛋白性的接頭，其被僅存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶、僅存在于特定細(xì)胞類型內(nèi)的蛋白酶和僅在病理學(xué)狀況(如癌癥或炎癥)下存在的蛋白酶切割，例如，R-x-x-R基序和AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。

在本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案中，可以使用這樣的接頭：其包含一個或多個蛋白酶敏感的位點(diǎn)以提供存在于靶細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶的切割。在本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案中，可以使用不可切割的接頭以在施用給脊椎動物生物體以后降低不希望的毒性(參見例如Polson等，Cancer Res 69：2358-(2009))。

合適的接頭可以包括，例如，蛋白酶敏感的、環(huán)境氧化還原電位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或熱敏感的接頭，無論是蛋白性的還是非蛋白性的(參見Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))。

合適的可切割的接頭可以包括含有本領(lǐng)域已知的可切割基團(tuán)的接頭，諸如，例如，Zarling D等，J Immunol 124：913-20(1980)；Jung S，Moroi M，Biochem Biophys Acta 761：152-62(1983)；Bouizar Z等，Eur J Biochem 155：141-7(1986)；Park L等，J Biol Chem 261：205-10(1986)；Browning J，Ribolini A，J Immunol 143：1859-67(1989)；Joshi S，Burrows R，JBiol Chem 265：14518-25(1990))。

合適的接頭可以包括pH敏感的接頭。例如，可以由于它們在較低pH環(huán)境中的不穩(wěn)定性而選擇某些合適的接頭以提供在靶細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的解離。例如，包含一個或多個三苯甲基、衍生化的三苯甲基、雙馬來酰亞胺othoxy丙烷基團(tuán)(bismaleimideothoxy propane groups)、己二酸二酰肼基和/或酸不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)鐵蛋白基團(tuán)的接頭可以提供本發(fā)明的組分(例如多肽組分)在具有特定pH范圍的環(huán)境中的釋放(參見例如H等，JBiol Chem 266：4309-14(1991)；Fattom A等，Infect Immun 60：584-9(1992))?？梢赃x擇在特定pH范圍被切割的某些接頭，所述特定pH范圍對應(yīng)于組織之間的生理pH差異，諸如，例如，腫瘤組織的pH低于健康組織中的pH(參見例如US 5,612,474)。

光可切割的接頭是在暴露于某些波長范圍的電磁輻射(諸如可見范圍內(nèi)的光)后被切割的接頭(參見例如Goldmacher V等，Bioconj Chem 3：104-7(1992))。光可切割的接頭可以用于在暴露于某些波長的光以后釋放本發(fā)明的蛋白的組分(例如多肽組分)。光可切割的接頭的非限制性例子包括硝基芐基(作為半胱氨酸的光可切割的保護(hù)基)、硝基芐氧基碳酰氯交聯(lián)劑、羥丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、熒光素共聚物和甲基羅丹明共聚物(Hazum E等，Pept Proc Eur Pept Symp，16th，Brunfeldt K，ed.，105-110(1981)；Senter等，Photochem Photobiol 42：231-7(1985)；Yen等，Makromol Chem 190：69-82(1989)；Goldmacher V等，Bioconj Chem3：104-7(1992))。光可切割的接頭可以在連接組分以形成本發(fā)明的蛋白(其被設(shè)計成用于治療可以使用纖維光學(xué)暴露于光的疾病、病癥和病患)中具有特定用途。

在本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案中，使用任意數(shù)目的技術(shù)人員已知的方式，包括共價鍵和非共價鍵，將細(xì)胞靶向性結(jié)合區(qū)域連接至志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(參見例如Chen X等，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013)；Behrens C，Liu B，MAbs 6：46-53(2014)。

在本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案中，所述蛋白包含結(jié)合區(qū)域，所述結(jié)合區(qū)域是具有連接重鏈可變(V_H)結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變(V_L)結(jié)構(gòu)域的接頭的scFv。存在眾多本領(lǐng)域已知的適合用于此目的的接頭，諸如，例如，15-殘基(Gly4Ser)₃肽?？梢杂糜谛纬煞枪矁r多價結(jié)構(gòu)的合適的scFv接頭包括GGS，GGGS(Gly3Ser或G3S)，GGGGS(Gly4Ser或G4S)，GGGGSGGG，GGSGGGG，GSTSGGGSGGGSGGGGSS，和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(Plückthun A，Pack P，Immunotechnology 3：83-105(1997)；Atwell J等，Protein Eng 12：597-604(1999)；Wu A等，Protein Eng 14：1025-33(2001)；Yazaki P等，J Immunol Methods 253：195-208(2001)；Carmichael J等，JMol Biol 326：341-51(2003)；Arndt M等，F(xiàn)EBS Lett 578：257-61(2004)；Bie C等，World J Hepatol 2：185-91(2010))。

用于連接本發(fā)明的蛋白的組分的合適方法可以是通過目前本領(lǐng)域已知的用于實(shí)現(xiàn)該目的的任意方法，只要所述連接不會實(shí)質(zhì)上阻礙結(jié)合區(qū)的結(jié)合能力、蛋白的細(xì)胞內(nèi)在化和/或當(dāng)通過適當(dāng)測定(包括本文描述的測定)測量的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的期望的毒素效應(yīng)子功能即可。

II.本發(fā)明的蛋白的特異性結(jié)構(gòu)變化的實(shí)例

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含來源于免疫球蛋白型多肽的結(jié)合區(qū)，針對與癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表面抗原的特異性和高親和力結(jié)合選擇所述結(jié)合區(qū)，其中所述抗原在癌細(xì)胞中的表達(dá)是受限的(參見Glokler J等，Molecules 15：2478-90(2010)；Liu Y等，Lab Chip 9：1033-6(2009))。按照其他實(shí)施方案，所述結(jié)合區(qū)針對與癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表面抗原的特異性和高親和力結(jié)合進(jìn)行選擇，其中所述抗原較非癌癥細(xì)胞由癌細(xì)胞過表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)。一些代表性的靶標(biāo)生物分子包括，但不限于，下文列舉的與癌癥和/或特異性免疫細(xì)胞型相關(guān)的靶標(biāo)。

現(xiàn)有技術(shù)中存在許多種識別與癌細(xì)胞相關(guān)的表位的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，諸如靶向下述的結(jié)合區(qū)(括號中是備用名稱)：膜聯(lián)蛋白AI，B3黑素瘤抗原，B4黑素瘤抗原，CD2，CD3，CD4，CD20(B-淋巴細(xì)胞抗原蛋白CD20)，CD22，CD25(白介素-2受體IL2R)，CD30(TNFRSF8)，CD38(環(huán)形ADP核糖水解酶)，CD40，CD44(透明質(zhì)酸受體)，ITGAV(CD51)，CD66，CD71(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)，CD73，CD74(HLA-DR抗原-相關(guān)的不變鏈)，CD79，CD98，內(nèi)皮糖蛋白(END或CD105)，CD106(VCAM-1)，4型趨化因子受體(CDCR-4，融合素，CD184)，CD200，胰島素樣生長因子1受體(CD221)，粘蛋白1(MUC1，CD227)，基細(xì)胞粘附分子(B-CAM或CD239)，CD248(內(nèi)皮唾液酸蛋白或TEM1)，腫瘤壞死因子受體10b(TNFRSF10B，CD262)，腫瘤壞死因子受體13B(TNFRSF13B，TACI，CD276)，血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR，CD309)，上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM，CD326)，人表皮生長因子受體2(HER2/Neu/ErbB2/CD340)，癌癥抗原15-3(CA15-3)，癌癥抗原19-9(CA 19-9)，癌癥抗原125(CA125，MUC16)，CA242，癌胚抗原-相關(guān)的細(xì)胞粘附分子(例如，CEACAM3(CD66d)和CEACAM5)，癌胚抗原蛋白(CEA)，硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSP4，MCSP，NG2)，CTLA4，DLL4，表皮生長因子受體(EGFR/ErbB1)，葉酸受體(FOLR)，G-28，神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3，HLA-Dr10，HLA-DRB，人表皮生長因子受體1(HER1)，Ephrin型-B受體2(EphB2)，上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)，成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP/seprase)，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)，白介素2受體(IL-2R)，白介素6受體(IL-6R)，整聯(lián)蛋白α-V β-3(α_Vβ₃)，整聯(lián)蛋白α-V β-5(αvβ5)，整聯(lián)蛋白α-5 β-1(α₅β₁)，L6，MPG，黑素瘤-相關(guān)的抗原1蛋白(MAGE-1)，黑素瘤-相關(guān)的抗原3(MAGE-3)，mesothelin(MSLN)，MPG，MS4A，p21，p97，脊髓灰質(zhì)炎病毒受體-樣4(PVRL4)，蛋白酶-活化的-受體(諸如PAR1)，前列腺-特異性膜抗原蛋白(PSMA)，營養(yǎng)細(xì)胞糖蛋白(TPGB)，和腫瘤-相關(guān)的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(TACSTDs)(參見，例如，Lui B等，Cancer Res 64：704-10(2004)；Novellino L等，Cancer Immunol Immunother 54：187-207(2005)；Bagley R等，Int J Oncol 34：619-27(2009)；Gerber H等，mAbs 1：247-53(2009)；Beck A等，Nat Rev Immunol 10：345-52(2010)；Andersen J等，JBiol Chem 287：22927-37(2012)；Nolan-Stevaux O等，PLoS One 7：e50920(2012)；Rust S等，Mol Cancer 12：11(2013))。該靶標(biāo)生物分子的列表旨在是非限制性的。技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以使用任何與癌細(xì)胞或其他需要的細(xì)胞類型相關(guān)的靶標(biāo)生物分子來設(shè)計或選擇與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接的結(jié)合區(qū)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白。

與癌細(xì)胞強(qiáng)烈相關(guān)的并且具有已知與癌細(xì)胞結(jié)合的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的其他靶標(biāo)生物分子的實(shí)例包括BAGE蛋白(B黑素瘤抗原)，基細(xì)胞粘附分子(BCAMs或Lutheran血型糖蛋白)，膀胱腫瘤抗原(BTA)，睪丸癌抗原NY-ESO-1，睪丸癌抗原LAGE蛋白，CD19(B-淋巴細(xì)胞抗原蛋白CD19)，CD21(補(bǔ)體受體-2或補(bǔ)體3d受體)，CD26(二肽基肽酶-4，DPP4，或腺苷脫氨酶復(fù)合蛋白2)，CD33(唾液酸-結(jié)合免疫球蛋白-型凝集素-3)，CD52(CAMPATH-1抗原)，CD56(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子或NCAM)，CD133(prominin-1)，CS1(SLAM家族7號或SLAMF7)，細(xì)胞表面A33抗原蛋白(gpA33)，EB病毒抗原蛋白，GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤相關(guān)的癌癥/睪丸抗原)，肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR或c-Met)，MAGE蛋白，由T細(xì)胞1蛋白識別的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA，MARTI)，粘蛋白，優(yōu)先表達(dá)的黑素瘤抗原(PRAME)蛋白，前列腺特異性的抗原蛋白(PSA)，前列腺干細(xì)胞抗原蛋白(PSCA)，晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation Endroducts(RAGE))，腫瘤相關(guān)的糖蛋白72(TAG-72)，酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體(ROR1或NTRKR1)，血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFRs)，和腎母細(xì)胞瘤(Wilms’tumor)抗原。

其他與癌細(xì)胞強(qiáng)烈相關(guān)的靶標(biāo)生物分子的實(shí)例是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX)，Claudin蛋白(CLDN3，CLDN4)，蝶素(ephrin)型-A受體3(EphA3)，葉酸結(jié)合蛋白(FBP)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，胰島素樣生長因子受體，整聯(lián)蛋白(諸如CD11a-c)，核因子κ B的受體激活劑(RANK)，受體酪氨酸-蛋白激酶erB-3，腫瘤壞死因子受體10A(TRAIL-R1/DR4)，腫瘤壞死因子受體10B(TRAIL-R2)，生腱蛋白C，和CD64(FcγRI)(參見Hough C等，Cancer Res 60：6281-7(2000)；Thepen T等，Nat Biotechnol 18：48-51(2000)；Pastan I等，Nat Rev Cancer 6：559-65(2006)；Pastan，Annu Rev Med 58：221-37(2007)；Fitzgerald D等，Cancer Res 71：6300-9(2011)；Scott A等，Cancer Immun 12：14-22(2012))。該靶標(biāo)生物分子的列表旨在是非限制性的。

另外，存在所考慮的靶標(biāo)生物分子的多種其他的實(shí)例，諸如ADAM金屬蛋白酶(例如，ADAM-9，ADAM-10，ADAM-12，ADAM-15，ADAM-17)，ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ART1，ART4)，抗原F4/80，骨髓間質(zhì)抗原(BST1，BST2)，斷點(diǎn)簇區(qū)-c-abl癌基因(break point cluster region-c-abl oncogene(BCR-ABL))蛋白，C3aR(補(bǔ)體成分3a受體)，CD7，CD13，CD14，CD15(Lewis X或階段特異胚抗原1)，CD23(FC ε RII)，CD49d，CD53，CD54(細(xì)胞內(nèi)粘附分子1)，CD63(四跨膜蛋白(tetraspanin))，CD69，CD80，CD86，CD88(補(bǔ)體成分5a受體1)，CD115(集落刺激因子1受體)，CD123(白介素-3受體)，CD129(白介素9受體)，CD183(趨化因子受體CXCR3)，CD191(CCR1)，CD193(CCR3)，CD195(趨化因子受體CCR5)，CD203c，CD225(干擾素-誘導(dǎo)的跨膜蛋白1)，CD244(天然殺傷細(xì)胞受體2B4)，CD282(toll-樣受體2)，CD284(Toll-樣受體4)，CD294(GPR44)，CD305(白細(xì)胞-相關(guān)的免疫球蛋白-樣受體1)，蝶素型-A受體2(EphA2)，F(xiàn)ceRIa，半乳凝集素-9，甲胎蛋白抗原17-A1蛋白，人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羥化酶(HAAH)，，免疫球蛋白-樣轉(zhuǎn)錄物ILT-3，溶血磷脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1(LPGAT1/IAA0205)，溶酶體-相關(guān)的膜蛋白(LAMPs，諸如CD107)，黑素細(xì)胞蛋白PMEL(gp100)，骨髓-相關(guān)的蛋白-14(mrp-14)，程序性死亡配體1(PD-L1)，受體酪氨酸-蛋白激酶erbB-3，SART蛋白，清道夫受體(諸如CD64和CD68)，Siglecs(唾液酸-結(jié)合免疫球蛋白-型凝集素)，多配體聚糖(諸如SDC1或CD138)，酪氨酸酶，酪氨酸酶-相關(guān)的蛋白1(TRP-1)，酪氨酸酶-相關(guān)的蛋白2(TRP-2)，酪氨酸酶相關(guān)的抗原(TAA)，APO-3，BCMA，CD2，CD3，CD4，CD8，CD18，CD27，CD28，CD29，CD41，CD49，CD90，CD95(Fas)，CD103，CD104，CD134(OX40)，CD137(4-1BB)，CD152(CTLA-4)，趨化因子受體，補(bǔ)體蛋白，細(xì)胞因子受體，組織相容性蛋白，ICOS，白介素-α，白介素-β，c-myc，骨保護(hù)素，PD-1，RANK，TACI，TNF受體超家族成員(TNF-R1，TNFR-2)，Apo2/TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRAIL-R3，和TRAIL-R4(參見Scott A等，Cancer Immun 12：14(2012)；Cheever M等，Clin Cancer Res 15：5323-37(2009))，關(guān)于靶標(biāo)生物分子，并且注意本文所述的靶標(biāo)分子是非限制性的實(shí)例)。技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以使用任何需要的靶標(biāo)生物分子來設(shè)計或選擇要與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接的結(jié)合區(qū)，以產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白。

在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合區(qū)包含針對與免疫系統(tǒng)細(xì)胞類型的細(xì)胞表面的特異性和高親和力結(jié)合選擇的免疫球蛋白型多肽或基本上由其組成。例如，已知結(jié)合下述的免疫球蛋白型結(jié)合結(jié)構(gòu)域：CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD9，CD10，CD11，CD12，CD13，CD14，CD15，CD16，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD40，CD41，CD56，CD61，CD62，CD66，CD95，CD117，CD123，CD235，CD146，CD326，白介素-2受體(IL-2R)，核因子κ B的受體激活劑(RANKL)，SLAM-相關(guān)的蛋白(SAP)，和TNFSF18(腫瘤壞死因子配體18或GITRL)。

在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合區(qū)以高親和力結(jié)合靶標(biāo)生物分子，所述靶標(biāo)生物分子是選自下述的趨化因子受體：CXCR-1，CXCR-2，CXCR-3A，CXCR3B，CXCR-4，CXCR-5，CCR-I，CCR-2A，CCR-2B，CCR-3，CCR-4，CCR-5，CCR-6，CCR-7，CCR-8，CCR-9，CCR-10，CX3CR-1，XCR1，CXCR-6，CXCR-7，趨化因子結(jié)合蛋白-2(CCBP2，D6受體)，和Duffy抗原/趨化因子受體(DARC，F(xiàn)y糖蛋白，F(xiàn)Y，CD234)。對于更多非限制性的靶標(biāo)生物分子，參見下文實(shí)施例中的表11。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含含有SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸75-251或基本上由其組成的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。其他實(shí)施方案是這樣的蛋白，其中所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-241或基本上由其組成。其他實(shí)施方案是這樣的蛋白，其中所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-251或基本上由其組成。其他實(shí)施方案是這樣的蛋白，其中所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-261或基本上由其組成。

在某些實(shí)施方案中，所述蛋白包含含有SEQ ID NO：4的氨基酸269-508或基本上由其組成的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其展現(xiàn)特異性結(jié)合人CD38的高親和力。其他實(shí)施方案是包含SEQ ID NOs：4-7所示的任一種多肽或基本上由其組成的蛋白。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸269-512或基本上由其組成的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其展現(xiàn)特異性結(jié)合人HER2的高親和力。其他實(shí)施方案是包含SEQ ID NOs：8-11所示的任一種多肽或基本上由其組成的蛋白。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸269-516或基本上由其組成的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其展現(xiàn)特異性結(jié)合人CD19的高親和力。其他實(shí)施方案是包含SEQ ID NOs：12-15所示的任一種多肽或基本上由其組成的蛋白。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸269-518或基本上由其組成的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其展現(xiàn)特異性結(jié)合人CD74的高親和力。其他實(shí)施方案是包含SEQ ID NOs：16-19所示的任一種多肽或基本上由其組成的蛋白。

在本發(fā)明的蛋白的實(shí)施方案中，所述結(jié)合區(qū)是展現(xiàn)特異性結(jié)合HER2的高親和力的單結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白-來源區(qū)V_HH，諸如來源于駱駝科抗體(V_HH)蛋白5F7的單結(jié)構(gòu)域可變區(qū)，如在美國專利申請公布2011/0059090中所述。在某些其他實(shí)施方案中，所述蛋白包含含有SEQ ID NO：20的氨墓酸268-385或基本上由其組成的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其展現(xiàn)特異性結(jié)合人HER2的高親和力。其他實(shí)施方案是包含SEQ ID NOs：20-29所示的任一種多肽或基本上由其組成的蛋白。

在某些實(shí)施方案中，所述蛋白包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸269-365或基本上由其組成的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，其展現(xiàn)特異性結(jié)合人CD2的高親和力。其他實(shí)施方案是包含SEQ ID NOs：30-31所示的任一種多肽或基本上由其組成的蛋白。

如在本文中所使用的，術(shù)語“重鏈可變(V_H)結(jié)構(gòu)域”或“輕鏈可變(V_L)結(jié)構(gòu)域”分別是指任何抗體V_H或V_L結(jié)構(gòu)域(例如，人V_H或V_L結(jié)構(gòu)域)及其至少保持相應(yīng)天然抗體的定性抗原結(jié)合能力的任何衍生物(例如，源于天然鼠V_H或V_L結(jié)構(gòu)域的人源化V_H或V_L結(jié)構(gòu)域)。V_H或V_L，結(jié)構(gòu)域由被三個CDRs或ABRs中斷的“構(gòu)架”區(qū)組成。構(gòu)架區(qū)用于排列用于特異性結(jié)合抗原表位的CDRs。從氨基端到羧基端，V_H和V_L，結(jié)構(gòu)域二者均包含以下構(gòu)架(FR)和CDR區(qū)域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。對于駱駝科V_HH片段，軟骨魚的IgNARs，V_NAR片段，以及它們的衍生物，存在包含相同的基本排列的單一重鏈可變結(jié)構(gòu)域：FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4。

使用本發(fā)明的蛋白的多肽的片段、變體和/或衍生物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其包含功能性細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子結(jié)合位點(diǎn)，并且甚至更優(yōu)選地能夠以高親和力結(jié)合所述靶標(biāo)生物分子(例如，由K_D所示)。例如，盡管本發(fā)明提供了可以結(jié)合CD19、CD20、CD38、CD74和HER2的多肽序列，但是，任何包含以10^-5至10^-12摩爾/升、優(yōu)選小于200nM的解離常數(shù)結(jié)合表達(dá)在細(xì)胞表面上的細(xì)胞外CD38或HER2的多肽的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以替代用于制備本發(fā)明的蛋白和用于本發(fā)明的方法。

在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)來源于納米抗體或單結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白來源的區(qū)域V_HH。通常，納米抗體由在駱駝科動物和軟骨魚類(Chondrichthyes)中發(fā)現(xiàn)的種類的天然存在的單一、單體可變結(jié)構(gòu)域抗體(sdAbs)的片段構(gòu)建。通過截短單一、單體可變結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生較小和較穩(wěn)定的分子，由這些天然存在的抗體改造出納米抗體。由于它們的小尺寸，納米抗體能夠與不能接近整個抗體的抗原結(jié)合。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)來源于展現(xiàn)特異性結(jié)合人HER2蛋白的高親和力的納米抗體或單結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白來源的區(qū)域V_HH。

III.本發(fā)明的蛋白的一般功能

本發(fā)明提供多種蛋白，每種蛋白包含：1)用于細(xì)胞靶向的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)，和2)細(xì)胞毒性的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)。細(xì)胞靶向性免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)與志賀毒素亞基A來源的區(qū)域的連接能夠允許改造有效的志賀毒素細(xì)胞毒性的細(xì)胞型特異性靶向。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白能夠結(jié)合與特性細(xì)胞型的細(xì)胞表面相關(guān)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子并進(jìn)入這些細(xì)胞。一旦在被靶向的細(xì)胞型中內(nèi)在化，本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案能夠提供細(xì)胞毒性的志賀毒素效應(yīng)子多肽片段進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞溶膠的路徑。一旦在被靶向的細(xì)胞型的細(xì)胞溶膠中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的某些實(shí)施方案能夠酶促失活核糖體，干擾細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并最終殺傷細(xì)胞。該系統(tǒng)是模塊式的，原因在于可以使用任意數(shù)量的多樣性的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)使該有效的細(xì)胞毒性或白細(xì)胞淤積靶向多種多樣性的細(xì)胞型。備選地，本發(fā)明的蛋白的無毒變體可以用于將另外的外源物質(zhì)遞送到靶細(xì)胞內(nèi)，諸如，或檢測促進(jìn)劑，以標(biāo)記靶細(xì)胞內(nèi)部，用于診斷信息收集功能。

A.通過靶向的志賀毒素細(xì)胞毒性的細(xì)胞殺傷

由于志賀毒素家族的成員適合殺傷真核細(xì)胞，因此，使用志賀毒素效應(yīng)子區(qū)設(shè)計的細(xì)胞毒性蛋白可以表現(xiàn)出有效的細(xì)胞殺傷活性。志賀毒素家族的成員的A亞基包含能夠在進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中后殺傷真核細(xì)胞的酶結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的某些實(shí)施方案利用該細(xì)胞毒性機(jī)制，但是必須能夠使志賀毒素效應(yīng)子區(qū)進(jìn)入被靶向的細(xì)胞型的細(xì)胞溶膠中。改造的方向可能通過經(jīng)由志賀毒素效應(yīng)子區(qū)天然所有的功能改善向細(xì)胞溶膠的遞送而影響細(xì)胞毒性。

在本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的特定實(shí)施方案中，當(dāng)與本發(fā)明細(xì)胞毒性蛋白的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞接觸時，所述細(xì)胞毒性蛋白能夠引起該細(xì)胞的死亡。在不同的靶細(xì)胞條件下，諸如離體操作的靶細(xì)胞、體外培養(yǎng)的靶細(xì)胞、在體外培養(yǎng)的組織樣品內(nèi)的靶細(xì)胞或體內(nèi)靶細(xì)胞，使用本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺傷。

為了通過本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白進(jìn)行靶向的細(xì)胞殺傷，靶標(biāo)生物分子的表達(dá)不需要是天然的。靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞表面表達(dá)可以是感染、存在病原體和/或存在細(xì)胞內(nèi)微生物病原體的結(jié)果。靶標(biāo)生物分子的表達(dá)可以是人工的，諸如，例如，在用病毒表達(dá)載體感染后通過迫使或誘導(dǎo)表達(dá)，參見，例如，腺病毒、腺伴隨病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)。靶標(biāo)生物分子誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)例是暴露于類視黃醇(如全反視黃酸和各種合成的類視黃醇)或任意視黃酸受體(RAR)激動劑的細(xì)胞的CD38表達(dá)的上調(diào)(Drach J等，Cancer Res 54：1746-52(1994)；Uruno A等，J Leukoc Biol 90：235-47(2011))。在另一個實(shí)例中，可以通過使細(xì)胞暴露于電離輻射而誘導(dǎo)CD20、HER2和EGFR表達(dá)(Wattenberg M等，Br J Cancer 110：1472-80(2014))。

B.在多種細(xì)胞型之間的選擇性細(xì)胞毒性

通過利用高親和性免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)使酶活性志賀毒素區(qū)的遞送靶向特定細(xì)胞類型，該有效的細(xì)胞殺傷活性可以限制為優(yōu)先殺傷所選擇的細(xì)胞型。本發(fā)明提供多種具有這種功能能力的細(xì)胞毒性蛋白。

在某些實(shí)施方案中，在將本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白施用給細(xì)胞型的混合物后，所述細(xì)胞毒性蛋白能夠相對于沒有與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞類型選擇性地殺死與特定細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的那些細(xì)胞。因?yàn)橹举R毒素家族的多個成員適合用于殺傷真核細(xì)胞，使用志賀毒素效應(yīng)子區(qū)設(shè)計的細(xì)胞毒性蛋白可以顯示出有效的細(xì)胞毒性活性。通過使用高親和力結(jié)合區(qū)域?qū)⒚富钚缘闹举R毒素區(qū)域的遞送靶向特定細(xì)胞類型，該有效的細(xì)胞殺傷活性可以限于僅優(yōu)先殺死希望通過它們與被選擇的結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的靶標(biāo)生物分子的物理結(jié)合而靶向的那些細(xì)胞型。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白能夠選擇性地或優(yōu)先地造成兩個或更多個不同細(xì)胞型的混合物內(nèi)的特定細(xì)胞型的死亡。這能夠?qū)崿F(xiàn)與不表達(dá)靶標(biāo)生物分子的“旁觀”細(xì)胞類型相比高優(yōu)先的對特定細(xì)胞類型的細(xì)胞毒性活性靶向，諸如3倍細(xì)胞毒性效應(yīng)。備選地，如果靶標(biāo)生物分子以足夠低的量表達(dá)和/或以低量與不靶向的細(xì)胞型物理連接，則結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子的表達(dá)可以不專屬于一種細(xì)胞類型。這允許相對于不表達(dá)顯著量的靶標(biāo)生物分子或不與顯著量的靶標(biāo)生物分子物理連接的“旁觀”細(xì)胞類型以高優(yōu)先性(諸如3-倍的細(xì)胞毒性作用)進(jìn)行特定細(xì)胞類型的靶向性細(xì)胞殺傷。

細(xì)胞表面上細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的水平可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法確定，諸如例如，F(xiàn)ACS法。用于本文時，通過FACS分析，在細(xì)胞表面上表達(dá)的顯著量的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子大于10,000，20,000，30,000，40,000，50,000，60,000，或70,000平均熒光強(qiáng)度(MFI)，這取決于細(xì)胞類型。

在某些其它實(shí)施方案中，在將細(xì)胞毒性蛋白施用給兩個關(guān)于細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的存在和/或多肽序列不同的細(xì)胞型群體后，細(xì)胞毒性蛋白能夠造成細(xì)胞死亡，如通過關(guān)于靶細(xì)胞群體(其成員表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子)的半數(shù)最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)所確定的，例如，其劑量比相同細(xì)胞毒性蛋白對于其成員不表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞群體的CD₅₀劑量低至少3倍。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白對與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的群體的細(xì)胞毒性活性比對沒有與本發(fā)明的蛋白特異性結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型群體的細(xì)胞毒性活性至少3倍高。根據(jù)本發(fā)明，可以以下述比率(a/b)的方式定量選擇性的細(xì)胞毒性：(a)對與結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子物理連接的特定細(xì)胞型的細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性：(b)對沒有與結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性比率指示，相對于沒有與結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞群體或細(xì)胞型，對與結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞群體或細(xì)胞型的選擇性的細(xì)胞毒性至少3倍高、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍。

該優(yōu)先細(xì)胞殺傷功能允許本發(fā)明的某些細(xì)胞毒性蛋白在不同條件下和在有非靶向的旁觀細(xì)胞(諸如離體操作的細(xì)胞型的混合物、體外培養(yǎng)的含有細(xì)胞型混合物的組織)存在下、或在體內(nèi)在有多個細(xì)胞型存在下(例如原位或在多細(xì)胞生物體內(nèi)的天然位置)殺傷被靶向的細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白能夠選擇性地或優(yōu)先地造成兩個或更多個不同細(xì)胞型的混合物內(nèi)的特定細(xì)胞型的死亡。這能夠?qū)崿F(xiàn)與不表達(dá)被本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)的“旁觀”細(xì)胞類型相比高優(yōu)先的對特定細(xì)胞類型的靶向細(xì)胞毒性活性，諸如3倍細(xì)胞毒性效應(yīng)。備選地，如果細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子以足夠低的量被不靶向的細(xì)胞型表達(dá)，則細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的表達(dá)可以不專屬于一種細(xì)胞類型。這允許相對于不表達(dá)顯著量的被所述細(xì)胞毒性蛋白特異性結(jié)合的靶標(biāo)生物分子和/或不與顯著量的被所述細(xì)胞毒性蛋白特異性結(jié)合的細(xì)胞外暴露的靶標(biāo)生物分子物理連接的“旁觀”細(xì)胞類型僅對表達(dá)最高量的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的那些細(xì)胞型的優(yōu)先的細(xì)胞殺傷殺傷(諸如3-倍的細(xì)胞毒性作用)。

本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白可用于消除特定細(xì)胞型群體。例如，本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白可用于通過消除在一個或多個細(xì)胞表面表達(dá)升高水平的靶標(biāo)生物分子的“靶標(biāo)生物分子+”細(xì)胞而治療某些腫瘤、癌癥和/或其他生長異常。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白針對于特定細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性活性比對沒有與顯著量的被本發(fā)明的特定蛋白的結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型群體的細(xì)胞毒性活性至少3倍高。根據(jù)本發(fā)明，可以以下述比率(a/b)的方式定量選擇性的細(xì)胞毒性：(a)對與顯著量的被本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白結(jié)合區(qū)結(jié)合的靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性：(b)對沒有與顯著量的被本發(fā)明所述細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的任何細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性比率指示，相對于部表達(dá)細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子或沒有與顯著量的被本發(fā)明的特定細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞群體或細(xì)胞型，對表達(dá)細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子或與被本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞群體或細(xì)胞型的選擇性的細(xì)胞毒性至少3倍高、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更高。例如，在將本發(fā)明的某些細(xì)胞毒性蛋白施用給兩個關(guān)于細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的存在和/或多肽序列不同的不同細(xì)胞型群體后，本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白能夠造成與被所述細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的細(xì)胞死亡，例如，與沒有與被細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的結(jié)合的CD₅₀或與僅與包含破壞所述細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)的結(jié)合特異性的序列變異或突變的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞型的結(jié)合的CD₅₀相比，其CD₅₀是至少3倍或更低。

在本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的某些實(shí)施方案中，在將細(xì)胞毒性蛋白施用給兩個不同的細(xì)胞型群體后，細(xì)胞毒性蛋白能夠造成細(xì)胞死亡，如通過關(guān)于第一細(xì)胞群體(其成員在細(xì)胞表面表達(dá)特定細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子)的半數(shù)最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)所確定的，其劑量比相同細(xì)胞毒性蛋白對于其成員不表達(dá)靶標(biāo)生物分子、不表達(dá)顯著量的靶標(biāo)生物分子、或不暴露被所述細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合區(qū)結(jié)合的靶標(biāo)生物分子的第二細(xì)胞群體的CD₅₀劑量低至少3倍。

C.另外的外源物質(zhì)向靶細(xì)胞內(nèi)部的遞送

除了直接的細(xì)胞殺傷以外，本發(fā)明的蛋白任選地可以用于將另外的外源物質(zhì)遞送至靶細(xì)胞內(nèi)部。另外的外源物質(zhì)的遞送可以用于，流入，細(xì)胞抑制、信息收集和/或診斷功能。本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的無毒變體、或任選地毒性變體，可以利用與將另外的外源物質(zhì)遞送至于本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞和/或標(biāo)記所述細(xì)胞的內(nèi)部。在至少一個細(xì)胞表面表達(dá)靶標(biāo)生物分子的多種細(xì)胞型和/或細(xì)胞群體可以被本發(fā)明的蛋白靶向，用于接受外源物質(zhì)。本發(fā)明的功能組分是模塊式的，原因在于多種志賀毒素效應(yīng)子區(qū)和另外的外源物質(zhì)可以與多種結(jié)合區(qū)連接，以提供多樣性的應(yīng)用，諸如腫瘤細(xì)胞的非侵入性體內(nèi)成像。

因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白(不管是其有毒還是無毒的及沒有催化活性的形式)能夠進(jìn)入與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子(其被本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)識別)物理連接的細(xì)胞中，本發(fā)明的蛋白的某些實(shí)施方案可以用于將另外的外源物質(zhì)遞送進(jìn)被靶向的細(xì)胞型的內(nèi)部。在一個意義上，本發(fā)明的整個蛋白是進(jìn)入細(xì)胞的外源物質(zhì)；因而，“另外的”外源物質(zhì)是與核心蛋白本身連接、但是除此以外的異源物質(zhì)。

本文中使用的“另外的外源物質(zhì)”表示一個或多個分子，其經(jīng)常是通常不存在于天然靶細(xì)胞內(nèi)，其中本發(fā)明的蛋白可以用于特異性地將這樣的物質(zhì)運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)部。另外的外源物質(zhì)的非限制性例子是細(xì)胞毒性試劑、肽、多肽、蛋白、多核苷酸、檢測促進(jìn)劑和小分子化學(xué)治療劑。

在本發(fā)明用于遞送另外的外源物質(zhì)的蛋白的某些實(shí)施方案中，所述另外的外源物質(zhì)是細(xì)胞毒性試劑，諸如，例如，小分子化學(xué)治療劑，細(xì)胞毒性抗生素、烷基化試劑、抗代謝物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或微管蛋白抑制劑。細(xì)胞毒性試劑的非限制性實(shí)例包括氮丙啶(aziridines)，順鉑(cisplatins)，四嗪(tetrazines)，丙卡巴肼(procarbazine)，六甲蜜胺(hexamethylmelamine)，長春花生物堿(vinca alkaloids)，紫杉烷(taxanes)，喜樹堿(camptothecins)，依托泊苷(etoposide)，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，替尼泊苷(teniposide)，新生霉素(novobiocin)，阿柔比星(aclarubicin)，蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)，放線菌素(actinomycin)，博來霉素(bleomycin)，普利霉素(plicamycin)，絲裂霉素(mitomycin)，柔紅霉素(daunorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，多拉司他汀(dolastatins)，美坦辛(maytansines)，多西他賽(docetaxel)，阿霉素(adriamycin)，加利車霉素(calicheamicin)，阿里他汀(auristatins)，吡咯并苯并二氮雜(pyrrolobenzodiazepine)，卡鉑(carboplatin)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)，卡培他濱(capecitabine)，絲裂霉素C(mitomycin C)，紫杉酚(paclitaxel)，1，3-二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)，利福平(rifampicin)，順鉑(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)和吉西他濱(gemcitabine)。

在某些實(shí)施方案中，所述另外的外源物質(zhì)包含含有酶的蛋白或多肽。在某些其它實(shí)施方案中，所述另外的外源物質(zhì)是核酸，例如，作為小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些實(shí)施方案中，所述另外的外源物質(zhì)是抗原，諸如從細(xì)菌蛋白、病毒蛋白、在癌癥中突變的蛋白、在癌癥中異常表達(dá)的蛋白、或T-細(xì)胞互補(bǔ)決定區(qū)來源的抗原。例如，外源物質(zhì)包括抗原，諸如被細(xì)菌感染的抗原呈遞細(xì)胞特有的那些抗原，和能夠作為外源抗原起作用的T-細(xì)胞互補(bǔ)決定區(qū)。

D.用于診斷功能的信息收集

本發(fā)明的某些蛋白用在特定細(xì)胞、細(xì)胞型和/或細(xì)胞群體的體外和/或體內(nèi)檢測中。在某些實(shí)施方案中，本文描述的細(xì)胞毒性蛋白用于診斷和治療二者，或僅用于診斷。當(dāng)相同細(xì)胞毒性蛋白用于診斷和治療二者時，通過一個或多個氨基酸置換(包括本文描述的示例性置換)對志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的催化滅活，可以使包含用于診斷的檢測促進(jìn)劑的細(xì)胞毒性蛋白變體無毒。與檢測促進(jìn)劑綴合的、本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白的無毒形式任選地可以用于診斷功能，諸如用于與包含相同或相關(guān)結(jié)合區(qū)域的治療方案聯(lián)合使用的伴侶診斷。

將本領(lǐng)域已知的檢測促進(jìn)劑與本發(fā)明的各種蛋白綴合的能力會提供用于檢測癌癥、腫瘤、免疫和被感染的細(xì)胞的有用組合物。通過本領(lǐng)域已知的各種成像技術(shù)和測定，本發(fā)明的蛋白的這些診斷實(shí)施方案可以用于信息收集。例如，通過患者或活組織檢查樣品中各個癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞或受感染的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(例如內(nèi)吞區(qū)室、高爾基區(qū)室、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)室和細(xì)胞溶質(zhì)區(qū)室)的成像，本發(fā)明的蛋白的診斷實(shí)施方案可以用于信息收集。

使用本發(fā)明的蛋白的診斷實(shí)施方案可以收集不同類型的信息，無論用于診斷用途還是其它用途。該信息可用于，例如，診斷贅生性細(xì)胞類型，確定患者的疾病的治療敏感性，測定抗腫瘤治療隨時間的進(jìn)展，測定免疫調(diào)節(jié)治療隨時間的進(jìn)展，測定抗微生物治療隨時間的進(jìn)展，評價受感染的細(xì)胞在移植物中的存在，評價不希望的細(xì)胞類型在移植物中的存在，和/或評價腫瘤塊的外科手術(shù)切除以后殘余腫瘤細(xì)胞的存在。

例如，使用用本發(fā)明的蛋白的診斷變體收集的信息，可能確定患者亞群，然后可以基于使用那些診斷實(shí)施方案揭示的他們的獨(dú)特特征將各個患者分類成亞群。例如，特定藥物或治療的有效性可能是用于定義患者亞群的一類判據(jù)。例如，可以使用本發(fā)明的特定細(xì)胞毒性蛋白的無毒診斷變體區(qū)分哪些患者屬于預(yù)期對本發(fā)明的相同蛋白的細(xì)胞毒性變體做出陽性應(yīng)答的患者的類別或亞群。因此，使用本發(fā)明的蛋白和/或它們的無毒變體進(jìn)行患者鑒別、患者分級和診斷的有關(guān)方法被認(rèn)為是在本發(fā)明范圍內(nèi)。

IV.保持整體結(jié)構(gòu)和功能的本發(fā)明蛋白的多肽序列中的變異

技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以對本發(fā)明的蛋白(和編碼其的多核苷酸)做出變化，而不減少它們的生物活性，例如，通過維持本發(fā)明的蛋白的整體結(jié)構(gòu)和功能。例如，有些修飾可以促進(jìn)表達(dá)、純化、藥代動力學(xué)性能和/或免疫原性。這樣的修飾是技術(shù)人員眾所周知的，且包括，例如，將甲硫氨酸添加在氨基端以提供起始位點(diǎn)，將另外的氨基酸放置在任一端上以產(chǎn)生方便地定位的限制位點(diǎn)或終止密碼子，和使生化親和標(biāo)簽與任一端融合以提供方便的檢測和/或純化。

在本文中還預(yù)見到在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸殘基，諸如表位標(biāo)簽或其它結(jié)構(gòu)部分的序列。所述另外的氨基酸殘基可以用于多種目的，包括，例如，促進(jìn)克隆、表達(dá)、翻譯后修飾、合成、純化，檢測和施用。表位標(biāo)簽和結(jié)構(gòu)部分的非限制性例子是：殼多糖(chitin)結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、腸肽酶切割位點(diǎn)、因子Xa切割位點(diǎn)、FIAsH標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)部分、HA標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、myc標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、ReAsH標(biāo)簽、strep-標(biāo)簽、strep-標(biāo)簽II、TEV蛋白酶位點(diǎn)、硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域、凝血酶切割位點(diǎn)和V5表位標(biāo)簽。

在某些以上實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白是存在引入多肽區(qū)中的一個或多個保守氨基酸置換的變體。本文中使用的術(shù)語“保守置換”表示，一個或多個氨基酸被另一個生物學(xué)上相似的氨基酸殘基替換。例子包括具有相似特征的氨基酸殘基(例如小氨基酸、酸性氨基酸、極性氨基酸、堿性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的置換(參見，例如，下表B)。使用通常不存在于內(nèi)源哺乳動物肽和蛋白中的殘基的保守置換的一個例子是利用例如鳥氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一種堿性氨基酸對精氨酸或賴氨酸殘基的保守置換。關(guān)于與肽和蛋白中表型上沉默的置換相關(guān)的其它信息，參見，例如，Bowie J等，Science 247：1306-10(1990)。

在下表B的保守置換方案中，示例性的保守氨基酸置換根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分組——I：中性的、親水的；II：酸和酰胺；III：堿性的；IV：疏水的；V：芳族的、龐大氨基酸，VI親水的、不帶電荷的，VII脂族不帶電荷的，VIII非極性的不帶電荷的，IX環(huán)烯基相關(guān)的、X疏水的，XI極性的，XII小的，XIII允許旋轉(zhuǎn)的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置換包括以下的：1)S可以置換C；2)M或L可以置換F；3)Y可以置換M；4)Q或E可以置換K；5)N或Q可以置換H；和6)H可以置換N。

表B.保守氨基酸置換的實(shí)例

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白可以包含本發(fā)明的多肽區(qū)域的功能片段或變體，與本文引用的多肽序列相比，所述功能片段或變體最多具有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸置換，只要被置換的多肽區(qū)域單獨(dú)地或作為本發(fā)明的蛋白的組分保留可測量的生物學(xué)活性即可。作為通過下述改變本發(fā)明的蛋白的多肽的結(jié)果，本發(fā)明的蛋白的變體是在本發(fā)明范圍內(nèi)：改變一個或多個氨基酸或刪除或插入一個或多個氨基酸(諸如在免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)或志賀毒素效應(yīng)子區(qū)內(nèi))，以便實(shí)現(xiàn)期望的性能，諸如改變的細(xì)胞毒性、改變的細(xì)胞生長抑制作用、改變的免疫原性和/或改變的血清半衰期。本發(fā)明的蛋白的多肽還可以具有或沒有信號序列。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白與本文引用的蛋白的氨基酸序列中的任一個具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，只要其保持可測量的生物活性如細(xì)胞毒性、細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子結(jié)合、酶催化、或亞細(xì)胞按路線發(fā)送即可。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)可以與在本文中敘述的蛋白的氨基酸序列不同，只要其保持與其細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的結(jié)合功能即可。如果CDRs或ABRs的氨基酸序列相同，則將最有可能保持結(jié)合功能。例如，在權(quán)利要求范圍內(nèi)的是包含與本文所述的蛋白具有85％氨基酸同一性或基本上由其組成的蛋白，其中出于確定氨基酸同一性程度的目的而忽略形成CDRs或ABRs的氨基酸殘基。結(jié)合功能可以由技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。

在某些實(shí)施方案中，可以改變志賀毒素效應(yīng)子區(qū)以改變其酶活性和/或細(xì)胞毒性，只要所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)保留抑制或多種另外的志賀毒素效應(yīng)子功能。這種改變可以或可以不引起改變的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)是其中的組分的蛋白的細(xì)胞毒性的改變?？赡艿母淖儼ㄖ举R毒素效應(yīng)子區(qū)的選自由下列各項(xiàng)組成的組的突變：截短、缺失、倒置、插入、重排和置換。

可以通過突變或截短來改變、減少或消除志賀毒素家族成員的A亞基的細(xì)胞毒性。已經(jīng)證明標(biāo)記為酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置對于Stx、Stx1、和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等，Proc Natl Acad Sci USA 85：2568-72(1988)；Deresiewicz R等，Biochemistry 31：3272-80(1992)；Deresiewicz R等，Mol Gen Genet 241：467-73(1993)；Ohmura M等，Microb Pathog 15：169-76(1993)；Cao C等，Microbiol Immunol 38：441-7(1994)；Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。在無細(xì)胞核糖體失活測定中將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變消除了Slt-I A1的酶活性(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。在利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Slt-I A1的從頭表達(dá)的另一種方法中，將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變在所述表達(dá)水平上消除了Slt-I A1片段細(xì)胞毒性(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。截短分析表明，殘基75至268的StxA的片段在體外仍然保持明顯的酶活性(Haddad，J Bacteriol 175：4970-8(1993))。通過細(xì)胞溶膠中的從頭表達(dá)，含有殘基1-239的Slt-I A1的截短片段顯示出明顯的體外酶活性和細(xì)胞毒性(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。截短至殘基1-239的Slt-I A1片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達(dá)不是細(xì)胞毒性的，因?yàn)槠洳荒苣嬉莆坏郊?xì)胞溶膠中(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。

志賀毒素A亞基中對酶活性和/或細(xì)胞毒性最重要的殘基被繪圖定位至以下殘基位置：特別是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176(Di，Toxicon 57：535-39(2011))。尤其是，含有谷氨酸-E167到賴氨酸和精氨酸-176到賴氨酸突變的Stx2A的雙突變構(gòu)建體完全失活；而Stx1和Stx2中的許多單一突變顯示出細(xì)胞毒性的10倍降低。此外，截短Stx1A至1-239或1-240降低了其細(xì)胞毒性，并且類似地，截短Stx2A至保守疏水殘基降低了其細(xì)胞毒性。

志賀毒素A亞基中對結(jié)合真核核糖體和/或真核核糖體抑制最重要的殘基被繪圖定位至以下殘基位置：特別是精氨酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、纈氨酸-191和亮氨酸-233(McCluskey A等，PLoS One 7：e31191(2012)。

志賀樣毒素1A亞基截短是具有催化活性的，能夠在體外使核糖體酶促失活，并且當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時是具有細(xì)胞毒性的(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。展現(xiàn)出完全酶活性的最小志賀毒素A亞基片段是由Slt1A的殘基1-239組成的多肽(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。盡管報道的保持基本催化活性的志賀毒素A亞基的最小片段是StxA的殘基75-247(Al-Jaufy，Infect Immun 62：956-60(1994))，在真核細(xì)胞內(nèi)從頭表達(dá)的StxA截短僅需要至多殘基240以到達(dá)細(xì)胞溶膠并且進(jìn)行核糖體的催化失活(LaPointe，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。

在來源于SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2)的某些實(shí)施方案中，這些改變包括位置75處的天冬酰胺、位置77處的酪氨酸、位置114處的酪氨酸、位置167處的天冬氨酸、位置170處的精氨酸、位置176處的精氨酸的置換，和/或位置203處的色氨酸的置換。對于技術(shù)人員來說，基于現(xiàn)有技術(shù)，這種置換的實(shí)例將會是已知的，如位置75處的天冬酰胺變?yōu)楸彼?、位?7處的酪氨酸變?yōu)榻z氨酸、位置114處的酪氨酸變?yōu)榻z氨酸的置換、位置167處的谷氨酰胺變?yōu)樘於彼岬闹脫Q、位置170處的精氨酸變?yōu)楸彼岬闹脫Q、位置176處的精氨酸變?yōu)橘嚢彼岬闹脫Q、和/或位置203處的色氨酸變?yōu)楸彼岬闹脫Q。

本發(fā)明的蛋白可以任選地與一種或多種另外的藥劑綴合，所述另外的藥劑可以包括本領(lǐng)域中已知的治療劑和/或診斷劑，包括本文所述的此類試劑。

V.本發(fā)明的蛋白的生產(chǎn)、制造和純化

本發(fā)明的蛋白可以使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說公知的生物化學(xué)工程技術(shù)生產(chǎn)。例如，本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成方法、利用重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，或者通過任何其他適合的方法生產(chǎn)。本發(fā)明的蛋白可以作為融合蛋白、化學(xué)連接的綴合物和/或它們的組合(例如，與一種或多種組分共價連接的融合蛋白組分)生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的蛋白可以以多種方式合成，包括，例如包括下列各項(xiàng)的方法：(1)使用標(biāo)準(zhǔn)固相或液相方法、分步地或通過片段組裝來合成本發(fā)明的蛋白的多肽或多肽組分，并且將最終的肽化合物產(chǎn)物分離并純化；(2)在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼本發(fā)明的蛋白的多肽或多肽組分的多核苷酸并且從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收表達(dá)產(chǎn)物；或(3)進(jìn)行編碼本發(fā)明的蛋白的多肽或多肽組分的多核苷酸的無細(xì)胞體外表達(dá)，并且回收表達(dá)產(chǎn)物；或者通過方法(1)、(2)或(3)的任意組合以獲得肽組分的片段，隨后將片段結(jié)合(例如連接(ligating))以獲得肽組分，并且回收肽組分。

可以優(yōu)選通過固相或液相肽合成來合成本發(fā)明的蛋白的多肽或多肽組分。本發(fā)明的蛋白可以適合地通過標(biāo)準(zhǔn)合成方法生產(chǎn)。因此，可以通過例如這樣的方法來合成肽，所述方法包括通過標(biāo)準(zhǔn)固相或液相方法、分步地或通過片段組裝來合成肽，并且將最終的肽產(chǎn)物分離并純化。在該情形中，可以參考WO 1998/11125，或尤其是Fields G等，Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides，Grant G，ed.，Oxford University Press，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成實(shí)例。

本發(fā)明的蛋白可以使用在本領(lǐng)域內(nèi)公知的重組技術(shù)制備(生產(chǎn)和純化)。通常，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有包含編碼多核苷酸的載體的宿主細(xì)胞并且從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽來制備多肽的方法被描述于，例如Sambrook J等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，U.S.，1989)；Dieffenbach C等，PCR Primer：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，U.S.，1995)。任何適合的宿主細(xì)胞均可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。宿主細(xì)胞可以是用一種或多種驅(qū)動本發(fā)明的多肽表達(dá)的表達(dá)載體穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的細(xì)胞。此外，可以通過修飾編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸來生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白，這導(dǎo)致改變一個或多個氨基酸或者缺失或插入一個或多個氨基酸，以便實(shí)現(xiàn)所需性質(zhì)，如改變的細(xì)胞毒性、改變的細(xì)胞生長抑制作用、改變的免疫原性和/或改變的血清半衰期。

存在寬泛種類的可以選擇用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。例如，用于表達(dá)本發(fā)明的蛋白的宿主生物體包括原核生物，諸如大腸桿菌和芽胞枯草桿菌(B.subtilis)，真核細(xì)胞，諸如酵母和絲狀真菌(如釀酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克魯維酵母(K.lactis))，藻類(如衣藻(C.reinhardtii))，昆蟲細(xì)胞系，哺乳動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)，植物細(xì)胞系，和真核生物體，如轉(zhuǎn)基因植物(如擬南芥(A.thaliana)和本生煙草(N.benthamiana))。

因此，本發(fā)明還提供用于根據(jù)以上所述方法并且使用下述來生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法：(i)編碼本發(fā)明的蛋白或其多肽組分的部分或全部的多核苷酸，(ii)包含當(dāng)被引入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中或不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中時能夠編碼本發(fā)明的蛋白或其多肽組分的部分或全部的本發(fā)明的至少一種多核苷酸的表達(dá)載體，和/或(iii)包含本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

當(dāng)使用重組技術(shù)在宿主細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)多肽或蛋白時，有利的是從其他組分如宿主細(xì)胞因子中分離(或純化)所需的多肽或蛋白，從而獲得高純度的或基本均質(zhì)的制劑。純化可以通過在本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法完成，如離心技術(shù)，提取技術(shù)，層析和分餾技術(shù)(例如，通過凝膠過濾的尺寸分離、通過離子交換柱的電荷分離、疏水相互作用層析法、反相層析法、在二氧化硅或陽離子交換樹脂如DEAE等上的層析法、層析聚焦、和蛋白A瓊脂糖層析法，以用于去除污染物)，以及沉淀技術(shù)(例如乙醇沉淀或硫酸銨沉淀。任何數(shù)量的生物化學(xué)純化技術(shù)均可以用于增加本發(fā)明的蛋白的純度。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白可以任選地以同型多聚體形式(即，兩個以上相同蛋白的蛋白復(fù)合物)或異型多聚體形式(即，兩個以上不同的蛋白的蛋白復(fù)合物)純化。

在以下實(shí)施例中的是對用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法的非限制性實(shí)例的描述，以及公開的示例性細(xì)胞毒性蛋白的蛋白制備的具體但非限制性的方面。

VI.包含本發(fā)明的蛋白的藥物和診斷組合物

本發(fā)明提供這樣的蛋白，其用于單獨(dú)地或在藥物組合物中與一種或多種另外的治療劑組合地用于治療或預(yù)防以下更詳細(xì)描述的病患、疾病、病癥、或癥狀(例如癌癥、惡性腫瘤、非惡性腫瘤、生長異常、免疫病癥和微生物感染)。本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的蛋白或其根據(jù)本發(fā)明的藥用鹽或溶劑化物，以及至少一種藥用載體、賦形劑、或載體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以包含本發(fā)明的蛋白的同型多聚體和/或異型多聚體形式。所述藥物組合物將可用于治療、改善、或預(yù)防以下更詳細(xì)描述的疾病、病患、病癥、或癥狀的方法。預(yù)期各個這樣的疾病、病患、病癥、或癥狀均為就本發(fā)明所述的藥物組合物的用途而言的單獨(dú)的實(shí)施方案。本發(fā)明還提供用于至少一種如以下更詳細(xì)描述的本發(fā)明所述的治療方法的藥物組合物。

如在本文中所使用的，術(shù)語“患者”和“受試者”可互換使用，以指代任何生物，通常是脊椎動物如人和動物，其表現(xiàn)出至少一種疾病、病癥、或病患的癥狀、征兆、和/或指征。這些術(shù)語包括哺乳動物如靈長類動物、家畜動物(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、寵物(例如貓、狗等)以及實(shí)驗(yàn)動物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性實(shí)例。

如在本文中所使用的，“治療(treat)”、“治療(treating)”、或“治療(treatment)”以及它們的語法變體是指用于獲得有益或所需的臨床結(jié)果的方法。該術(shù)語可以指延緩病患、病癥或疾病的發(fā)病或發(fā)展速度，減輕或緩解與其有關(guān)的癥狀，產(chǎn)生病患的全部或部分消退，或者以上任何的一些組合。對于本發(fā)明的目的來說，有益或所需的臨床結(jié)果包括，但不限于，無論是否是可檢測的或不可檢測的，癥狀的減輕或緩解、疾病程度降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(例如不惡化)、疾病發(fā)展的推遲或延緩、疾病狀態(tài)的改善或緩和、以及康復(fù)(無論是部分的或全部的)?！爸委?treat)”、“治療(treating)”、或“治療(treatment)”還可以意指相對于在不接受治療的情況下的預(yù)期存活時間延長存活。需要治療的受試者(例如人)因此可以是已經(jīng)遭受所討論的疾病或病癥折磨的受試者。術(shù)語“治療(treat)”、“治療(treating)”、或“治療(treatment)”包括相對于不存在治療的情況抑制或減輕病理狀態(tài)或癥狀的嚴(yán)重性的增加，并且并非必須意指暗示相關(guān)疾病、病癥、或病患完全停止。關(guān)于腫瘤和/或癌癥，治療包括整體腫瘤負(fù)擔(dān)和/或個體腫瘤尺寸的減小。

如在本文中所使用的，術(shù)語“防止(prevent)”、“預(yù)防(preventing)”、“預(yù)防(prevention)”以及它們的語法變體是指用于預(yù)防病患、疾病、或病癥的發(fā)展或者改變病患、疾病、或病癥的病理學(xué)的方法。因此，“預(yù)防”可以指預(yù)防或防止的措施。對于本發(fā)明的目的來說，有益或所需的臨床結(jié)果包括，但不限于，無論是否是可檢測的或不可檢測的，預(yù)防或延緩疾病的癥狀、進(jìn)展或發(fā)展。需要預(yù)防的受試者(例如人)因此可以是尚未遭受所討論的疾病或病癥折磨的受試者。術(shù)語“預(yù)防”包括相對于不存在治療的情況延緩疾病的發(fā)病，并且并非必須意指暗示相關(guān)疾病、病癥、或病患的永久性預(yù)防。因此在某些情形中病患的“預(yù)防(preventing)”或“預(yù)防(prevention)”可以是指降低發(fā)展病患的風(fēng)險，或者預(yù)防或推遲與該病患有關(guān)的癥狀的發(fā)展。

如在本文中所使用的，“有效量”或“治療有效量”是在受試者中產(chǎn)生至少一種所需治療效果的組合物(例如治療組合物或藥劑)的量或劑量，如預(yù)防或治療目標(biāo)病患或有益地緩解與該病患有關(guān)的癥狀。最合乎需要的治療有效量是將會產(chǎn)生由本領(lǐng)域技術(shù)人員為需要其的給定受試者選擇的具體治療的所需功效的量。這種量將會根據(jù)各種技術(shù)人員理解的因素變化，包括但不限于，治療性化合物的特性(包括活性、藥物動力學(xué)、藥效學(xué)、和生物利用度)，受試者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型、疾病階段、總體身體狀況、對給定劑量的響應(yīng)性、和藥物的類型)，藥用載體或制劑中載體的性質(zhì)，以及給藥途徑。臨床和藥理學(xué)技術(shù)的人員將能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定治療有效量，即通過監(jiān)測受試者對施用化合物的響應(yīng)并且相應(yīng)地調(diào)節(jié)劑量(參見，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，U.S.，第19版，1995))。

本發(fā)明的診斷組合物包含本發(fā)明的蛋白和一個或多個檢測促進(jìn)劑。各種檢測促進(jìn)劑是本領(lǐng)域已知的，諸如同位素、染料、比色測量劑、反差增強(qiáng)劑、熒光劑、生物發(fā)光劑和磁性劑。這些試劑可以在任何位置摻入本發(fā)明的蛋白中。所述試劑的摻入可以是通過本發(fā)明的蛋白的氨基酸殘基或通過本領(lǐng)域已知的一些連接類型，包括通過接頭和/或螯合劑。所述試劑的摻入是以這樣的方式：能夠在篩選、測定、診斷操作和/或成像技術(shù)中檢測診斷組合物的存在。

當(dāng)生產(chǎn)或制備本發(fā)明的診斷組合物時，本發(fā)明的蛋白可以直接地或間接地連接至一個或多個檢測促進(jìn)劑。存在技術(shù)人員已知的眾多檢測促進(jìn)劑，它們可以可操作地連接至本發(fā)明的蛋白用于信息收集方法，諸如用于針對生物體的疾病、病癥或病患的診斷和/或預(yù)后應(yīng)用(參見例如Cai W等，J Nucl Med 48：304-10(2007)；Nayak T，Brechbiel M，Bioconjug Chem 20：825-41(2009)；Paudyal P等，Oncol Rep 22：115-9(2009)；Qiao J等，PLoS ONE 6：e18103(2011)；Sano K等，Breast Cancer Res 14：R61(2012))。例如，檢測促進(jìn)劑包括增強(qiáng)圖像的造影劑，諸如熒光染料(例如Alexa680、吲哚菁綠和Cy5.5)、同位素和放射性核素，諸如¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、³²p、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵²Fe、⁵⁵Co、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷³Se、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb、⁸³Sr、⁸⁶y、⁹⁰y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹¹⁰In、¹¹¹In、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁵⁴Gd、¹⁵⁵Gd、¹⁵⁶Gd、¹⁵⁷Gd、¹⁵⁸Gd、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和²²³R，順磁離子，諸如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)或鉺(III)，金屬，諸如鑭(III)、金(III)、鉛(II)和鉍(III)，超聲-反差增強(qiáng)劑，諸如脂質(zhì)體，不透射線的試劑，諸如鋇、鎵和鉈化合物。通過使用中間官能團(tuán)，諸如螯合劑如2-芐基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、其類似物和前述任一種的功能等同物(參見Leyton J等，Clin Cancer Res 14：7488-96(2008))，可以直接地或間接地?fù)饺霗z測促進(jìn)劑。

存在技術(shù)人員已知的用于將各種檢測促進(jìn)劑摻入、附著和/或綴合至蛋白、特別是免疫球蛋白和免疫球蛋白來源的結(jié)構(gòu)域的眾多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Wu A，Methods 65：139-47(2014))。類似地，存在技術(shù)人員已知的眾多成像方案，諸如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常用的非侵入性體內(nèi)成像技術(shù)，例如：計算機(jī)體層攝影術(shù)成像(CT掃描)、光學(xué)成像(包括直接的、熒光的和生物發(fā)光的成像)、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)、單光子發(fā)射計算機(jī)體層攝影術(shù)(SPECT)、超聲和x-射線計算機(jī)體層攝影術(shù)成像(關(guān)于綜述，參見Kaur S等，Cancer Lett 315：97-111(2012))。

生產(chǎn)或制備包含本發(fā)明的蛋白的藥物和/或診斷組合物

任何本發(fā)明的蛋白的藥用鹽或溶劑化物同樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明情形中的術(shù)語“溶劑化物”是指在溶質(zhì)(在本情況下，為根據(jù)本發(fā)明的多肽化合物或其藥用鹽)和溶劑之間形成的限定的化學(xué)計量的復(fù)合物。相關(guān)的溶劑可以是，例如，水、乙醇或另一種藥用的、通常為小分子有機(jī)物種，如，但不限于，乙酸或乳酸。當(dāng)所討論的溶劑是水時，這種溶劑化物通常被稱為水合物。

本發(fā)明的蛋白或其鹽可以被配制為為儲存或施用而制備的藥物組合物，所述藥物組合物通常包含在藥用載體中的治療有效量的本發(fā)明的化合物或其鹽。術(shù)語“藥用載體”包括任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體。用于治療用途的藥用載體是制藥領(lǐng)域中公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro，編，1985)。如在本文中所使用的，“藥用載體”包括任何和所有生理學(xué)上可接受的，即相容的，溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑、等滲劑、和吸收延緩劑等。藥用載體或稀釋劑包括在適用于口服、直腸、鼻或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、和經(jīng)皮)施用的制劑中使用的那些。示例性的藥用載體包括無菌水溶液或分散液和用于無菌可注射溶液或分散液的即時制備的無菌粉末?？梢栽诒景l(fā)明的藥物組合物中采用的適合的水性和非水載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它們的適合的混合物，植物油如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。例如，通過使用包衣材料如卵磷脂，通過維持分散液情況下所需的粒度，以及通過使用表面活性劑，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ谀承?shí)施方案中，載體適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如通過注射或輸注)。根據(jù)所選擇的給藥途徑，可以將本發(fā)明的蛋白或其他藥物組分包衣在用于保護(hù)化合物免受當(dāng)通過特定給藥途徑施用于患者時本發(fā)明的活性蛋白可能會遇到的低pH和其他天然失活條件的作用影響的物質(zhì)中。

本發(fā)明的藥物組合物的制劑可以以單位劑型方便地提供并且可以通過任何在藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的方法制備。以這種形式，將組合物分為含有適合量的活性組分的單位劑量。單位劑型可以是包裝的制劑，包裝含有離散量的制劑，例如，小包片劑、膠囊、和小藥瓶或安瓿瓶中的粉劑。單位劑型還可以是膠囊、扁膠囊(cachet)、或片劑本身，或者其可以是適合數(shù)量的這些包裝形式中的任何一種。其可以以單劑量可注射形式，例如以筆(pen)的形式提供?？梢詫⒔M合物配制為用于任何適合的施用途徑和方式。皮下或經(jīng)皮施用方式可以特別適用于在本文中所描述的治療性蛋白。

本發(fā)明的藥物組合物還可以含有輔助劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌操作，以及通過包含多種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以確保防止存在微生物。組合物中的等滲劑，如糖類、氯化鈉等，也可以是合乎需要的。此外，通過包含延緩吸收的藥劑如單硬脂酸鋁和明膠，可以產(chǎn)生可注射藥物形式的延長的吸收。

本發(fā)明的藥物組合物還任選地包含藥用抗氧化劑。示例性的藥用抗氧化劑是：水溶性抗氧化劑如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

在另一個方面中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的不同的蛋白或任何前述各項(xiàng)的酯、鹽或酰胺中的一種或組合，以及至少一種藥用載體。

治療性組合物在制造和儲存條件下通常是無菌和穩(wěn)定的。組合物可以配制為溶液、微乳液、脂質(zhì)體、或適合高藥物濃度的其他規(guī)則結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括，例如，水、醇如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇)、或任何適合的混合物。例如，通過使用包衣如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒度，以及通過使用表面活性劑，根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的制劑化學(xué)，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ谀承?shí)施方案中，等滲劑，例如糖類，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉可以是在組合物中合乎需要的?？梢酝ㄟ^在組合物中包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來產(chǎn)生可注射組合物的延長吸收。

用于皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸浮液通常包括下列各項(xiàng)中的一種或多種：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、非發(fā)揮性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及張力(tonicitv)調(diào)節(jié)劑如，例如，氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A，如鹽酸或氫氧化鈉，或者具有檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等的緩沖液調(diào)節(jié)pH。此類制劑可以封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小藥瓶中。

通過以所需的量將本發(fā)明的蛋白以及上述成分中的一種或組合加入適合的溶劑中，當(dāng)需要時，繼之以進(jìn)行滅菌微過濾，可以制備無菌可注射溶液。通過將活性化合物加入至含有分散介質(zhì)和其他成分(如上述那些)的無菌賦型劑中，可以制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其產(chǎn)生活性成分以及來自其無菌過濾溶液的任何另外的所需成分的粉末。

當(dāng)將治療有效量的本發(fā)明的蛋白設(shè)計為通過例如靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射來施用時，粘合劑將會是無熱原、腸胃外可接受的水溶液的形式。考慮到適合的pH、等滲性、穩(wěn)定性等，用于制備腸胃外可接受的蛋白質(zhì)溶液的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)。除了粘合劑之外，用于靜脈內(nèi)、皮膚、或皮下注射的優(yōu)選的藥物組合物將含有等滲賦型劑，如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer′s injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液、或在本領(lǐng)域中已知的其他賦型劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖液、抗氧化劑、或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說公知的其他添加劑。

如在本文中其他地方描述的，本發(fā)明的蛋白或其組合物(例如，藥物或診斷組合物)可以用保護(hù)組合物免于快速釋放的載體來制備，如受控釋放制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼劑、和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾摹⑸锵嗳菪跃酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。許多用于制備這種制劑的方法被授予了專利或是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的(參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(Robinson J，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NY，U.S.，1978))。

在某些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的組合物(例如，藥物或診斷組合物)配制成確保在體內(nèi)的所需分布。例如，血腦屏障排除許多大型和/或親水性化合物。為了將本發(fā)明的治療性化合物或組合物靶向至特定的體內(nèi)位置，例如，可以將它們配制在可以包含被選擇性地運(yùn)輸至特定細(xì)胞或器官的一個或多個結(jié)構(gòu)部分的脂質(zhì)體中，從而增強(qiáng)靶向藥物遞送。示例性的靶向結(jié)構(gòu)部分包括葉酸或生物素；甘露糖苷；抗體；表面活性劑蛋白A受體；p120聯(lián)蛋白等。

藥物組合物包括被設(shè)計成用作植入物或微粒系統(tǒng)的胃腸外制劑。植入物的例子是由聚合的或疏水的組分(諸如乳劑、離子交換樹脂和可溶性的鹽溶液)組成的貯庫制劑。微粒系統(tǒng)的例子是樹枝狀大分子(dendrimers)、脂質(zhì)體、微球、微粒、納米膠囊、納米顆粒、納米棒、納米球、聚合膠束和納米管(參見例如Honda M等，Int J Nanomedicine 8：495-503(2013)；Sharma A等，Biomed Res Int 2013：960821(2013)；Ramishetti S，Huang L，Ther Deliv 3：1429-45(2012))。使用對離子敏感的聚合物，諸如，例如，脂質(zhì)體、泊洛沙姆407和羥磷灰石，可以制備控釋制劑。顆粒和聚合物制劑可以包含改變漿膜滲透性是試劑，諸如，例如，各種肽和蛋白，如溶細(xì)胞素，毒素來源的試劑，病毒來源的試劑，合成的生物模擬肽，和化學(xué)試劑(參見，例如，Varkouhi等，J Control Release 151：220-8(2011)；J Pirie C等，Mol Cancer Ther 12：1774-82(2013))。

VII.多核苷酸、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞

除了本發(fā)明的蛋白以外，編碼這種蛋白或其功能部分的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“多核苷酸”是術(shù)語“核酸”的等同物，二者均包括脫氧核糖核酸(DNAs)的聚合物、核糖核酸(RNAs)的聚合物、利用核苷酸類似物產(chǎn)生的這些DNA或RNA的類似物、以及它們的衍生物、片段和同系物。本發(fā)明的多核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的或三鏈的。例如，考慮RNA密碼子的第三位中可容忍的但是作為不同的RNA密碼子編碼相同氨基酸的擺動性(wobble)(參見Stothard P，Biotechniques 28：1102-4(2000))，公開的多核苷酸被具體公開為包括所有能夠編碼本發(fā)明示例性蛋白的多核苷酸。

在一個方面中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可以包括，例如，編碼與包含本發(fā)明的蛋白的氨基酸序列中的一個的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上的同一性的多肽的核酸序列。本發(fā)明還包括包含與編碼本發(fā)明的蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，或者任何這種序列的反義序列或互補(bǔ)序列的多核苷酸。

本發(fā)明的多核苷酸(或蛋白)的衍生物或類似物包括，尤其是，具有與本發(fā)明的多核苷酸或蛋白基本同源的區(qū)域的多核苷酸(或多肽)分子，例如與相同尺寸的多核苷酸或多肽序列相比，或者當(dāng)與比對的序列(其中所述比對由本領(lǐng)域中已知的計算機(jī)同源性程序進(jìn)行)相比時，至少約45％、50％、70％、80％、95％、98％、或甚至99％的同一性(并且優(yōu)選的同一性為80-99％)。示例性的程序是使用默認(rèn)設(shè)置的GAP程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for UNIX，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison，WI，U.S.)，其使用Smith T，Waterman M，Adv.Appl.Math.2：482-9(1981)的算法。還包括能夠與編碼本發(fā)明的蛋白的序列的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸(參見例如Ausubel F等，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York，NY，U.S.，1993))，以及以下。嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。

本發(fā)明還提供包含本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸的表達(dá)載體。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的材料和方法將能夠編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸插入至包括細(xì)菌質(zhì)粒、病毒載體和噬菌體載體在內(nèi)的已知載體中以產(chǎn)生表達(dá)載體。這種表達(dá)載體將包括支持在任何選擇的宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如以下實(shí)施例中描述的pTxb1和pIVEX 2.3)中產(chǎn)生預(yù)期的本發(fā)明的蛋白所需的多核苷酸。用于與特定類型的宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一起使用的包含具體的多核苷酸的表達(dá)載體對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的，可以是使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定的，或者可以是購買的。

如在本文中所使用的，術(shù)語“表達(dá)載體”是指包含一個或多個表達(dá)單元線性或環(huán)形的多核苷酸。術(shù)語“表達(dá)單元”表示編碼目標(biāo)多肽并且能夠提供核酸區(qū)段在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的多核苷酸區(qū)段。表達(dá)單元通常包含均處于可操作構(gòu)型的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼目標(biāo)多肽的開放閱讀框、和轉(zhuǎn)錄終止子。表達(dá)載體含有一個或多個表達(dá)單元。因此，在本發(fā)明上下文中，編碼包含單個多肽鏈(例如具有志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的遺傳重組的scFv)的本發(fā)明的蛋白的表達(dá)載體至少包括用于該單個多肽鏈的表達(dá)單元，而編碼包含例如兩個以上多肽鏈(例如與毒素效應(yīng)子區(qū)連接的包含V_L結(jié)構(gòu)域的一條鏈和包含V_H結(jié)構(gòu)域的第二鏈)的表達(dá)載體包括至少兩個表達(dá)單元，各自用于所述蛋白的兩條多肽鏈中的每一個。對于本發(fā)明的多鏈蛋白的表達(dá)，用于每條多肽鏈的表達(dá)單元還可以單獨(dú)地包含在不同的表達(dá)載體中(例如，可以利用已經(jīng)向其中引入用于每條多肽鏈的表達(dá)載體的單一宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)表達(dá))。

能夠引導(dǎo)多肽和蛋白的瞬時或穩(wěn)定表達(dá)的表達(dá)載體是在本領(lǐng)域內(nèi)公知的。表達(dá)載體通常包括，但不限于下列各項(xiàng)中的一種或多種：異源信號序列或肽、復(fù)制起點(diǎn)、一個或多個標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列，其中的每一個均為在本領(lǐng)域內(nèi)公知的。任選的調(diào)節(jié)控制序列、整合序列、和可以采用的可用標(biāo)記物是在本領(lǐng)域中已知的。

術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指可以支持表達(dá)載體的復(fù)制或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌，或者真核細(xì)胞(例如酵母、昆蟲、兩棲動物、鳥類、或哺乳動物細(xì)胞)。可以使用在本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)包含本發(fā)明的多核苷酸或能夠產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白的宿主細(xì)胞系的創(chuàng)建和分離。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)的蛋白可以是在本文中所描述的蛋白的變體或衍生物，其是這樣產(chǎn)生的：通過改變一個或多個氨基酸或者缺失或插入一個或多個氨基酸來修飾編碼本發(fā)明公開的蛋白的多核苷酸以可以使其更適用于實(shí)現(xiàn)所需性質(zhì)，如通過宿主細(xì)胞的更優(yōu)的表達(dá)。

VIII.遞送裝置和試劑盒

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種裝置，其包含用于遞送給受試者的本發(fā)明的物質(zhì)的一種或多種組合物，諸如藥物組合物。因而，包含本發(fā)明的一種或多種化合物的遞送裝置可以用于通過多種遞送方法給患者施用本發(fā)明的物質(zhì)的組合物，所述遞送方法包括：靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射；口服施用；透皮施用；肺或透粘膜施用；通過植入物、滲透泵、筒或微量泵施用；或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方式。

試劑盒也在本發(fā)明范圍內(nèi)，所述試劑盒包含本發(fā)明的物質(zhì)的至少一種組合物和任選的包裝和使用說明書。試劑盒可用于藥物施用和/或診斷信息收集。本發(fā)明的試劑盒可以任選地包含至少一種另外的試劑(例如，標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)志物等)。試劑盒典型地包括標(biāo)簽，所述標(biāo)簽指示試劑盒的內(nèi)容物的預(yù)期用途。所述試劑盒還可以包含用于檢測在樣品中或在受試者中的細(xì)胞類型(例如腫瘤細(xì)胞)或用于診斷患者是否屬于對利用如本文中所述的本發(fā)明的化合物、組合物或有關(guān)方法的治療策略做出應(yīng)答的群體的試劑和其它工具。

IX.使用本發(fā)明的蛋白或其組合物的方法

通常，本發(fā)明的一個目的是提供藥理學(xué)上有活性的試劑、以及包含它們的組合物，它們可以用于預(yù)防和/或治療疾病、病癥和病患，諸如某些癌癥、腫瘤、免疫病癥、微生物感染、或在本文中提及的其它病理學(xué)狀況。因此，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的蛋白和藥物組合物的方法，其用于靶向殺死細(xì)胞，用于將另外的外源物質(zhì)遞送進(jìn)靶向細(xì)胞中，用于標(biāo)記靶向細(xì)胞的內(nèi)部，用于收集診斷信息，和用于治療如本文中所述的疾病、病癥和病患。

具體地，本發(fā)明的一個目的是提供這樣的藥理學(xué)上有活性的試劑、組合物和/或方法，其與本領(lǐng)域目前已知的試劑、組合物和/或方法相比具有某些優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供了使用特征在于特定的多肽序列的本發(fā)明的蛋白及其藥物組合物的方法。例如，在SEQ ID NO：1-31中的任一個多肽序列可以具體地用作在下述方法中使用的蛋白的組分。

本發(fā)明提供了殺傷細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟：使體外或體內(nèi)細(xì)胞與本發(fā)明的蛋白或藥物組合物接觸。在使一個或多個細(xì)胞與要求保護(hù)的物質(zhì)的組合物之一接觸以后，本發(fā)明的蛋白和藥物組合物可以用于殺傷特定細(xì)胞類型。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以用于殺傷不同細(xì)胞類型的混合物中的特定細(xì)胞類型，諸如包含癌細(xì)胞、受感染的細(xì)胞和/或血液細(xì)胞的混合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以用于殺傷不同細(xì)胞類型的混合物中的癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以用于殺傷不同細(xì)胞類型的混合物中的特定細(xì)胞類型，諸如移植前組織。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以用于殺傷細(xì)胞類型的混合物中的特定細(xì)胞類型，諸如用于治療目的的施用前組織材料。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以用于選擇性地殺傷被病毒或微生物感染的細(xì)胞，或以其它方式選擇性地殺傷表達(dá)特定細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子(諸如細(xì)胞表面生物分子)的細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白和藥物組合物具有多種應(yīng)用，包括，例如，用于從體外或體內(nèi)組織除去不希望的細(xì)胞類型，用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以治療移植物抗宿主病，用作抗病毒劑，用作抗寄生蟲劑，和用于凈化移植組織的不希望的細(xì)胞類型。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)施用給受試者中(諸如需要治療的患者中)的體外或體內(nèi)細(xì)胞群體時，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物(單獨(dú)地或與其它化合物或藥物組合物組合地)可以表現(xiàn)出有效的細(xì)胞殺傷活性。通過使用高親和力免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)使酶活性志賀毒素區(qū)域的遞送靶向癌細(xì)胞型，可以將該有效的細(xì)胞殺傷活性限于特異性地和選擇性地殺傷生物體內(nèi)的特定細(xì)胞類型，諸如某些癌細(xì)胞、贅生性細(xì)胞、惡性細(xì)胞、非惡性腫瘤細(xì)胞或受感染的細(xì)胞。

本發(fā)明提供了一種殺傷患者中的細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的患者施用至少一種本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物。

本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物的某些實(shí)施方案可以用于通過靶向被發(fā)現(xiàn)與癌癥或腫瘤細(xì)胞物理上關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外生物分子而殺死患者中的癌細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞。術(shù)語“癌細(xì)胞”或“癌性細(xì)胞”表示以異常加速的方式生長和分裂的各種贅生性細(xì)胞，且是技術(shù)人員顯而易見的。術(shù)語“腫瘤細(xì)胞”包括惡性的和非惡性的細(xì)胞(例如，非癌性的、良性的腫瘤細(xì)胞、非癌性的“癌癥”干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、惡性癌癥前起始細(xì)胞、腫瘤起始細(xì)胞、或腫瘤發(fā)生細(xì)胞，它們可以產(chǎn)生變成惡性腫瘤和/或癌細(xì)胞但本身不能轉(zhuǎn)移的子細(xì)胞(參見，例如，Martinez-Climent J等，Haematologica 95：293-302(2010)))。通常，癌癥和/或腫瘤可以定義為適合治療和/或預(yù)防的疾病、病癥或病患?？赡苁芤嬗诒景l(fā)明的方法和組合物的、由癌細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的癌癥和腫瘤(惡性的或非惡性的)是技術(shù)人員顯而易見的。贅生性細(xì)胞經(jīng)常與以下一種或多種相關(guān)：失調(diào)的生長、分化的缺失、局部組織侵入、血管生成和轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物的某些實(shí)施方案可以用于通過靶向被發(fā)現(xiàn)與免疫細(xì)胞物理上關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外生物分子而殺死患者中的免疫細(xì)胞(無論是健康的還是惡性的)。

本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物的某些實(shí)施方案可以用于通過靶向被發(fā)現(xiàn)與受感染的細(xì)胞物理上關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外生物分子而殺死患者中受感染的細(xì)胞。

為了以下目的利用本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物是在本發(fā)明范圍內(nèi)：凈化患者細(xì)胞群體(例如骨髓)的被感染的、惡性的、腫瘤性的、或在其它方面不希望的B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞，然后將除去了B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞的物質(zhì)重新輸入患者中(參見例如van Heeckeren W等，Br J Haematol 132：42-55(2006)；Alpdogan O，van den Brink M，Semin Oncol 39：629-42(2012))。

為了以下目的利用本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物是在本發(fā)明范圍內(nèi)：從取自患者的分離的細(xì)胞群體離體除去B-細(xì)胞和/或T細(xì)胞。在一個非限制性實(shí)施例中，本發(fā)明的蛋白可以用在用于預(yù)防器官和/或組織移植排斥的方法中，其中在移植本發(fā)明的細(xì)胞毒性蛋白或其藥物組合物之前灌注供體器官或組織，以便凈化器官的不需要的供體B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞(參見例如Alpdogan O，van den Brink M，Semin Oncol 39：629-42(2012))。

為了以下目的利用本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物也是在本發(fā)明范圍內(nèi)：從供體細(xì)胞群體除去B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞作為要接受骨髓和/或干細(xì)胞移植的患者中針對移植物抗宿主病和耐受性誘導(dǎo)的預(yù)防。

本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物的某些實(shí)施方案可以用于通過靶向被發(fā)現(xiàn)與受感染的細(xì)胞物理上關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外生物分子而殺死患者中受感染的細(xì)胞。

本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物的某些實(shí)施方案可以用于殺傷多細(xì)胞寄生蟲的細(xì)胞。在某些其他實(shí)施方案中，在所述多細(xì)胞寄生蟲存在于宿主生物體或受試者中時，發(fā)生所述細(xì)胞殺傷。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白可以用于殺傷蠕蟲(helminth)，諸如，例如，扁形動物(plathelminth)，線蟲(nemathelminth)，絳蟲(cestode)，mongenean，線蟲(nematode)，和/或吸蟲(trematode)。

另外，本發(fā)明提供了治療患者中疾病、病癥或病患的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的患者施用治療有效量的至少一種本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物?？梢允褂迷摲椒ㄖ委煹念A(yù)見到的疾病、病癥或病患包括癌癥、惡性腫瘤、非惡性腫瘤、生長異常、免疫病癥和微生物感染。“治療上有效劑量”的本發(fā)明的化合物的施用可以導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重程度的降低，無疾病癥狀階段的頻率和持續(xù)時間的增加，或由疾病折磨而導(dǎo)致的損害或殘疾的預(yù)防。

本發(fā)明的化合物的治療有效量將取決于施用途徑、所治療的哺乳動物的類型、和在考慮中的特定患者的體格特征。這些因素以及它們與確定這種量的關(guān)系是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)從業(yè)人員眾所周知的。這種量和施用方法可以進(jìn)行調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)最佳效力，并且可以取決于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的因素，如重量、飲食、并存的藥物和其它因素。最適用于人類用途的劑量大小和定量施用方案可以由通過本發(fā)明得到的結(jié)果指導(dǎo)，并且可以在適當(dāng)?shù)卦O(shè)計的臨床試驗(yàn)中確認(rèn)。通過常規(guī)方式，在實(shí)驗(yàn)動物中以低劑量開始并且然后在監(jiān)測效果的同時增加劑量、以及系統(tǒng)性地改變給藥方案，可以確定有效劑量和治療方案。當(dāng)為給定受試者確定最佳劑量時，臨床醫(yī)師可以考慮許多因素。這樣的考慮因素是技術(shù)人員已知的。

可接受的施用途徑可以表示在本領(lǐng)域中已知的任何施用途徑，包括但不限于氣霧劑、腸內(nèi)、鼻、眼、口服、腸胃外、直腸、陰道或透皮(例如，乳膏、凝膠或軟膏的局部施用，或借助于透皮貼劑)?！澳c胃外施用”典型地與在預(yù)期作用部位處的注射有關(guān)或與預(yù)期作用部位連通，包括腫瘤內(nèi)注射、眶下、輸注、動脈內(nèi)、囊內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、椎管內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、透粘膜或經(jīng)氣管施用。

關(guān)于本發(fā)明的藥物組合物的施用，劑量范圍通常將為約0.0001-100毫克/千克(mg/kg)宿主體重，并且更通常為0.01-5mg/kg宿主體重。示例性劑量可以是0.25mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的范圍內(nèi)。一個示例性的治療方案是每天一次或兩次施用，或每周一次或兩次施用，每兩周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每兩個月或三個月一次或者每三至六個月一次。劑量可以由熟練的健康護(hù)理專業(yè)人員根據(jù)需要選擇并重新調(diào)節(jié)以使對于特定患者而言的治療益處最大化。

本發(fā)明的藥物組合物典型地將會在多種情形下施用給相同患者。單次劑量之間的間隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每兩個月或三個月、每六個月、或每年?；谡{(diào)節(jié)受試者或患者中的血液水平或其它標(biāo)志物，施用之間的間隔也可以是不規(guī)律的。本發(fā)明的化合物的劑量方案包括1mg/kg體重或3mg/kg體重的靜脈內(nèi)施用，其中將化合物每兩至四周施用一次達(dá)六個劑量，然后以3mg/kg體重或1mg/kg體重每三個月施用一次。

使用本領(lǐng)域已知的多種方法中的一種或多種，可以經(jīng)由一種或多種施用途徑施用本發(fā)明的藥物組合物。如技術(shù)人員將會理解的，施用的途徑和/或模式將會根據(jù)期望的結(jié)果而變化。本發(fā)明的蛋白或其組合物的施用途徑包括，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其它腸胃外施用途徑，例如，通過在預(yù)期作用部位處的或與預(yù)期作用部位連通的注射或輸注(例如，腫瘤內(nèi)注射)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以通過非腸胃外途徑施用，諸如局部、表皮或粘膜施用途徑，例如，鼻內(nèi)地、口服地、陰道地、直腸地、舌下地或局部地。

利用本領(lǐng)域已知的多種醫(yī)療裝置中的一種或多種，可以施用本發(fā)明的蛋白或藥物組合物。例如，在一個實(shí)施方案中，可以利用無針皮下注射裝置施用本發(fā)明的藥物組合物。在本領(lǐng)域中具有可用于本發(fā)明的眾所周知的植入物和模塊的例子，包括例如，用于受控速率遞送的可植入微量輸液泵；用于穿過皮膚施用的裝置；用于以精確的輸注速率遞送的輸液泵；用于連續(xù)藥物遞送的可變流可植入輸注裝置；以及滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些和其它這樣的植入物、遞送系統(tǒng)、和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

本發(fā)明的蛋白或藥物組合物可以單獨(dú)施用或者與一種或多種其它治療劑或診斷劑聯(lián)合施用。聯(lián)合治療可以包括與至少一種其它治療劑組合的本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物，所述其它治療劑基于待治療的特定患者、疾病或病患而選擇。其它這樣的藥劑的例子包括，尤其是，細(xì)胞毒性的抗癌劑或化學(xué)治療劑、抗炎或抗增殖劑、抗微生物或抗病毒劑、生長因子、細(xì)胞因子、鎮(zhèn)痛藥、治療活性的小分子或多肽、單鏈抗體、經(jīng)典抗體或其片段、或調(diào)節(jié)一個或多個信號傳導(dǎo)途徑的核酸分子、以及在治療性或預(yù)防性處理方案中互補(bǔ)的或在其它方面有益的類似調(diào)節(jié)治療劑。

用本發(fā)明的蛋白或藥物組合物對患者的治療優(yōu)選地導(dǎo)致被靶向的細(xì)胞的細(xì)胞死亡和/或被靶向的細(xì)胞的生長抑制。這樣，本發(fā)明的蛋白和包含它們的藥物組合物將可用在治療多種病理學(xué)病癥(其中殺死或除去靶細(xì)胞可能是有益的，例如尤其是癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥和受感染的細(xì)胞)的方法中。本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞增殖和治療細(xì)胞病癥(包括瘤形成、過度活躍的B-細(xì)胞和過度活躍的T-細(xì)胞)的方法。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白和藥物組合物可以用于治療或預(yù)防癌癥、腫瘤(惡性的和非惡性的)、生長異常、免疫病癥和微生物感染。在另一個方面，以上離體方法可以與以上體內(nèi)方法組合以提供治療或預(yù)防骨髓移植接受者中的排斥的方法和用于實(shí)現(xiàn)免疫耐受的方法。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療哺乳動物受試者(諸如人)中的惡性病或腫瘤和其它血細(xì)胞相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的蛋白或藥物組合物。

本發(fā)明的蛋白和藥物組合物具有多種用途，包括，例如，用于除去不希望的B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞，用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以治療移植物抗宿主病，用作抗病毒劑，用作抗微生物劑，和用于凈化移植組織的不希望的細(xì)胞類型。本發(fā)明的蛋白和藥物組合物通常是抗腫瘤劑——意味著它們能夠通過抑制癌癥或腫瘤細(xì)胞的生長和/或造成癌癥或腫瘤細(xì)胞的死亡而治療和/或預(yù)防腫瘤或惡性細(xì)胞的發(fā)育、成熟或傳播。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或藥物組合物用于治療B-細(xì)胞-、漿細(xì)胞-、T-細(xì)胞或抗體-介導(dǎo)的疾病或病癥，諸如例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、淀粉樣變性、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、克羅恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、橋本甲狀腺炎、溶血性尿毒性綜合征HIV-相關(guān)的疾病、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、多關(guān)節(jié)炎、銀屑病、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、膿毒性休克、舍格倫綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎和血管炎。

在另一個方面，本發(fā)明的蛋白和藥物組合物的某些實(shí)施方案是抗微生物劑——意味著它們能夠治療和/或預(yù)防微生物致病感染(諸如由病毒、細(xì)菌、真菌、朊病毒或原生動物造成)的獲得、發(fā)展或后果。

提供對由B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病患的預(yù)防或治療的方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述預(yù)防或治療包括向由此需要的患者施用本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物，用于殺傷所述患者中的B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞的目的。該用法與準(zhǔn)備或調(diào)理患者用于骨髓移植、干細(xì)胞移植、組織移植或器官移植相容，而無論移植的物質(zhì)的來源，例如人或非人來源。

提供通過用本發(fā)明的蛋白或藥物組合物對宿主B細(xì)胞、NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞的靶向性細(xì)胞殺傷的骨髓接受體在本發(fā)明的范圍內(nèi)，用于預(yù)防或治療宿主抗移植物疾病(參見，例如，Sarantopoulos S等，Biol Blood Marrow Transplant 21：16-23(2015))。

本發(fā)明的蛋白和藥物組合物可以用在治療癌癥的方法中，所述方法包括：給有此需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的蛋白或藥物組合物。在本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，正在治療的癌癥選自由下述組成的組：骨癌(諸如多發(fā)性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中樞/周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌癥(諸如腦癌、神經(jīng)纖維瘤病或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)、胃腸癌(諸如胃癌或結(jié)直腸癌)、生殖細(xì)胞癌(諸如卵巢癌和睪丸癌、腺癌(諸如胰腺癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、唾液腺癌或甲狀腺癌)、頭頸癌(諸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液學(xué)癌癥(諸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、腎-尿道癌(諸如腎癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(諸如間皮瘤、小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(諸如血管肉瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮膚癌(諸如基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌或黑素瘤)和子宮癌。

本發(fā)明的蛋白和藥物組合物可以用在治療免疫病癥的方法中，所述方法包括：給有此需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的蛋白或藥物組合物。在本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，所述免疫病癥與炎癥有關(guān)，所述炎癥與選自由以下組成的組的疾病有關(guān)：淀粉樣變性、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、克羅恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、橋本甲狀腺炎、溶血性尿毒性綜合征、HIV相關(guān)的疾病、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、膿毒性休克、舍格倫綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎和血管炎。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是使用本發(fā)明的蛋白作為藥物組合物或藥物的組分，所述藥物組合物或藥物用于治療或預(yù)防癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥和/或微生物感染。例如，可以用這樣的藥物治療在患者的皮膚上呈現(xiàn)的免疫病癥，以嘗試減少炎癥，。在另一個實(shí)施例中，可以用這樣的藥物治療皮膚腫瘤，以嘗試減小腫瘤大小或完全消除腫瘤。

本發(fā)明的某些蛋白可以用在分子神經(jīng)外科應(yīng)用中，諸如免疫損傷(immunolesioning)和神經(jīng)元示蹤(關(guān)于綜述，參見，Wiley R，Lappi D，Adv Drug Deliv Rev 55：1043-54(2003))。例如，可以從各種配體(諸如神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽)選擇或衍生出靶向結(jié)構(gòu)域，其通過結(jié)合神經(jīng)元表面受體(諸如神經(jīng)元回路特異性的G-蛋白連接的受體)而靶向特定神經(jīng)元細(xì)胞類型。類似地，所述靶向結(jié)構(gòu)域可以選自或源自結(jié)合神經(jīng)元表面受體的抗體。因?yàn)橹举R毒素穩(wěn)健地指導(dǎo)它們自身的逆向軸突運(yùn)輸，本發(fā)明的某些細(xì)胞毒性蛋白可以用于殺死在遠(yuǎn)離細(xì)胞體的細(xì)胞毒性蛋白注射部位處表達(dá)所述細(xì)胞外靶標(biāo)的神經(jīng)元(參見Llewellyn-Smith I等，J Neurosci Methods 103：83-90(2000))。這些神經(jīng)元細(xì)胞類型特異性的靶向細(xì)胞毒性蛋白用在神經(jīng)科學(xué)研究中，諸如用于闡明感覺的機(jī)制(參見例如Mishra S，Hoon M，Science 340：968-71(2013))，和建立神經(jīng)變性疾病(諸如帕金森病和阿爾茨海默病)的模型系統(tǒng)(參見例如Hamlin A等，PLoS One e53472(2013))。

為了關(guān)于疾病、病患和/或病癥的信息收集的目的，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是使用本發(fā)明的蛋白、藥物組合物和/或診斷組合物檢測細(xì)胞類型的存在的方法。所述方法包括使細(xì)胞與診斷足夠量的本發(fā)明的蛋白接觸以通過測定或診斷技術(shù)檢測所述蛋白。短語“診斷足夠量”表示為了信息收集目的通過利用的特定測定或診斷技術(shù)提供充分檢測和準(zhǔn)確測量的量。通常，對于完整生物體內(nèi)診斷應(yīng)用而言，診斷足夠量是每位受試者在0.1mg至100mg本發(fā)明的檢測促進(jìn)劑連接的蛋白/千克受試者之間的非累積劑量。典型地，在這些信息收集方法中使用的本發(fā)明的蛋白的量將盡可能地低，前提條件是，它仍然是診斷足夠量。例如，對于在生物體中的體內(nèi)檢測，施用給受試者的本發(fā)明的蛋白的量將可行地盡可能地低。

與檢測促進(jìn)劑組合的本發(fā)明的蛋白的細(xì)胞類型特異性的靶向提供檢測細(xì)胞并獲取其圖像的方式，所述細(xì)胞與本發(fā)明的蛋白的結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理上關(guān)聯(lián)。使用本發(fā)明的蛋白對細(xì)胞的成像可以通過本領(lǐng)域已知的任意合適的技術(shù)在體外或在體內(nèi)執(zhí)行。例如，為了信息收集的目的，使用本發(fā)明的蛋白、藥物組合物或診斷組合物檢測細(xì)胞型的存在的方法可以在患者內(nèi)的體內(nèi)細(xì)胞上進(jìn)行，特別在原位細(xì)胞上進(jìn)行，例如，在疾病病灶處，在體外細(xì)胞上，和/或在從生物體去除的細(xì)胞和組織(例如，活組織檢查物質(zhì))上以離體設(shè)置進(jìn)行。

使用本領(lǐng)域已知的各種方法，包括生物體的全身成像或使用取自生物體的離體樣品，可以收集診斷信息。本文中使用的術(shù)語樣品表示任意數(shù)目的物品，但不限于，流體諸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛門分泌物、陰道分泌物和精液，以及通過活組織檢查操作得到的組織。例如，通過技術(shù)諸如磁共振成像(MRI)、光學(xué)方法(諸如直接的、熒光的和生物發(fā)光的成像)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)、單光子發(fā)射計算機(jī)體層攝影術(shù)(SPECT)、超聲、x-射線計算機(jī)體層攝影術(shù)和前述技術(shù)的組合，多種檢測促進(jìn)劑可以用于非侵入性體內(nèi)腫瘤成像(關(guān)于綜述，參見Kaur S等，CancerLett 315：97-111(2012))。

使用本發(fā)明的蛋白、藥物組合物或診斷組合物檢測靶標(biāo)生物分子陽性細(xì)胞型的存在(用于信息收集目的)的方法可以在患者內(nèi)的體內(nèi)細(xì)胞上進(jìn)行，在原位細(xì)胞上進(jìn)行，例如，在疾病病灶處，在體外細(xì)胞上，和/或在從生物體去除的細(xì)胞和組織(例如，活組織檢查物質(zhì))上以離體設(shè)置進(jìn)行。使用本發(fā)明的組合物檢測特定細(xì)胞、細(xì)胞型和細(xì)胞群體可以用于細(xì)胞的診斷和成像，諸如，例如，腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和被感染的細(xì)胞。例如，本發(fā)明的蛋白和診斷組合物可以用于成像或顯現(xiàn)生物體中表達(dá)靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞可能累積的位點(diǎn)。這些方法可以用于鑒定治療干預(yù)后腫瘤發(fā)展的位點(diǎn)或殘留的腫瘤細(xì)胞。

用于檢測細(xì)胞型的存在的方法的某些實(shí)施方案可以用于收集關(guān)于疾病、病癥和病患的信息，諸如例如，骨癌(諸如多發(fā)性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中樞/周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌癥(諸如腦癌、神經(jīng)纖維瘤病或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)、胃腸癌(諸如胃癌或結(jié)直腸癌)、生殖細(xì)胞癌(諸如卵巢癌和睪丸癌、腺癌(諸如胰腺癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、唾液腺癌或甲狀腺癌)、頭頸癌(諸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液學(xué)癌癥(諸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、腎-尿道癌(諸如腎癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(諸如間皮瘤、小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(諸如血管肉瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮膚癌(諸如基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌或黑素瘤)、子宮癌、AIDS、淀粉樣變性、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、孤獨(dú)癥(autism)、心臟發(fā)生(cardiogenesis)、克羅恩病、糖尿病、紅斑(erythematosus)、胃炎(gastritis)、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、橋本甲狀腺炎、溶血性尿毒性綜合征、HIV相關(guān)的疾病、紅斑狼瘡、淋巴增生性障礙(lymphoproliferative disorders)、多發(fā)性硬化、重癥肌無力(myasthenia gravis)、神經(jīng)炎癥(neuroinflammation)、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、多關(guān)節(jié)炎、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、膿毒性休克、舍格倫綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、細(xì)胞增殖、炎癥、白細(xì)胞激活、白細(xì)胞粘附、白細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞成熟、白細(xì)胞遷移、神經(jīng)元分化、急性淋巴母細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、T急性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、B-細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)、B-細(xì)胞前淋巴細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma，BL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓性白血病(CML)、彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、血管內(nèi)大B-細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、天然殺傷細(xì)胞白血病、結(jié)節(jié)邊緣B-細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、漿細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、幼淋巴細(xì)胞白血病、早幼粒細(xì)胞性白血病、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、脾邊緣帶淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤(TCL)、重鏈病、單克隆丙種球蛋白病(monoclonal gammopathy)、單克隆免疫球蛋白沉積病、骨髓增生異常綜合征(MDS)、郁積型多發(fā)性骨髓瘤和Waldenstrom巨球蛋白血癥。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是使用本發(fā)明的蛋白、藥物組合物和/或診斷組合物標(biāo)記或檢測贅生性細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞類型的內(nèi)部的方法(參見例如，Koyama Y等，Clin Cancer Res 13：2936-45(2007)；Ogawa M等，Cancer Res 69：1268-72(2009)；Yang L等，Small 5：235-43(2009))?；诒景l(fā)明的蛋白和藥物組合物進(jìn)入特定細(xì)胞類型并通過逆向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸在細(xì)胞內(nèi)按路線發(fā)送的能力，特定細(xì)胞類型的內(nèi)部區(qū)室被標(biāo)記用于檢測。這可以在患者內(nèi)在原位細(xì)胞上執(zhí)行，或在從生物體取出的細(xì)胞和組織(例如活組織檢查材料)上執(zhí)行。

本發(fā)明的診斷組合物可以用于將疾病、病癥或病患表征為本發(fā)明的有關(guān)藥物組合物潛在地可治療的。本發(fā)明的物質(zhì)的某些組合物可以用于確定患者是否屬于對利用如本文中所述的本發(fā)明的化合物、組合物或有關(guān)方法的治療策略做出應(yīng)答或非常適合使用本發(fā)明的遞送裝置的組。

可以在檢測出疾病(例如癌癥)以后使用本發(fā)明的診斷組合物，以便更好地表征它，諸如以監(jiān)測遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性和癌癥進(jìn)展階段。疾病病癥或感染的表型評估可以幫助在做出治療決策的過程中的預(yù)后和預(yù)測。在疾病復(fù)發(fā)中，本發(fā)明的某些方法可以用于確定是局部還是全身問題。

本發(fā)明的診斷組合物可以用于評估對治療劑的應(yīng)答，無論治療劑的類型，例如小分子藥物、生物藥物或基于細(xì)胞的療法。例如，本發(fā)明的診斷的某些實(shí)施方案可以用于測量腫瘤大小的變化、抗原陽性細(xì)胞群體(包括數(shù)目和分布)的變化、和/或監(jiān)測已經(jīng)施用給患者的療法所靶向的抗原以外的標(biāo)志物(參見，例如Smith-Jones P等，Nat Biotechnol 22：701-6(2004)；Evans M等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.108：9578-82(2011))。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白或其藥物組合物和/或診斷組合物用于診斷和治療，或僅用于診斷。

下述選擇性的細(xì)胞毒性蛋白的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明了本發(fā)明，所述選擇性的細(xì)胞毒性蛋白包含來源于志賀毒素家族成員的A亞基的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)和能夠結(jié)合與特定細(xì)胞型物理連接的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)。

實(shí)施例

以下實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。但是，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅僅用于解釋目的，且不意圖、也不應(yīng)當(dāng)解釋為對本發(fā)明的條件和范圍的一概限制。除了另外詳細(xì)描述以外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的且常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)。

下述實(shí)施例證明了示例性的細(xì)胞毒性蛋白較之它們相反方向的蛋白變體提高的選擇性殺傷與免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子物理連接的細(xì)胞的能力。所述示例性的細(xì)胞毒性蛋白結(jié)合被靶向的細(xì)胞表達(dá)的靶標(biāo)生物分子并且進(jìn)入該被靶向的細(xì)胞。內(nèi)在化的細(xì)胞毒性蛋白有效地將它們的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)按路線發(fā)送到細(xì)胞溶膠中，以使核糖體失活，然后引起被靶向的細(xì)胞的凋亡死亡。

一種示例性的細(xì)胞毒性蛋白包含與能夠以高親和力結(jié)合CD38的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段。該示例性的細(xì)胞毒性蛋白能夠選擇性殺傷在細(xì)胞表面上表達(dá)CD38的細(xì)胞。第二示例性的細(xì)胞毒性蛋白包含與能夠以高親和力結(jié)合HER2的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段。該第二示例性的細(xì)胞毒性蛋白能夠選擇性殺傷在細(xì)胞表面上表達(dá)HER2的細(xì)胞。第三示例性的細(xì)胞毒性蛋白包含與能夠以高親和力結(jié)合CD19的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段。該第三示例性的細(xì)胞毒性蛋白能夠選擇性殺傷在細(xì)胞表面上表達(dá)CD19的細(xì)胞。第四示例性的細(xì)胞毒性蛋白包含與能夠以高親和力結(jié)合CD74的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段。該第四示例性的細(xì)胞毒性蛋白能夠選擇性殺傷在細(xì)胞表面上表達(dá)CD74的細(xì)胞。其他示例性的細(xì)胞毒性蛋白包括具有靶向EB抗原(Epstein-Barr antigens)、利什曼原蟲抗原(Leishmania antigens)、神經(jīng)降壓肽受體、表皮生長因子受體和免疫細(xì)胞受體CCR5的結(jié)合的那些細(xì)胞毒性蛋白。

實(shí)施例1.來源于志賀樣毒素-1的A亞基的CD38-靶向的細(xì)胞毒性蛋白(SLT-1A：：αCD38scFv)

本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD38scFv包含與能夠以高親和力結(jié)合CD38的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段，從而所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)比CD38結(jié)合區(qū)更鄰近所述細(xì)胞毒性蛋白的氨基端。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD38scFv的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

第一，設(shè)計或選擇志賀毒素效應(yīng)子區(qū)和免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)。在該實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。獲得編碼SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等，Mol Cancer 9：28(2010)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCD38scFv來源于單克隆抗體抗-CD38 HB7(Peng等，Blood 101：2557-62(2003)；還參見GenBank Accession BD376144，National Center for Biotechnology Information，U.S.)，使得產(chǎn)生具有通過本領(lǐng)域已知的接頭隔開的兩個免疫球蛋白可變區(qū)(V_L和V_H)的單鏈可變片段(scFv)。

第二，將結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成融合蛋白。在該實(shí)施例中，將編碼來自SLT-1A的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(SEQ ID NO：1的氨基酸1-251)的多核苷酸與編碼接頭(如來源于鼠IgG3分子的“鼠鉸鏈”(或技術(shù)人員已知的其他接頭))的多核苷酸符合閱讀框地克隆，并且與編碼包含SEQ ID NO：4的氨基酸269-508的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCD38scFv的多核苷酸符合閱讀框地克隆。在某些實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的全長編碼序列以編碼的多核苷酸起始，以促進(jìn)檢測和純化。使用DNA 2.0，Inc.(Menlo Park，CA，U.S.)的服務(wù)，將編碼本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD38scFv的多核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用以在大腸桿菌中有效的表達(dá)。

第三，通過表達(dá)編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD38scFv(SEQ ID NO：4)的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αCD38scFv細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用細(xì)菌和無細(xì)胞的蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

在通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生SLT-1A：：αCD38scFv的該實(shí)施例中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼SLT-1A：：αCD38scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1載體(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中，以產(chǎn)生與編碼載體的氨基端內(nèi)蛋白的多核苷酸序列符合閱讀框連接的編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD38scFv的多核苷酸序列。通過Sanger測序(Functional Biosciences，Madison，WI，U.S.)驗(yàn)證質(zhì)粒插入多核苷酸序列，并且將其轉(zhuǎn)化到T7細(xì)胞(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中。產(chǎn)生SLT-1A：：αCD38scFv蛋白，并且按照IMPACT^TM(具有親和性殼多糖結(jié)合標(biāo)記的內(nèi)蛋白介導(dǎo)的純化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系統(tǒng)手冊(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)進(jìn)行純化。純化使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，諸如使用或免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的固定的靶標(biāo)。

在通過無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生SLT-1A：：αCD38scFv的該實(shí)施例中，使用HD克隆試劑盒(Clonetech，Mountain View，CA，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，將編碼SLT-1A：：αCD38scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pIVEX2.3載體中，所述載體具有緊接在編碼區(qū)后的終止密碼子。通過Sanger測序(Functional Biosciences，Madison，WI，U.S.)驗(yàn)證質(zhì)粒插入多核苷酸序列。使用快速翻譯系統(tǒng)5 Prime^TM RTS 100大腸桿菌二硫化物試劑盒(5 Prime，Gaithersburg，MD，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，產(chǎn)生SLT-1A：：αCD38scFv蛋白。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)純化，諸如使用或免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的固定的靶標(biāo)。

確定結(jié)合靶細(xì)胞型的SLT-1A：：αCD38scFv的最大特異性結(jié)合(B_max)和平衡結(jié)合常數(shù)(K_D)

如上述產(chǎn)生的SLT-1A：：αCD38scFv蛋白的結(jié)合特征通過基于熒光的流式細(xì)胞測定來確定。將包含CD38陽性(+)細(xì)胞和CD38陰性(-)細(xì)胞的樣品懸浮在1X PBS+1％BSA中，并與100μL要測定的SLT-1A：：αCD38scFv蛋白的不同稀釋液在4℃溫育1小時。選擇SLT-1A：：αCD38scFv蛋白的最高濃度，以導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)飽和。一小時溫育后，將細(xì)胞樣品用1X PBS+1％BSA洗滌兩次。將細(xì)胞樣品與100μL包含0.3μg抗mAb-FITC(# A01736-100，Genscript，Piscataway，NJ，U.S.)的1X PBS+1％BSA在4℃溫育1小時。

接著，將細(xì)胞樣品用1X PBS+1％BSA洗滌兩次，重懸在200μL 1X PBS中，并且進(jìn)行基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)。使用僅有FITC的樣品作為陰性對照，通過門控數(shù)據(jù)得到關(guān)于所有樣品的平均熒光強(qiáng)度(MFI)數(shù)據(jù)。使用Prism軟件(GraphPad Software，San Diego，CA，U.S.)繪制MFI相對于“細(xì)胞濃度”的圖。使用在主題結(jié)合-飽和下的Prism軟件單位點(diǎn)結(jié)合函數(shù)[Y＝B_max*X/(K_D+X)]，用基線校正的數(shù)據(jù)計算B_max和K_D。通過減去對僅包含PBS的孔測量的Abs值，針對背景校正Abs值。B_max是以MFI報道的最大特異性結(jié)合。K_D是平衡結(jié)合常數(shù)，以nM為單位報道。

測量SLT-1A：：αCD38scFv與CD38+細(xì)胞結(jié)合的B_max為約100,000MFI，K_D約13nM(表1)。該結(jié)果與反方向蛋白αCD38scFv：：SLT-1A與CD38+細(xì)胞結(jié)合的B_max相似，測量其為約110,000MFI，K_D約17nM(表1)。蛋白無一結(jié)合CD38-細(xì)胞。這表明“改造的方向”作用可能與免疫球蛋白來源的結(jié)構(gòu)域的靶細(xì)胞結(jié)合特異性的干擾無關(guān)。

表1.改造方向?qū)Y(jié)合特征沒有顯著影響：與反方向αCD38scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD38scFv的B_max和K_D的代表值

在體外確定SLT-1A：：αCD38scFv針對真核細(xì)胞核糖體的半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用快速連接轉(zhuǎn)錄/翻譯試劑盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit，L1170 Promega，Madison，WI，U.S.，以無細(xì)胞體外蛋白翻譯測定，確定SLT-1A：：αCD38scFv的核糖體滅活能力。所述試劑盒包括熒光素酶T7對照DNA和Master Mix。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書準(zhǔn)備核糖體活性反應(yīng)，以產(chǎn)生“TNT”反應(yīng)混合物。

在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備一系列待測SLT-1A：：αCD38scFv的10倍稀釋液，并且為每個SLT-1A：：αCD38scFv稀釋液產(chǎn)生一系列相同的TNT反應(yīng)混合物組分。將在SLT-1A：：αCD38scFv蛋白稀釋系列中的每個樣品與TNT反應(yīng)混合物中的每一個以及熒光素酶T7對照DNA合并。將試驗(yàn)樣品在30℃溫育1.5小時。在溫育之后，將熒光素酶測定試劑(E1483 Promega，Madison，WI，U.S.)加入到所有試驗(yàn)樣品中，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書通過發(fā)光測量熒光素酶蛋白翻譯的量。通過總蛋白的對數(shù)轉(zhuǎn)化濃度相對于相對發(fā)光單位的非線性回歸分析，確定翻譯抑制的水平。使用統(tǒng)計軟件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，計算每個樣品的半最大抑制濃度(IC₅₀)值。然后，通過使用Prism軟件在主題劑量-響應(yīng)-抑制下的log(抑制劑)相對于反應(yīng)(三個參數(shù))的函數(shù)[Y＝底部+((頂部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]計算“僅有SLT-1A的對照蛋白的百分?jǐn)?shù)”，而使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。計算實(shí)驗(yàn)蛋白和僅有SLT-1A的對照蛋白的IC₅₀。通過[(SLT-1A對照蛋白的IC50/實(shí)驗(yàn)蛋白的IC50)x 100]計算僅有SLT-1A的對照蛋白的百分?jǐn)?shù)。

SLT-1A：：αCD38scFv對無細(xì)胞的蛋白合成的抑制作用強(qiáng)。劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αCD38scFv對蛋白合成的IC₅₀為約14皮摩爾(pM)或?yàn)閮H有SLT-1A的陽性對照的109％(表2)。這一結(jié)果與關(guān)于反方向蛋白αCD38scFv：：SLT-1A的IC₅₀沒有實(shí)質(zhì)不同，測量反方向蛋白αCD38scFv：：SLT-1A的IC₅₀為約15pM或與僅有SLT-1A的陽性對照同等(表2)。這表明“改造的方向”作用可能與志賀毒素A亞基酶活性的任何明顯的干擾無關(guān)。

表2.改造方向?qū)颂求w失活沒有顯著影響：與反方向αCD38scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD38scFv的代表性半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αCD38scFv的選擇性細(xì)胞毒性和半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

通過下述細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αCD38scFv的細(xì)胞毒性特征。該測定確定細(xì)胞毒性蛋白殺傷表達(dá)所述細(xì)胞毒性蛋白的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞的能力(與不表達(dá)所述靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞相比)。將細(xì)胞接種在384孔平板的20μL細(xì)胞培養(yǎng)基中(2x10³個細(xì)胞/孔)。將SLT-1A：：αCD38scFv蛋白在1X PBS中稀釋5倍或10倍，并且將5μL稀釋液加入到細(xì)胞中。使用僅包含細(xì)胞培養(yǎng)基的對照孔進(jìn)行基線校正。將細(xì)胞樣品與SLT-1A：：αCD38scFv、或僅與緩沖液在37℃在5％CO₂氣氛中溫育3天。使用發(fā)光細(xì)胞存活測定(Luminescent Cell Viability Assay，G7573 Promega Madison，WI，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，用發(fā)光讀數(shù)確定總細(xì)胞存活或存活力百分?jǐn)?shù)。使用下述方程計算實(shí)驗(yàn)孔的存活力百分?jǐn)?shù)：(試驗(yàn)RLU-平均培養(yǎng)基RLU)/(平均細(xì)胞RLU-平均培養(yǎng)基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中繪制對數(shù)多肽濃度相對于存活力百分?jǐn)?shù)的圖，并且利用log(抑制劑)相對于標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)(可變斜率)分析確定SLT-1A：：αCD38scFv的半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)值。

劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定，SLT-1A：：αCD38scFv蛋白對CD38+細(xì)胞的CD₅₀為約0.2-0.7nM，這取決于細(xì)胞系，相比較地，對CD38-細(xì)胞系為470nM，這與僅有SLT-1A的陰性對照的CD₅₀相似(表3；圖2)。同與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子CD38物理連接的細(xì)胞(例如，在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)CD38的細(xì)胞系)相比，SLT-1A：：αCD38scFv對于不與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子CD38物理連接的細(xì)胞的CD₅₀高約700-3000倍(細(xì)胞毒性較小)(表3；圖2)。測量以相反方向重組的相同蛋白結(jié)構(gòu)域αCD38scFv：：SLT-1A的CD₅₀為約0.8-3.2nM(表3；圖2)。這表明改進(jìn)的改造方向(其中，相對于所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近細(xì)胞毒性蛋白的氨基端)賦予約4-6倍的針對CD38細(xì)胞的細(xì)胞毒性提高(表3)。這些結(jié)果示例了“改造的方向”作用對細(xì)胞毒性和選擇性細(xì)胞毒性二者的影響?；陉P(guān)于核糖體失活或靶細(xì)胞結(jié)合特征的體外結(jié)果，不能預(yù)測這些細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞殺傷的差異。

表3.改造方向?qū)?xì)胞毒性的影響：與反方向αCD38scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD38scFv的代表性半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

使用免疫熒光確定SLT-1A：：αCD38scFv及其反方向αCD38scFv：：SLT-1A的細(xì)胞內(nèi)在化

使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)研究細(xì)胞毒性蛋白進(jìn)入靶細(xì)胞的能力。簡言之，收集0.8x 10⁶個每種細(xì)胞型(Raji(CD38+)，Ramos(CD38+)，Daudi(CD38+)，BC-1(CD38+)，和U266(CD38-))的細(xì)胞，并且懸浮在50μL包含蛋白酶抑制劑混合物(例如P1860Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO，U.S.)和人Fc受體蛋白(以減少非特異性免疫熒光染色)的細(xì)胞培養(yǎng)基中。然后，將100nM待分析的細(xì)胞毒性蛋白加入到細(xì)胞中，并且將所述細(xì)胞在37℃溫育1小時，以允許進(jìn)行中毒。然后，使用Cytofix/Cytoperm^TM試劑盒(BD Biosciences San Diego，CA，U.S.)按照供應(yīng)商的使用說明，將細(xì)胞“固定”并“滲透化”。志賀毒素效應(yīng)子區(qū)用小鼠單克隆抗體(小鼠IgG抗-志賀毒素1亞基A，BEI NR-867BEI Resources，Manassas，VA，U.S.)“染色”。然后用Alexa555單克隆抗體標(biāo)記試劑盒(Life Technologies，Carlsbad，CA，U.S.)按照供應(yīng)商的使用說明檢測該小鼠單克隆抗體的定位。

在該測定中，在CD38+細(xì)胞中，觀察到針對SLT-1A：：αCD38scFv和反方向蛋白αCD38scFv：：SLT-1A二者的細(xì)胞表面結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)在化。沒有觀察到任一種蛋白向CD38-細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)在化。這表明這兩種變體(它們僅在它們的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的相對順序方面不同)之間的細(xì)胞毒性差異(表3；圖2)可能與靶細(xì)胞結(jié)合和/或細(xì)胞進(jìn)入的任何顯著的變化無關(guān)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白αCD38scFv：：SLT-1A的體內(nèi)作用

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白αCD38scFv：：SLT-1A對CD38+贅生性細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞的體內(nèi)作用。使用多種小鼠品系來檢測在靜脈內(nèi)施用后細(xì)胞毒性蛋白對小鼠中異種移植的腫瘤的作用，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞和/或人免疫細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)CD38)而產(chǎn)生。

實(shí)施例2.來源于志賀樣毒素1的A亞基的HER2-靶向的細(xì)胞毒性蛋白(SLT-1A：：αHER2scFv)

該實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αHER2scFv包含與能夠以高親和力結(jié)合HER2的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段，使得所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)比HER2結(jié)合區(qū)更鄰近所述細(xì)胞毒性蛋白的氨基端。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αHER-2scFv的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。獲得編碼SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等，Mol Cancer 9：28(2010))。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αHER2scFv來源于曲妥珠單抗(曲妥珠單抗)(以市售，Genentech，South San Francisco，CA)單克隆抗體，如(Zhao等，J Immunol 183：5563-74(2009))所述，使得產(chǎn)生具有由接頭隔開的兩個免疫球蛋白可變區(qū)(V_L和V_H)的單鏈可變片段(scFv)。

在本實(shí)施例中，將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成融合蛋白。在該實(shí)施例中，將編碼來自SLT-1A的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(SEQ ID NO：1的氨基酸1-251)的多核苷酸與編碼接頭(如來源于鼠IgG3分子的“鼠鉸鏈”(或技術(shù)人員已知的其他接頭))的多核苷酸符合閱讀框地克隆，并且與編碼包含SEQ ID NO：8的氨基酸269-512的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αHER2scFv的多核苷酸符合閱讀框地克隆。在某些實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的全長編碼序列以編碼的多核苷酸起始，以促進(jìn)檢測和純化。使用DNA2.0，Inc.(Menlo Park，CA，U.S.)的服務(wù)，將編碼本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αHER2scFv的多核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用以在大腸桿菌中有效的表達(dá)。

通過表達(dá)編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αHER2scFv(SEQ ID NO：8)的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αHER2scFv細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用細(xì)菌和無細(xì)胞的蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

在通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生SLT-1A：：αHER2scFv的該實(shí)施例中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼SLT-1A：：αHER2scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1載體(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中，以產(chǎn)生與編碼載體的氨基端內(nèi)蛋白的多核苷酸序列符合閱讀框連接的編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αHER2scFv的多核苷酸序列。通過Sanger測序(Functional Biosciences，Madison，WI，U.S.)驗(yàn)證質(zhì)粒插入多核苷酸序列，并且將其轉(zhuǎn)化到T7細(xì)胞(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中。產(chǎn)生SLT-1A：：αHER2scFv蛋白，并且按照IMPACT^TM(具有親和性殼多糖結(jié)合標(biāo)記的內(nèi)蛋白介導(dǎo)的純化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系統(tǒng)手冊(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)進(jìn)行純化。純化使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，諸如使用或免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的固定的靶標(biāo)。

在通過無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生SLT-1A：：αHER2scFv的該實(shí)施例中，使用HD克隆試劑盒(Clonetech，Mountain View，CA，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，將編碼SLT-1A：：αHER2scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pIVEX2.3載體中，所述載體具有緊接在編碼區(qū)后的終止密碼子。通過Sanger測序(Functional Biosciences，Madison，WI，U.S.)驗(yàn)證質(zhì)粒插入多核苷酸序列。使用快速翻譯系統(tǒng)5 Prime^TMRTS 100大腸桿菌二硫化物試劑盒(5 Prime，Gaithersburg，MD，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，產(chǎn)生SLT-1A：：αHER2scFv蛋白。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)純化，諸如使用或免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的固定的靶標(biāo)。

確定結(jié)合靶細(xì)胞型的SLT-1A：：αHER2scFv的最大特異性結(jié)合(B_max)和平衡結(jié)合常數(shù)(K_D)

如上述產(chǎn)生的SLT-1A：：αHER2scFv蛋白的結(jié)合特征通過基于熒光的流式細(xì)胞測定來確定。將包含HER2陽性(+)細(xì)胞和HER2陰性(-)細(xì)胞的樣品懸浮在含有1％牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem，San Diego，CA，U.S.)的磷酸緩沖鹽水(1X PBS)(Hyclone Brand，F(xiàn)isher Scientific，Waltham，MA，U.S.)(以下表示為“1X PBS+1％BSA”)中，并與100μL要測定的SLT-1A：：αHER2scFv蛋白的不同稀釋液在4攝氏度(℃)溫育1小時。選擇SLT-1A：：αHER2scFv蛋白的最高濃度，以導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)飽和。一小時溫育后，將細(xì)胞樣品用1X PBS+1％BSA洗滌兩次。將細(xì)胞樣品與100μL包含0.3μg抗mAb-FITC(#A01736-100，Genscript，Piscataway，NJ，U.S.)的1X PBS+1％BSA在4℃溫育1小時。

接著，將細(xì)胞樣品用1X PBS+1％BSA洗滌兩次，重懸在200μL 1X PBS中，并且進(jìn)行基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)。使用僅有FITC的樣品作為陰性對照，通過門控數(shù)據(jù)得到關(guān)于所有樣品的平均熒光強(qiáng)度(MFI)數(shù)據(jù)。使用Prism軟件(GraphPad Software，San Diego，CA，U.S.)繪制MFI相對于“細(xì)胞濃度”的圖。使用在主題結(jié)合-飽和下的Prism軟件單位點(diǎn)結(jié)合函數(shù)[Y＝B_max*X/(K_D+X)]，用基線校正的數(shù)據(jù)計算B_max和K_D。通過減去對僅包含PBS的孔測量的Abs值，針對背景校正Abs值。B_max是以MFI報道的最大特異性結(jié)合。K_D是平衡結(jié)合常數(shù)，以納摩爾(nM)為單位報道。

測量SLT-1A：：αHER2scFv與HER2+細(xì)胞結(jié)合的B_max為約230,000MFI，K_D約110nM(表4)。該結(jié)果與反方向蛋白αHER2scFv：：SLT-1A與HER2+細(xì)胞結(jié)合的B_max相似，測量其為約140,000MFI，K_D約180nM(表4)。在該測定中，觀察到?jīng)]有蛋白具有與HER2-陰性細(xì)胞的可測量的結(jié)合。這表明“改造的方向”作用可能與免疫球蛋白來源的結(jié)構(gòu)域的靶細(xì)胞結(jié)合特異性的干擾無關(guān)。

表4.改造方向?qū)Y(jié)合特征沒有影響：與反方向αHER2scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αHER2scFv的B_max和K_D的代表值

在體外確定SLT-1A：：αHER2scFv針對真核細(xì)胞核糖體的半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用快速連接轉(zhuǎn)錄/翻譯試劑盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit，L1170 Promega，Madison，WI，U.S.，以無細(xì)胞體外蛋白翻譯測定，確定SLT-1A：：αHER2scFv的核糖體滅活能力。所述試劑盒包括熒光素酶T7對照DNA和Quick Master Mix。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書準(zhǔn)備核糖體活性反應(yīng)，以產(chǎn)生“TNT”反應(yīng)混合物。

在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備一系列待測SLT-1A：：αHER2scFv的10倍稀釋液，并且為每個SLT-1A：：αHER2scFv稀釋液產(chǎn)生一系列相同的TNT反應(yīng)混合物組分。將在SLT-1A：：αHER2scFv蛋白稀釋系列中的每個樣品與TNT反應(yīng)混合物中的每一個以及熒光素酶T7對照DNA合并。將試驗(yàn)樣品在30℃溫育1.5小時。在溫育之后，將熒光素酶測定試劑(E1483Promega，Madison，WI，U.S.)加入到所有試驗(yàn)樣品中，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書通過發(fā)光測量熒光素酶蛋白翻譯的量。通過總蛋白的對數(shù)轉(zhuǎn)化濃度相對于相對發(fā)光單位的非線性回歸分析，確定翻譯抑制的水平。使用統(tǒng)計軟件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，計算每個樣品的半最大抑制濃度(IC₅₀)值。然后，通過使用Prism軟件在主題劑量-響應(yīng)-抑制下的log(抑制劑)相對于反應(yīng)(三個參數(shù))的函數(shù)[Y＝底部+((頂部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]計算“僅有SLT-1A的對照蛋白的百分?jǐn)?shù)”，而使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。計算實(shí)驗(yàn)蛋白和僅有SLT-1A的對照蛋白的IC₅₀。通過[(SLT-1A對照蛋白的IC50/實(shí)驗(yàn)蛋白的IC50)x 100]計算僅有SLT-1A的對照蛋白的百分?jǐn)?shù)。

SLT-1A：：αHER2scFv對無細(xì)胞的蛋白合成的抑制作用強(qiáng)。劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αHER2scFv對蛋白合成的IC₅₀為約110pM或?yàn)閮H有SLT-1A的陽性對照的19％(表5)。這一結(jié)果與關(guān)于反方向蛋白αHER2scFv：：SLT-1A的IC₅₀沒有實(shí)質(zhì)不同，測量反方向蛋白αHER2scFv：：SLT-1A的IC₅₀為僅有SLT-1A的陽性對照的108％(表5)。這表明“改造的方向”作用可能與志賀毒素A亞基酶活性的任何明顯的干擾無關(guān)。

表5.改造方向?qū)颂求w失活沒有影響：與反方向αHER2scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αHER2scFv的代表性相對半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αHER2scFv的選擇性細(xì)胞毒性和半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

通過下述細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αHER2scFv的細(xì)胞毒性特征。該測定確定細(xì)胞毒性蛋白殺傷表達(dá)所述細(xì)胞毒性蛋白的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞的能力(與不表達(dá)所述靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞相比)。將細(xì)胞接種在384孔平板的20μL細(xì)胞培養(yǎng)基中(2x10³個細(xì)胞/孔)。將SLT-1A：：αHER2scFv蛋白在1X PBS中稀釋5倍或10倍，并且將5μL稀釋液加入到細(xì)胞中。使用僅包含細(xì)胞培養(yǎng)基的對照孔進(jìn)行基線校正。將細(xì)胞樣品與SLT-1A：：αHER2scFv、或僅與緩沖液在37℃在5％二氧化碳(CO₂)的氣氛中溫育3天。使用發(fā)光細(xì)胞存活測定(Luminescent Cell Viability Assay，G7573 Promega Madison，WI，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，用發(fā)光讀數(shù)確定總細(xì)胞存活或存活力百分?jǐn)?shù)。使用下述方程計算實(shí)驗(yàn)孔的存活力百分?jǐn)?shù)：(試驗(yàn)RLU-平均培養(yǎng)基RLU)/(平均細(xì)胞RLU-平均培養(yǎng)基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中繪制對數(shù)多肽濃度相對于存活力百分?jǐn)?shù)的圖，并且利用log(抑制劑)相對于標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)(可變斜率)分析確定SLT-1A：：αHER2scFv的半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)值。

劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定，SLT-1A：：αHER2scFv蛋白對HER2+細(xì)胞的CD₅₀為約0.07nM(表6；圖3)。測量以相反方向重組的相同蛋白結(jié)構(gòu)域αHER2scFv：：SLT-1A的CD₅₀為約0.64nM(表6；圖3)。針對HER2-細(xì)胞系MDA-MB468的結(jié)果是不明確的，原因在于對數(shù)據(jù)不能擬合適當(dāng)?shù)那€。表6和圖3的結(jié)果示例“改造的方形”對細(xì)胞毒性的影響。基于關(guān)于核糖體失活或靶細(xì)胞結(jié)合特征的體外結(jié)果，不能預(yù)測這些細(xì)胞毒性蛋白在細(xì)胞殺傷方面的差異。

表6.改造方向影響細(xì)胞毒性：與反方向αHER2scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αHER2scFv的代表性半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

使用免疫熒光確定SLT-1A：：αCDHER2scFv及其反方向αHER2scFv：：SLT-1A的細(xì)胞內(nèi)在化

使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)研究細(xì)胞毒性蛋白進(jìn)入靶細(xì)胞的能力。簡言之，收集0.8x 10⁶個每種細(xì)胞型(SKBR3(HER2+)和MDA-MB-231(HER2-))的細(xì)胞，并且懸浮在50μL包含蛋白酶抑制劑混合物(例如P1860 Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO，U.S.)和人Fc受體蛋白(以減少非特異性免疫熒光染色)的細(xì)胞培養(yǎng)基中。然后，將100nM待分析的細(xì)胞毒性蛋白加入到細(xì)胞中，并且將所述細(xì)胞在37℃溫育1小時，以允許進(jìn)行中毒。然后，使用Cytofix/Cytoperm^TM試劑盒(BD Biosciences San Diego，CA，U.S.)按照供應(yīng)商的使用說明，將細(xì)胞“固定”并“滲透化”。志賀毒素效應(yīng)子區(qū)用小鼠單克隆抗體(小鼠IgG抗-志賀毒素1亞基A，BEI NR-867 BEI Resources，Manassas，VA，U.S.)“染色”。然后用Alexa555單克隆抗體標(biāo)記試劑盒(Life Technologies，Carlsbad，CA，U.S.)按照供應(yīng)商的使用說明檢測該小鼠單克隆抗體的定位。

在該測定中，在HER2+細(xì)胞中，觀察到針對SLT-1A：：αHER2scFv和反方向蛋白αHER2scFv：：SLT-1A二者的細(xì)胞表面結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)在化(圖4)。沒有觀察到任一種蛋白向HER2-細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)在化。這表明這兩種變體(它們僅在它們的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的相對順序方面不同)之間的細(xì)胞毒性差異(表6；圖3)可能與靶細(xì)胞結(jié)合和/或細(xì)胞進(jìn)入的任何顯著的變化無關(guān)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白αHER2scFv：：SLT-1A的體內(nèi)作用

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白αHER2scFv：：SLT-1A對HER2+贅生性細(xì)胞的體內(nèi)作用。使用多種小鼠品系來檢測在靜脈內(nèi)施用后細(xì)胞毒性蛋白對小鼠中異種移植的腫瘤的作用，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)HER2)而產(chǎn)生。

實(shí)施例3.來源于志賀樣毒素1的A亞基的CD19-靶向的細(xì)胞毒性蛋白(SLT-1A：：αCD19scFv)

本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv包含與能夠以高親和力結(jié)合CD19的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段，從而所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)比CD19結(jié)合區(qū)更鄰近所述細(xì)胞毒性蛋白的氨基端。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

在該實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。獲得編碼SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等，Mol Cancer 9：28(2010)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCD19scFv來源于單克隆抗體抗-CD194G7(Peipp M等，J Immunol Methods 285：265-80(2004)和其中的參考文獻(xiàn))，使得產(chǎn)生具有通過本領(lǐng)域已知的接頭隔開的兩個免疫球蛋白可變區(qū)(V_L，和V_H)的單鏈可變片段(scFv)。

將結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成融合蛋白。在該實(shí)施例中，將編碼來自SLT-1A的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(SEQ ID NO：1的氨基酸1-251)的多核苷酸與編碼接頭(如來源于鼠IgG3分子的“鼠鉸鏈”(或技術(shù)人員已知的其他接頭))的多核苷酸符合閱讀框地克隆，并且與編碼包含SEQ ID NO：12的氨基酸269-516的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCD19scFv的多核苷酸符合閱讀框地克隆。使用DNA 2.0，Inc.(Menlo Park，CA，U.S.)的服務(wù)，將編碼本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv的多核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用以在大腸桿菌中有效的表達(dá)。

通過表達(dá)編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv(SEQ ID NO：12)的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αCD19scFv細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用本領(lǐng)域已知的細(xì)菌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

在通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生SLT-1A：：αCD19scFv的該實(shí)施例中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼SLT-1A：：αCD19scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1載體(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中，以產(chǎn)生與編碼載體的氨基端內(nèi)蛋白的多核苷酸序列符合閱讀框連接的編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv的多核苷酸序列。通過Sanger測序(Functional Biosciences，Madison，WI，U.S.)驗(yàn)證質(zhì)粒插入多核苷酸序列，并且將其轉(zhuǎn)化到T7細(xì)胞(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中。產(chǎn)生SLT-1A：：αCD19scFv蛋白，并且按照IMPACT^TM(具有親和性殼多糖結(jié)合標(biāo)記的內(nèi)蛋白介導(dǎo)的純化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系統(tǒng)手冊(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)進(jìn)行純化。純化使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如親核層析)實(shí)現(xiàn)。

在體外確定SLT-1A：：αCD19scFv針對真核細(xì)胞核糖體的半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用快速連接轉(zhuǎn)錄/翻譯試劑盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit，L1170 Promega，Madison，WI，U.S.，以無細(xì)胞體外蛋白翻譯測定，確定SLT-1A：：αCD19scFv的核糖體滅活能力。所述試劑盒包括熒光素酶T7對照DNA和Quick Master Mix。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書準(zhǔn)備核糖體活性反應(yīng)，以產(chǎn)生“TNT”反應(yīng)混合物。

在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備一系列待測SLT-1A：：αCD19scFv的10倍稀釋液，并且為每個SLT-1A：：αCD19scFv稀釋液產(chǎn)生一系列相同的TNT反應(yīng)混合物組分。將在SLT-1A：：αCD19scFv蛋白稀釋系列中的每個樣品與TNT反應(yīng)混合物中的每一個以及熒光素酶T7對照DNA合并。將試驗(yàn)樣品在30℃溫育1.5小時。在溫育之后，將熒光素酶測定試劑(E1483 Promega，Madison，WI，U.S.)加入到所有試驗(yàn)樣品中，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書通過發(fā)光測量熒光素酶蛋白翻譯的量。通過總蛋白的對數(shù)轉(zhuǎn)化濃度相對于相對發(fā)光單位的非線性回歸分析，確定翻譯抑制的水平。使用統(tǒng)計軟件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，計算每個樣品的半最大抑制濃度(IC_a0)值。

SLT-1A：：αCD19scFv對無細(xì)胞的蛋白合成的抑制作用強(qiáng)。劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αCD19scFv對蛋白合成的IC₅₀為約5.2pM(表7)。這一結(jié)果與關(guān)于反方向蛋白αCD19scFv：：SLT-1A的IC₅₀沒有實(shí)質(zhì)不同，測量反方向蛋白αCD19scFv：：SLT-1A的IC₅₀為約3.2pM或與僅有SLT-1A的陽性對照同等(表7)。這表明“改造的方向”作用可能與志賀毒素A亞基酶活性的任何明顯的干擾無關(guān)。

表7.改造方向?qū)颂求w失活沒有影響：與反方向αCD19scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD19scFv的代表性半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αCD19scFv的選擇性細(xì)胞毒性和半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

通過下述細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αCD19scFv的細(xì)胞毒性特征。該測定確定細(xì)胞毒性蛋白殺傷表達(dá)其免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞的能力(與不表達(dá)所述靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞相比)。將細(xì)胞接種在384孔平板的20μL細(xì)胞培養(yǎng)基中(2x 10³個細(xì)胞/孔)。將SLT-1A：：αCD19scFv蛋白在緩沖液中稀釋10倍，并且將5μL稀釋液加入到細(xì)胞中。使用僅包含細(xì)胞培養(yǎng)基的對照孔進(jìn)行基線校正。將細(xì)胞樣品與SLT-1A：：αCD19scFv、或僅與緩沖液在37℃在5％CO₂氣氛中溫育3天。使用發(fā)光細(xì)胞存活測定(Luminescent Cell Viability Assay，G7573 Promega Madison，WI，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，用發(fā)光讀數(shù)確定總細(xì)胞存活或存活力百分?jǐn)?shù)。使用下述方程計算實(shí)驗(yàn)孔的存活力百分?jǐn)?shù)：(試驗(yàn)RLU-平均培養(yǎng)基RLU)/(平均細(xì)胞RLU-平均培養(yǎng)基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中繪制對數(shù)多肽濃度相對于存活力百分?jǐn)?shù)的圖，并且利用log(抑制劑)相對于反應(yīng)(三個參數(shù))分析確定SLT-1A：：αCD19scFv的半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)值。

劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定，SLT-1A：：αCD19scFv蛋白對CD19+Daudi細(xì)胞的CD₅₀為約0.28nM(表8；圖5)?；谇€的形狀，不能準(zhǔn)確測量僅有SLT-1A的陰性對照和以反方向重組的相同蛋白結(jié)構(gòu)域αCD19scFv：：SLT-1A的CD₅₀。由于曲線的形狀，不能計算SLT-1A：：αCD19scFv針對CD19陰性U266細(xì)胞的CD₅₀；這些細(xì)胞不與細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子CD19物理連接。這些結(jié)果表明，蛋白改造的特定方向(其中，相對于所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，所述免疫球蛋白型區(qū)域不鄰近細(xì)胞毒性蛋白的氨基端)賦予針對CD19+細(xì)胞的細(xì)胞毒性的改善(表8；圖5)?；陉P(guān)于核糖體失活的體外結(jié)果，不能預(yù)測這些細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞殺傷的差異，并且預(yù)測基于靶細(xì)胞結(jié)合特征也不能預(yù)測這些細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞殺傷的差異。

表8.改造的方向影響細(xì)胞毒性：與反方向αCD19scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD19scFv的代表性半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

*“NC”表示不能計算。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv的體內(nèi)作用

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD19scFv對贅生性細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞的體內(nèi)作用。使用多種小鼠品系來檢測在靜脈內(nèi)施用后細(xì)胞毒性蛋白對小鼠中異種移植的腫瘤的作用，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞和/或人免疫細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)CD19)而產(chǎn)生。

實(shí)施例4.來源于志賀樣毒素1的A亞基的CD74-靶向的細(xì)胞毒性蛋白(SLT-1A：：αCD74scFv)

該實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv包含與能夠以高親和力結(jié)合CD74的單鏈可變片段結(jié)合區(qū)重組的志賀毒素A亞基片段，使得所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)比CD74結(jié)合區(qū)更鄰近所述細(xì)胞毒性蛋白的氨基端。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。獲得編碼SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等，Mol Cancer 9：28(2010))。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCD74scFv來源于人單克隆抗體抗-CD74，米拉珠單抗(Milatuzumab)(Sapra P等，Clin Cancer Res 11：5257-64(2005)和其中的參考文獻(xiàn))，使得產(chǎn)生具有由本領(lǐng)域已知的接頭隔開的兩個免疫球蛋白可變區(qū)(V_L和V_H)的單鏈可變片段(scFv)。

將結(jié)合區(qū)和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成融合蛋白。在該實(shí)施例中，將編碼來自SLT-1A的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)(SEQ ID NO：1的氨基酸1-251)的多核苷酸與編碼接頭(如來源于鼠IgG3分子的“鼠鉸鏈”(或技術(shù)人員已知的其他接頭))的多核苷酸符合閱讀框地克隆，并且與編碼包含SEQ ID NO：16的氨基酸269-518的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCD74scFv的多核苷酸符合閱讀框地克隆。使用DNA 2.0，Inc.(Menlo Park，CA，U.S.)的服務(wù)，將編碼本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv的多核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用以在大腸桿菌中有效的表達(dá)。

通過表達(dá)編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv(SEQ ID NO：16)的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αCD74scFv細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用本領(lǐng)域已知的細(xì)菌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

在通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生SLT-1A：：αCD74scFv的該實(shí)施例中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼SLT-1A：：αCD74scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1載體(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中，以產(chǎn)生與編碼載體的氨基端內(nèi)蛋白的多核苷酸序列符合閱讀框連接的編碼細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv的多核苷酸序列。通過Sanger測序(Functional Biosciences，Madison，WI，U.S.)驗(yàn)證質(zhì)粒插入多核苷酸序列，并且將其轉(zhuǎn)化到T7細(xì)胞(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)中。產(chǎn)生SLT-1A：：αCD74scFv蛋白，并且按照IMPACT^TM(具有親和性殼多糖結(jié)合標(biāo)記的內(nèi)蛋白介導(dǎo)的純化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系統(tǒng)手冊(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)進(jìn)行純化。純化使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如親和層析)實(shí)現(xiàn)。

在體外確定SLT-1A：：αCD74scFv針對真核細(xì)胞核糖體的半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用快速連接轉(zhuǎn)錄/翻譯試劑盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit，L1170 Promega，Madison，WI，U.S.，以無細(xì)胞體外蛋白翻譯測定，確定SLT-1A：：αCD74scFv的核糖體滅活能力。所述試劑盒包括熒光素酶T7對照DNA和Quick Master Mix。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書準(zhǔn)備核糖體活性反應(yīng)，以產(chǎn)生“TNT”反應(yīng)混合物。

在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備一系列待測SLT-1A：：αCD74scFv的10倍稀釋液，并且為每個SLT-1A：：αCD74scFv稀釋液產(chǎn)生一系列相同的TNT反應(yīng)混合物組分。將在SLT-1A：：αCD74scFv蛋白稀釋系列中的每個樣品與TNT反應(yīng)混合物中的每一個以及熒光素酶T7對照DNA合并。將試驗(yàn)樣品在30℃溫育1.5小時。在溫育之后，將熒光素酶測定試劑(E1483 Promega，Madison，WI，U.S.)加入到所有試驗(yàn)樣品中，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書通過發(fā)光測量熒光素酶蛋白翻譯的量。通過總蛋白的對數(shù)轉(zhuǎn)化濃度相對于相對發(fā)光單位的非線性回歸分析，確定翻譯抑制的水平。使用統(tǒng)計軟件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，計算每個樣品的半最大抑制濃度(IC₅₀)值。

SLT-1A：：αCD74scFv對無細(xì)胞的蛋白合成的抑制作用強(qiáng)。劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αCD74scFv對蛋白合成的IC₅₀為約8.7pM(表9)。這一結(jié)果與關(guān)于反方向蛋白αCD74scFv：：SLT-1A的IC₅₀沒有實(shí)質(zhì)不同，測量反方向蛋白αCD74scFv：：SLT-1A的IC₅₀為約3.6pM或與僅有SLT-1A的陽性對照同等(表9)。這表明“改造的方向”作用可能與志賀毒素A亞基酶活性的任何明顯的干擾無關(guān)。

表9.改造方向?qū)颂求w失活沒有影響：與反方向αCD74scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD74scFv的代表性相對半最大抑制濃度(IC₅₀)

使用細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αCD74scFv的選擇性細(xì)胞毒性和半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

通過下述細(xì)胞殺傷測定確定SLT-1A：：αCD74scFv的細(xì)胞毒性特征。該測定確定細(xì)胞毒性蛋白殺傷表達(dá)其免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)的靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞的能力(與不具有所述結(jié)合區(qū)的SLT-1A蛋白相比)。將細(xì)胞接種在384孔平板的20μL細(xì)胞培養(yǎng)基中(2x 10³個細(xì)胞/孔)。將SLT-1A：：αCD74scFv蛋白在緩沖液中稀釋10倍，并且將5μL稀釋液加入到細(xì)胞中。使用僅包含細(xì)胞培養(yǎng)基的對照孔進(jìn)行基線校正。將細(xì)胞樣品與SLT-1A：：αCD74scFv、或僅與緩沖液在37℃在5％CO₂的氣氛中溫育3天。使用發(fā)光細(xì)胞存活測定(Luminescent Cell Viability Assay，G7573 Promega Madison，WI，U.S.)，按照供應(yīng)商的使用說明，用發(fā)光讀數(shù)確定總細(xì)胞存活或存活力百分?jǐn)?shù)。使用下述方程計算實(shí)驗(yàn)孔的存活力百分?jǐn)?shù)：(試驗(yàn)RLU-平均培養(yǎng)基RLU)/(平均細(xì)胞RLU-平均培養(yǎng)基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中繪制對數(shù)多肽濃度相對于存活力百分?jǐn)?shù)的圖，并且利用log(抑制劑)相對于反應(yīng)(三個參數(shù))分析確定SLT-1A：：αCD74scFv的半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)值。

劑量依賴性實(shí)驗(yàn)確定，SLT-1A：：αCD74scFv蛋白對CD74+Daudi細(xì)胞的CD₅₀為約18.7nM(表10；圖6)。僅有SLT-1A的陰性對照的CD₅₀為2026nM，并且以反方向重組的相同蛋白結(jié)構(gòu)域αCD74scFv：：SLT-1A為95.3nM(表10；圖6)。這表明，細(xì)胞毒性蛋白改造的一種特定的方向(其中，相對于所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)，免疫球蛋白型區(qū)域不鄰近細(xì)胞毒性蛋白的氨基端)賦予針對CD74+細(xì)胞的細(xì)胞毒性的改善。基于關(guān)于蛋白合成抑制的體外結(jié)果，不能預(yù)測這些細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞殺傷方面的差異，并且預(yù)測基于靶細(xì)胞結(jié)合特征也不能預(yù)測這些細(xì)胞毒性蛋白的細(xì)胞殺傷方面的差異。

表10.改造方向影響細(xì)胞毒性：與反方向αCD74scFv：：SLT-1A相比，SLT-1A：：αCD74scFv的代表性半最大細(xì)胞毒性濃度(CD₅₀)

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv的體內(nèi)作用

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD74scFv對CD74+贅生性細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞的體內(nèi)作用。使用多種小鼠品系來檢測在靜脈內(nèi)施用后細(xì)胞毒性蛋白對小鼠中異種移植的腫瘤的作用，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)CD74)而產(chǎn)生。

概述

當(dāng)檢測四種不同的細(xì)胞毒性蛋白(它們由志賀毒素亞基A來源的區(qū)域和在它們的氨基端的免疫球蛋白來源的靶向區(qū)構(gòu)成)時，這些蛋白不表現(xiàn)出由它們的體外核糖體失活和/或靶向結(jié)合特征預(yù)測的預(yù)期的細(xì)胞毒性。令人驚訝地，觀察到，與以相反的方向連接的相同的這兩個多肽區(qū)域相比，將異源結(jié)合區(qū)鄰近包含志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的蛋白融合體的氨基端連接沒有導(dǎo)致有效的細(xì)胞毒性。

實(shí)施例5.來源于志賀樣毒素1的A亞基和抗體αEB抗原的細(xì)胞毒性蛋白

在該實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEB抗原來源于針對EB抗原的單克隆抗體(Fang C等，J Immunol Methods 287：21-30(2004))，其包含能夠結(jié)合感染了EB病毒的人細(xì)胞或表達(dá)EB抗原的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)。EB抗原表達(dá)在多種細(xì)胞型上，諸如感染了EB病毒的細(xì)胞和癌細(xì)胞(例如，淋巴瘤和鼻咽癌(naspharnygeal cancer)細(xì)胞)。另外，EB感染與其他疾病相關(guān)，例如，與多發(fā)性硬化相關(guān)。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEB抗原和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼αEB抗原結(jié)合蛋白SLT-1A：：αEB的多核苷產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αEB細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對EB抗原陽性細(xì)胞和EB抗原陰性細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：αEB對EB抗原陽性細(xì)胞的B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與EB抗原陰性細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αEB細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αEB對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用EB抗原陽性細(xì)胞確定SLT-1A：：αEB的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用EB抗原陰性細(xì)胞作為EB抗原陽性細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：αEB的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于EB抗原陽性細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)EB抗原的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)EB抗原的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB的體內(nèi)效應(yīng)

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB對贅生性細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)。使用多個小鼠品系試驗(yàn)細(xì)胞毒性蛋白在靜脈內(nèi)施用以后對小鼠中的異種移植的腫瘤的效應(yīng)，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)EB抗原)而產(chǎn)生。

實(shí)施例6.來源于志賀樣毒素1的A亞基和抗體α利什曼原蟲抗原的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α利什曼原蟲抗原來源于使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備的抗體，所述抗體針對存在于攜帶細(xì)胞內(nèi)錐蟲原生動物的人細(xì)胞上的細(xì)胞表面利什曼原蟲抗原(參見Silveira T等，Int J Parasitol 31：1451-8(2001)；Kenner J等，J Cutan Pathol 26：130-6(1999)；Berman J and Dwyer，Clin Exp Immunol 44：342-348(1981))。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α利什曼原蟲抗原和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼利什曼原蟲抗原結(jié)合蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：α利什曼原蟲細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對利什曼原蟲抗原陽性細(xì)胞和利什曼原蟲抗原陰性細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：α利什曼原蟲對利什曼原蟲抗原陽性細(xì)胞的B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與利什曼原蟲抗原陰性細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：α利什曼原蟲細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：α利什曼原蟲對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用利什曼原蟲抗原陽性細(xì)胞確定SLT-1A：：α利什曼原蟲的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用利什曼原蟲抗原陰性細(xì)胞作為利什曼原蟲抗原陽性細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：α利什曼原蟲的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于利什曼原蟲抗原陽性細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)利什曼原蟲抗原的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)利什曼原蟲抗原的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

實(shí)施例7.來源于志賀樣毒素1的A亞基和免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α神經(jīng)降壓肽受體的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α神經(jīng)降壓肽受體來源于DARPin^TM(GenBank登記號：2P2C_R)或結(jié)合人神經(jīng)降壓肽受體的單克隆抗體(Ovigne J等，Neuropeptides 32：247-56(1998))。神經(jīng)降壓肽受體由多種癌細(xì)胞表達(dá)，諸如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、黑素瘤和胰腺癌細(xì)胞。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α神經(jīng)降壓肽R和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼神經(jīng)降壓肽受體結(jié)合蛋白SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對神經(jīng)降壓肽受體陽性細(xì)胞和神經(jīng)降壓肽受體陰性細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R對神經(jīng)降壓肽受體陽性細(xì)胞的B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與神經(jīng)降壓肽受體陰性細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用神經(jīng)降壓肽受體陽性細(xì)胞確定SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用神經(jīng)降壓肽受體陰性細(xì)胞作為神經(jīng)降壓肽受體陽性細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于神經(jīng)降壓肽受體陽性細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)神經(jīng)降壓肽受體的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)神經(jīng)降壓肽受體的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R的體內(nèi)效應(yīng)

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經(jīng)降壓肽R對贅生性細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)。使用多個小鼠品系試驗(yàn)細(xì)胞毒性蛋白在靜脈內(nèi)施用以后對小鼠中的異種移植的腫瘤的效應(yīng)，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)神經(jīng)降壓肽受體)而產(chǎn)生。

實(shí)施例8.來源于志賀樣毒素1的A亞基和免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEGFR的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEGFR來源于AdNectin^TM(GenBank登記號：3QWQ_B)、Affibody^TM(GenBank登記號：2KZI_A；美國專利8,598,113)或抗體，它們都與一種或多種人表皮生長因子受體結(jié)合。表皮生長因子受體的表達(dá)與人癌細(xì)胞相關(guān)，諸如，例如，肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEGFR與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼EGFR結(jié)合蛋白SLT-1A：：αEGFR的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αEGFR細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對EGFR+細(xì)胞和EGFR-細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：aEGFR對EGFR+細(xì)胞的B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與EGFR-細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αEGFR細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αEGFR對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用EGFR+細(xì)胞確定SLT-1A：：αEGFR的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用利EGFR-細(xì)胞作為利什曼原蟲抗原陽性細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：αEGFR的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于EGFR+細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)EGFR的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)EGFR的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR的體內(nèi)效應(yīng)

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR對贅生性細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)。使用多個小鼠品系試驗(yàn)細(xì)胞毒性蛋白在靜脈內(nèi)施用以后對小鼠中的異種移植的腫瘤的效應(yīng)，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細(xì)胞(所述細(xì)胞在它們細(xì)胞表面上表達(dá)EGFR(s))而產(chǎn)生。

實(shí)施例9.來源于志賀樣毒素1的A亞基和抗體αCCR5的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCCR5來源于針對人CCR5(CD195)的單克隆抗體(Bernstone L等，Hybridoma 31：7-19(2012))。CCR5主要在T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。另外，CCR5在人免疫缺陷病毒(HIV)的發(fā)病機(jī)制和傳播中起作用。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αCCR5與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼αCCR5-結(jié)合蛋白SLT-1A：：αCCR5的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αCCR5細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對CCR5+細(xì)胞和CCR5-細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：αCCR5對CCR5+陽性細(xì)胞的B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與CCR5-細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αCCR5細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。SLT-1A：：αCCR5對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用CCR5+細(xì)胞確定SLT-1A：：αCCR5的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用CCR5-細(xì)胞作為CCR5+細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：αCCR5的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于CCR5+細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)CCR5的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)CCR5的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5的體內(nèi)效應(yīng)

使用動物模型來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5對從耗盡來自供體物質(zhì)的T細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)(參見Tsirigotis P等，Immunotherapy 4：407-24(2012))。使用非人靈長動物確定SLT-1A：：αCCR5的體內(nèi)效應(yīng)。當(dāng)用SLT-1A：：αCCR5預(yù)處理捐贈的器官時，在腎移植后，在恒河猴(rhesus macaques)中分析移植物抗宿主疾病(參見Weaver T等，Nat Med 15：746-9(2009))。在腸胃外施用不同劑量的SLT-1A：：αCCR5以后，觀察到食蟹猴靈長類動物中外周血T淋巴細(xì)胞的體內(nèi)消耗。如下試驗(yàn)SLT-1A：：αCCR5的阻斷HIV感染的用途：給非人靈長類動物施用急性劑量的SLT-1A：：αCCR5，以便在暴露于猿猴免疫缺陷病毒(SIV)時嚴(yán)格耗盡循環(huán)T-細(xì)胞(參見Sellier P等，PLoS One 5：e10570(2010))。

實(shí)施例10.來源于志賀毒素的A亞基和抗-Env免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀毒素的A亞基(Stx-A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEnv來源于現(xiàn)有的結(jié)合HIV包膜糖蛋白免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEnv的抗體，諸如GP41，GP120，GP140或GP160(參見，例如Chen W等，J Mol Bio 382：779-89(2008)；Chen W等，Expert Opin Biol Ther 13：657-71(2013)；van den Kerkhof T等，Retrovirology 10：102(2013)，或來源于用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生的抗體(參見e Prabakaran等，F(xiàn)ront Microbiol 3：277(2012))。Env是在HIV復(fù)制過程中也在被HIV-感染的細(xì)胞的細(xì)胞表面上展示的HIV表面蛋白。盡管Env在受感染的細(xì)胞中主要在胞內(nèi)體區(qū)室中表達(dá)，足夠量的Env可以存在于要被本發(fā)明的非常有效的細(xì)胞毒性蛋白靶向的細(xì)胞表面上。另外，靶向Env的細(xì)胞毒性蛋白可能結(jié)合HIV病毒粒子并在病毒粒子與宿主細(xì)胞的融合過程中進(jìn)入新感染的細(xì)胞。

因?yàn)镠IV表現(xiàn)出高突變率，優(yōu)選的是使用結(jié)合Env的功能受限部分的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)合來自多個HIV毒株的Env的寬泛中和抗體所證實(shí)的(van den Kerkhof T等，Retrovirology 10：102(2013))。因?yàn)檎J(rèn)為在受感染的細(xì)胞的表面上存在的Env呈遞空間上受限的表位(Chen W等，J Virol 88：1125-39(2014))，優(yōu)選的是，使用小于100kD且理想地小于25kD的結(jié)合區(qū)，諸如sdAb的片段，如V_HH結(jié)構(gòu)域。

細(xì)胞毒性蛋白αEnv：：SLT-1A的構(gòu)建、產(chǎn)生和純合

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αEnv和志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白。例如，通過表達(dá)編碼αEnv-結(jié)合蛋白SLT-1A：：αEnv的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αEnv細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對Env+細(xì)胞和Env-細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：αEnv對Env+陽性細(xì)胞的B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與Env-細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αEnv細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細(xì)胞測定中SLT-1A：：αEnv對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用Env+細(xì)胞確定SLT-1A：：αEnv的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用利Env-細(xì)胞作為Env+細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：αEnv的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于Env+細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)和/或用于感染細(xì)胞使其成為Env+的HIV毒株，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)Env的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)Env的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

使用動物模型確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv的體內(nèi)效應(yīng)

通過向感染了猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的非人靈長動物施用SLT-1A：：αEnv檢測SLT-1A：：αEnv抑制HIV感染的應(yīng)用(參見Sellier P等，PLoS One 5：e10570(2010))。

實(shí)施例11.來源于志賀樣毒素1的A亞基和抗體αUL18的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αUL18來源于使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生的針對細(xì)胞表面巨細(xì)胞病毒蛋白UL18的抗體，所述細(xì)胞表面巨細(xì)胞病毒蛋白UL18存在于感染了巨細(xì)胞病毒的人細(xì)胞上(Yang Z，Bjorkman P，Proc Natl Acad Sci USA 105：10095-100(2008))。人巨細(xì)胞病毒感染與多種癌癥和炎性病癥相關(guān)。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αUL18的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)αUL18與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼αUL18-結(jié)合蛋白SLT-1A：：αUL18的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：αUL18細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αUL18的體外特征

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的基于熒光的流式細(xì)胞計量術(shù)測定，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陽性細(xì)胞和巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陰性細(xì)胞的結(jié)合特征。SLT-1A：：αUL18對巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陽性細(xì)胞B_max被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內(nèi)的K_D，而在該測定中不存在與巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陰性細(xì)胞的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αUL18細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。SLT-1A：：αUL18對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用細(xì)胞殺傷測定來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：αUL18的細(xì)胞毒性

通過如上面在前述實(shí)施例中所述的一般細(xì)胞殺死測定使用巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陽性細(xì)胞確定SLT-1A：：αUL18的細(xì)胞毒性特征。另外，通過相同的一般細(xì)胞殺死測定，使用巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陰性細(xì)胞作為巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陽性細(xì)胞的對比，確定SLT-1A：：αUL18的選擇性細(xì)胞毒性特征。對于巨細(xì)胞病毒蛋白UL18陽性細(xì)胞(取決于細(xì)胞系)，本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的CD₅₀是大約0.01-100nM。所述細(xì)胞毒性蛋白對于不在細(xì)胞表面上表達(dá)巨細(xì)胞病毒蛋白UL18的細(xì)胞的CD₅₀是在細(xì)胞表面上表達(dá)巨細(xì)胞病毒蛋白UL18的細(xì)胞的大約10-10,000倍(更少的細(xì)胞毒性)。

實(shí)施例12.來源于志賀樣毒素1的A亞基和抗體α蠕蟲腸道抗原的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α蠕蟲腸道抗原來源于使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生的針對人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的蠕蟲直向同系物的抗體(參見，例如線蟲基因gcp-2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL；Rosa B等，Mol Cell Proteomics M114.046227(2015))。

細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原的構(gòu)建、產(chǎn)生和純化

將免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)α蠕蟲腸道抗原與志賀毒素效應(yīng)子區(qū)連接在一起形成蛋白，其中，與所述志賀毒素效應(yīng)子區(qū)相比，所述免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)不鄰近該蛋白的氨基端。例如，通過表達(dá)編碼α蠕蟲腸道抗原-結(jié)合蛋白SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原的多核苷酸產(chǎn)生融合蛋白。SLT-1A：：α利什曼原蟲細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)使用前面實(shí)施例所述的細(xì)菌和/或無細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原的體外特征

通過本領(lǐng)域已知的分子結(jié)合測定，使用純化的重組靶蛋白，確定了本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白的結(jié)合特征。SLT-SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原對靶蛋白的K_D測量為大約100nM，而在該測定中不存在于陰性對照蛋白(例如，純化的、重組的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)的顯著結(jié)合。

在如上面在前述實(shí)施例中所述的無細(xì)胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原細(xì)胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實(shí)施例的細(xì)胞毒性蛋白對無細(xì)胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原對蛋白合成的IC₅₀是大約0.1-100pM。

使用蠕蟲來確定細(xì)胞毒性蛋白SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原的毒性

使用模式蠕蟲確定SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原對蠕蟲的毒性(參見，例如Iatsenko I等，Toxins 2050-63(2014))?？梢酝ㄟ^浸沒向蠕蟲施用純化的SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原，或備選地通過用表達(dá)SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原融合蛋白的細(xì)菌喂養(yǎng)蠕蟲而施用。

另外，向攜帶蠕蟲和/或展示蠕蟲相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)室動物施用SLT-1A：：α蠕蟲腸道抗原，并且檢測其蠕蟲和/或寄生的蠕蟲的相關(guān)癥狀的減少或消除。

實(shí)施例13.靶向不同細(xì)胞型的細(xì)胞毒性蛋白

在本實(shí)施例中，志賀毒素效應(yīng)子區(qū)來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)、志賀毒素的A亞基(StxA)和/或志賀樣毒素2的A亞基(SLT-2A)。免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)來源于這樣的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域：其來自選自表11的第1列的分子，且其結(jié)合在表11的第2列中指示的細(xì)胞外靶標(biāo)生物分子。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，產(chǎn)生具有鄰近氨基端的志賀毒素效應(yīng)子區(qū)的該實(shí)施例的示例性細(xì)胞毒性蛋白，并且任選地連接檢測促進(jìn)劑。如在前述實(shí)施例中所述，使用表達(dá)適當(dāng)?shù)募?xì)胞外靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞，產(chǎn)生并檢測本實(shí)施例的示例性細(xì)胞毒性蛋白。例如，可以使用本實(shí)施例的示例性蛋白診斷和治療在表11的第3列中所示的疾病、病患和/或病癥。

表11.細(xì)胞毒性蛋白用于細(xì)胞靶向的不同免疫球蛋白型結(jié)合區(qū)

盡管已經(jīng)通過舉例說明的方式描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，顯而易見，可以利用許多修改、變化和改編以及利用在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)的眾多等同或替代方案實(shí)施本發(fā)明，而不背離本發(fā)明的精神或超出權(quán)利要求的范圍。

所有出版物、專利和專利申請通過引用整體并入本文，達(dá)到如同明確地且單獨(dú)地指出每篇單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用整體并入的程度。國際專利申請公布WO 2014164680 A1和WO 2014164693 A2通過引用完全結(jié)合在本文中。美國臨時專利申請61/951,110、61/951,121和62/010,918的公開內(nèi)容各自通過引用整體并入本文。國際PCT專利申請系列PCT/US2014/023,198、PCT/US2014/023,231、PCT/US2015/012,968、PCT/US2015/012,970和PCT/US2015/14,472的公開內(nèi)容各自通過引用整體并入本文。關(guān)于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的來自GenBank(國家生物技術(shù)信息中心，美國)的所有可電子獲得的生物序列信息的完整公開內(nèi)容各自通過引用整體并入本文。