專利名稱：：一種抑制志賀毒素的短肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物毒素抑制劑，具體說涉及一種具有抑制志賀毒素的短肽，還涉及該短肽的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：志賀毒素(ShigaToxin，Stx)作為腸道病原菌產(chǎn)生的一類具有腸毒性、細胞毒性和神經(jīng)毒性的細菌外毒素，是急性細菌性痢疾、霍亂O139、O157H7等新發(fā)腸道病原菌最為關(guān)鍵的強致病毒力因子。臨床上引起出血性結(jié)腸炎(hemorrhagiccolitis，HC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)以及病死率高達80～90％的溶血性尿毒癥(hemolyticuremicsyndrome，HUS)等嚴重并發(fā)癥，每年此類疾病造成全球數(shù)百萬人死亡。目前針對志賀毒素尚無特異有效的預防產(chǎn)品和急救治療藥物。臨床普遍采用的抗生素治療已經(jīng)引起多重耐藥菌株的出現(xiàn)，造成抗生素治療的失效。抗生素使用造成更加不利的后果是菌體崩解引發(fā)志賀毒素過量釋放，加大了由毒素引發(fā)各種并發(fā)癥的風險。因此針對志賀毒素相關(guān)疾病的治療主張慎用抗生素，而應(yīng)尋求特異性拮抗藥物作為新的有效治療手段。Stx由1個志賀毒素A亞單位(StxA)和5個志賀毒素B亞單位(StxB)組成，毒素通過StxB介導與真核細胞表面的Gb3受體結(jié)合，進而StxA作用于細胞28SrRNA引起細胞病變。StxB與細胞Gb3受體的結(jié)合是毒素發(fā)揮作用的起始關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如能阻斷這種結(jié)合，將從根本上抑制Stx分子毒性的發(fā)揮。研究方向主要集中在毒素受體類似物和抗體治療方面。Kitov，PI.報道了能與Stx結(jié)合的多糖化合物，具有潛在的治療應(yīng)用價值(KitovPI，SadowskaJM，MulveyGetal.Shiga-liketoxinareneutralizedbytailoredmultivalentcarbohydrateligants.Nature2000.403669-672.)；2002年NatoriY.報道了Gb3受體治療的實例(NatoriY.NewdrugsthatpreventcytotoxicityofShigatoxins.NipponRinsho.2002.60(6)1131-1137.)，包括一種能在胃腸道途徑阻止毒素擴散的新制劑和另一種可在循環(huán)系統(tǒng)抑制志賀毒素毒性的水溶性制劑。但是受體類多糖化合物的復雜制備工藝和副作用成為制約其發(fā)展的障礙。最近，有學者報道可表達毒素模擬受體的益生菌具有顯著的毒素中和效果，可用于治療志賀毒素(PatonAW，MoronaR，PatonJC.AnewbiologicalagentfortreatmentofShigatoxigenicEscherichiacoliinfectionsanddysenteryinhumans.NatMed.2000.6(3)257-8.)及破傷風類疾病，但是這種活菌治療的安全性有待進一步考察和驗證(PatonAWetal，2000；FocaretaAetal，2006)。在抗體治療方面，Nakao，H等研究報道的單克隆抗體能夠阻斷Stx與細胞受體的結(jié)合，中和Stx細胞毒性(NakaoH，KataokaC，KiyokawaNetal.MonoclonalantibodytoShigatoxin1，whichblocksreceptorbindingandneutralizescytotoxicity.Microbiol.andImmunol.2002.46(11)777-780.)；2004年Inoue，KI(InoueKI，ItohK，NakaoHetal.CharacterizationofaShigatoxin1-neutralizingrecombinantFabfragmentisolatedbyphagedisplaysystem.TohokuJ.Exp.Med.2004.203295-303.)利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得具有Stx毒性中和效應(yīng)的重組Fab抗體片段。但臨床應(yīng)用有待于抗體制備工藝的改進完善。近年來日益引起人們研究關(guān)注的肽類小分子化合物，作為藥物具有很鮮明的技術(shù)優(yōu)勢，包括分子量小，結(jié)構(gòu)相對簡單，可通過化學合成或基因工程方法進行大量低成本制備；功能明確，免疫原性低，副作用小，安全性高；易于從多途徑吸收，給藥途徑可多樣化。小分子肽成為新藥篩選的重要來源之一(李越希，黃培堂。多肽在生物醫(yī)藥和診斷試劑中的應(yīng)用。中國生化藥物雜志2001.22(4)208-210.)。其中利用噬菌體肽庫具有高容量的特點，篩選具有毒素抑制作用的多肽分子就是可行的技術(shù)手段。目前針對志賀毒素的肽類抑制劑未見報道。
發(fā)明內(nèi)容為解決目前針對志賀毒素的抑制劑的缺乏，本發(fā)明提供了一種具有抑制志賀毒素毒性的短肽，該短肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。根據(jù)protparamtool軟件對上述短肽的理化性質(zhì)進行預測分析顯示其分子量為1419.7，具有較好的穩(wěn)定性，為疏水性短肽。本發(fā)明的抑制志賀毒素毒性的短肽是通過以下的方法進行制備的。首先通過基因工程技術(shù)和分子生物學方法，設(shè)計引物，對基因進行修飾，制備StxB基因，構(gòu)建重組表達StxB的原核基因工程菌-重組大腸桿菌，然后誘導表達并通過一系列純化步驟，制備高純度具有生物學活性的重組StxB蛋白。通過流式細胞技術(shù)檢測，該重組StxB蛋白通過Gb3受體能夠很好地結(jié)合于細胞表面，具有較好的結(jié)合活性，保持了其作為志賀毒素結(jié)合亞單位的生物學活性。利用噬菌體展示技術(shù)，以重組StxB為靶標，通過親和淘選步驟，從隨機線性十二肽庫中篩選獲得特異結(jié)合StxB的短肽。根據(jù)篩選出的與志賀毒素特異結(jié)合的短肽序列，搜索出一條出現(xiàn)頻率最高的序列，利用生物信息學方法對該短肽的理化性質(zhì)進行預測，結(jié)合預測分析結(jié)果，對該短肽進行化學修飾并合成。本發(fā)明的短肽可以通過本領(lǐng)域已知的化學合成或基因工程重組表達的方法進行制備?？梢栽诙屉腘端和C端通過添加化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、PEG、標記物等物質(zhì)進行各種化學或生物修飾，以優(yōu)化改善其穩(wěn)定性等理化性質(zhì)、提高或增加其應(yīng)用性和應(yīng)用范圍。特別地，本發(fā)明公開了在不改變本發(fā)明短肽的空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的前提下，在短肽的N端和C端分別進行乙?；揎椇桶被揎棧栽黾佣屉牡乃苄?。通過試驗測定本發(fā)明短肽與StxB特異結(jié)合活性，顯示其結(jié)合態(tài)穩(wěn)定，結(jié)合動力學表現(xiàn)優(yōu)良。志賀毒素毒性抑制效應(yīng)動物試驗顯示本發(fā)明的短肽與志賀毒素孵育后，較好地抑制了志賀毒素的毒性，對受試小鼠起到保護作用。通過上述體內(nèi)和體外試驗證實，本發(fā)明的短肽能通過抑制志賀毒素與宿主細胞受體的結(jié)合，具有抑制志賀毒素毒性的生物學效應(yīng)，具有良好的應(yīng)用前景，可以提供一種志賀毒素新的有效抑制劑，應(yīng)用于志賀毒素所引起相關(guān)疾病的治療，這些疾病包括由產(chǎn)毒志賀菌、腸出血性大腸桿菌O157或霍亂弧菌等產(chǎn)生志賀毒素的微生物所引起疾病。圖1為stxb的PCR擴增鑒定圖譜，其中1.DNAMarker；2.stxb的PCR擴增產(chǎn)物圖2為重組質(zhì)粒pBV220-stxb的雙酶切鑒定圖譜，其中1.pBV220-stxb雙酶切產(chǎn)物；2.DNAMarker圖3為重組大腸桿菌pBV220-stxb/DH5α誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜，其中1.蛋白分子量標準；2.重組菌未誘導對照；3.重組大腸桿菌誘導表達(箭頭所指處為目的蛋白)圖4為重組StxB純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜，其中1.純化后的StxB；2.蛋白分子量標準圖5為流式細胞術(shù)檢測FITC-StxB與Hela細胞的結(jié)合圖，(下列圖示A-D分別顯示，0μg、10μg、20μg、30μgFITC-StxB與Vero細胞的結(jié)合情況，結(jié)果證明重組制備的StxB能與靶細胞特異結(jié)合。)圖6為A6合成肽的質(zhì)譜分析7為A6合成肽純度的HPLC分析圖8為BIAcore系統(tǒng)動態(tài)分析A6合成肽與StxB的梯度特異結(jié)合。(圖中紫色、籃色、紅色、綠色、粉色曲線分別顯示，1∶15、1∶30、1∶60、1∶80、1∶100A6與StxB的動態(tài)結(jié)合情況，結(jié)果證明A6能與StxB特異結(jié)合，并具有量效關(guān)系)。圖9為A6合成肽的志賀毒素體內(nèi)中和實驗。具體實施例方式實施例1重組大腸桿菌pBV220-stxb/DH5α的構(gòu)建及重組StxB的表達、鑒定1.材料1.1菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基I型痢疾志賀菌51054購自中國藥品生物制品鑒定所，用于stxb基因的釣??；大腸桿菌DH5α購自道普公司，用于基因克隆菌株構(gòu)建和外源蛋白表達；溫度調(diào)控性高效表達質(zhì)粒pBV220購自Takara公司用于在大腸桿菌DH5α中表達外源蛋白。pMD18-T載體購自Takara公司，用于目的基因克隆。LB-Amp培養(yǎng)基(1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化鈉，pH7.0，50μg/mL氨芐青霉素)用于大腸桿菌的培養(yǎng)和外源蛋白的表達。1.2寡核苷酸引物根據(jù)GenBankAJ271153序列設(shè)計編碼stxb基因片段的5’端和3’端寡核苷酸引物，在各自5’末端分別引入EcoRI與PstI限制性酶切位點，并將上游引物中的密碼子替換為大腸桿菌中高頻使用密碼子。5’端和3’端寡核苷酸引物序列如下5’端引物5’GCGAATTCATGAAAAAAACCCTGCTGATCGCTGCATCG3’如序列表中序列2所示。3’端引物5’GCCTGCAGCTGAGCTATTCTGAGTCAAC3’如序列表中序列3所不。2.方法與結(jié)果2.1stxb基因的擴增和序列測定以I型痢疾志賀菌51054為模板，用pfuDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃5min；94℃30s，54℃30s，7℃30s(30個循環(huán))，72℃10min，擴增獲得270bp的片段。見圖1所示。獲得的PCR產(chǎn)物回收后，與pMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-T/stxb，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用ABIPRISM377DNA測序儀測序。2.2pBV220-stxb重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化以限制性內(nèi)切酶EcoRI與PstI將stxb基因從pMD18-T/stxb載體中切除回收，與同以EcoRI與PstI酶切的質(zhì)粒pBV220連接，獲得重組質(zhì)粒pBV220-stxb，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR方法鑒定陽性克隆。將stxb基因插入載體pBV220，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pBV220-stxb。質(zhì)粒以EcoRI與PstI酶切，產(chǎn)生與stxb基因大小一致的片段，stxb基因正確插入到pBV220載體(圖2)。將重組質(zhì)粒pBV220-stxb和pBV220分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以含50μg/mL氨芐青霉素LB的瓊脂平板挑選轉(zhuǎn)化子，分別命名為pBV220-stxb/DH5α和pBV220/DH5α。2.3重組StxB在大腸桿菌中的誘導表達選取如上述制備的重組大腸桿菌pBV220-stxb/DH5α，接種至含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜，次日以1100接種至LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)，至菌液濃度達到OD600為0.8～1.0，迅速提高溫度至41℃，繼續(xù)培養(yǎng)5h。4℃5000g離心10min，以預冷的PBS洗菌體一次，離心收集菌體，待超聲破碎。SDS-PAGE分析收集經(jīng)過41℃溫度誘導的重組菌體進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示重組菌體樣品中出現(xiàn)分子量為7.7kD的蛋白條帶(圖3)，與StxB預期分子量相符，凝膠掃描分析顯示重組蛋白占總蛋白量20％左右。2.4重組StxB的純化將離心收集的菌體用緩沖液A(20mMTris-HCl，10mMNaCl，1mMEDTA，pH7.4)懸浮，置于冰浴中超聲波破碎菌體，每次300W超聲波處理20s，間隙10s，90個循環(huán)。破碎后的菌體懸液4℃10000g離心10min。上清緩慢滴加飽和硫酸銨溶液至30％濃度，邊滴加邊攪拌，4℃靜置4h以上，4℃10000g離心10min，上清繼續(xù)滴加飽和硫酸銨至80％濃度，4℃靜置4h以上，4℃10000g離心10min，沉淀以緩沖液A復溶。復溶物裝入透析袋(截流分子量3.5kD)，4℃下攪拌以緩沖液A透析，4h換液一次，共4次。4℃10000g離心10min，棄沉淀，留取上清。透析后的樣品進行離子交換層析。上樣前以緩沖液A平衡QSepharoseTMHPHTrapTM柱，2mL/min上樣后仍以緩沖液A平衡，以緩沖液B(20mMTris-HCl，1MNaCl，pH7.4，)線性梯度洗脫，60min內(nèi)緩沖液B升至100％濃度，收集280nm洗脫峰，SDS-PAGE鑒定目的蛋白峰位。將離子交換層析收集獲得的StxB樣品，加樣至SephacryS-100凝膠柱(26/100)，以10mMPBS(pH7.4，)洗脫，流速0.5mL/min，收集280nm洗脫峰，SDS-PAGE鑒定目的蛋白峰位。StxB各步純化的SDS-PAGE分析見圖4。2.5重組StxB的結(jié)合活性分析將制備的StxB與FITC混合，裝入透析袋，以0.1MNaHCO3(pH8.6)溶液透析，至透析液中觀察不到顯著的FITC顏色。取1×105/mL的新鮮Hela細胞0.5mL，和FITC-StxB混合后置于37℃孵育2h，通過流式細胞技術(shù)檢測FITC-StxB與Hela細胞的結(jié)合。結(jié)果顯示，制備的StxB能夠很好地與靶細胞結(jié)合，保持了其作為志賀毒素受體結(jié)合區(qū)(亞單位)的生物學活性。結(jié)果如圖5所示。實施例2具有志賀毒素毒性抑制效應(yīng)的短肽的化學合成及活性鑒定1.材料Protparamtool軟件(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；本發(fā)明的短肽由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所合成，BIAcore3000生物傳感器系統(tǒng)為Pharmacia公司產(chǎn)品，Balb/C小鼠由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供，菌株S.dys51054購自中國生物藥物制品檢定所，StxB抗體購自Biodesign公司(ELISA效價為1∶200)。2.方法與結(jié)果2.1短肽A6的理化性質(zhì)預測利用protparamtool軟件對毒素結(jié)合短肽A6的理化性質(zhì)進行預測分析。顯示短肽A6分子量為1419.7，具有較好的穩(wěn)定性，為疏水性短肽，結(jié)果如下Numberofaminoacids12Molecularweight1419.7TheoreticalpI8.59FormulaC70H110N14O15S1Totalnumberofatoms210ExtinctioncoefficientsExtinctioncoefficientsareinunitsofM-1cm-1，at280nm.Ext.coefficient6990Abs0.1％(＝1g/1)4.924，assumingALLCysresiduesappearashalfcystinesEstimatedhalf-lifeTheN-terminalofthesequenceconsideredisY(Tyr).Theestimatedhalf-lifeis2.8hours(maemmalianreticulocytes，invitro).10min(yeast，invivo).2min(Escherichiacoli，invivo).InstabilityindexTheinstabilityindex(II)iscomputedtobe-10.47Thisclassifiestheproteinasstable.Aliphaticindex145.83Grandaverageofhydropathicity(GRAVY)1.1332.1短肽A6的化學修飾及體外合成在不改變短肽A6空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的前提下，在短肽A6的N端和C端分別進行乙?；揎椇桶被揎棧栽黾佣屉牡乃苄?。固相合成法進行化學合成，如圖6、7所示。2.2短肽A6與StxB特異結(jié)合的動態(tài)分析借助BIAcore生物傳感器系統(tǒng)，測定A6短肽與StxB特異結(jié)合活性。將StxB偶聯(lián)到芯片CM5上，偶聯(lián)量為785RU，以EDC/NHS活化和乙醇胺封閉。測定不同濃度的A6短肽與StxB結(jié)合的動力學常數(shù)。檢測流速在20μL/min下進行，由Sensorgram記錄曲線觀察A6短肽的動態(tài)結(jié)合過程。結(jié)果顯示，A6短肽與作為對照通道(Fcl)的無關(guān)蛋白結(jié)合的RU值為9.8，不同濃度A6短肽與StxB結(jié)合的RU值，隨著A6短肽濃度的逐漸增加(1∶100、1∶80、1∶60、1∶30、1∶15、1∶1)，短肽與StxB偶聯(lián)通道(Fc2)的結(jié)合量也隨之升高，RU值分別為17.3、28.4、49.5、246.7、367.4。圖8所示的結(jié)合動態(tài)曲線反映出了不同濃度A6短肽與StxB結(jié)合的動態(tài)過程，A6短肽呈現(xiàn)了較快速的結(jié)合(圖中“結(jié)合區(qū)”所示結(jié)合曲線上升趨勢明顯)，并且解離的很緩慢，(圖中“解離區(qū)”所示解離曲線沒有明顯下降趨勢)，其結(jié)合態(tài)穩(wěn)定，結(jié)合動力學表現(xiàn)優(yōu)良。2.3短肽A6的志賀毒素毒性抑制效應(yīng)2.3.1志賀毒素粗制品的制備接種S.dys51054于LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日按1∶100比例接種至1L培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)72h，5000rpm離心10min。菌體沉淀懸于PBS緩沖液，超聲波破碎細胞，10000rpm離心10min，上清滴加飽和硫酸銨溶液至50％濃度，收集鹽析沉淀，以PBS溶解并透析完全，得到志賀毒素粗制產(chǎn)物。2.3.2短肽A6的志賀毒素毒性抑制效應(yīng)將1×LD100志賀毒素(約65ul)與不同濃度的短肽A6分別混合至1ml，4℃孵育過夜。按照短肽A6使用劑量的不同，將小鼠分為6組，每組12只；另設(shè)PBS陰性對照組，即以PBS與志賀毒素混合；抗體陽性對照組，即以StxB抗體與志賀毒索混合。各組混合液體按照腹腔注射的方法，對小鼠進行攻毒，觀察72h存活狀況。結(jié)果顯示，陰性對照組中，全體小鼠在48h內(nèi)全部死亡；陽性對照組中，小鼠在72h觀察期內(nèi)，無死亡發(fā)生，72h后小鼠全部恢復正常狀態(tài)。實驗組中，各組小鼠出現(xiàn)眼睛閉合、皮毛聳立、四肢無力、不進食等志賀毒素中毒癥狀，嚴重程度與短肽A6使用劑量呈反比；短肽A6濃度達到75μg/mL時，小鼠存活率為8.3％(1/12)，濃度升至95μg/mL，小鼠存活率為58.3％(7/12)。結(jié)果證實，短肽A6與志賀毒素孵育中和后，較好地抑制了志賀毒素的毒性，對受試小鼠起到保護作用，結(jié)果如圖9所示。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所<120>一種抑制志賀毒素的短肽及其用途<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>12<212>PRT<213><400>1TyrIleTrpLysProMetGlyThrValLeuLeuVal1510<210>2<211>38<212>DNA<213><400>2gcgaattcatgaaaaaaaccctgctgatcgctgcatcg38<210>3<211>28<212>DNA<213><400>3gcctgcagctgagctattctgagtcaac28權(quán)利要求1.一種抑制志賀毒素的短肽，其特征在于該短肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.具有權(quán)利要求1所述短肽生物學活性的修飾肽，其特征在于在權(quán)利要求1的短肽的N端、C端添加化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、PEG或標記物物質(zhì)進行化學或生物修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述修飾肽，其特征在于在權(quán)利要求1的短肽的N端和C端進行的修飾分別為乙?；揎椇桶被揎?。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述修飾肽，其特征在于該修飾肽為單價或多價。5.權(quán)利要求1所述短肽的制備方法為化學合成或基因工程重組方法。6.權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述抑制志賀毒素的短肽或其修飾肽在制備由志賀毒素所引起相關(guān)疾病的治療藥物中的用途。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述用途，其中志賀毒素來自產(chǎn)生志賀毒素的微生物產(chǎn)毒志賀菌、腸出血性大腸桿菌O157或霍亂弧菌。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用途，其中產(chǎn)毒志賀菌為菌株S.dys51054。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制志賀毒素的短肽，該短肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示，可以通過化學合成或基因重組表達的方法進行大量制備，可以在短肽N端和C端通過添加化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、PEG、標記物等物質(zhì)進行各種化學或生物修飾，以優(yōu)化改善其穩(wěn)定性等理化性質(zhì)、提高或增加其應(yīng)用性和應(yīng)用范圍。該短肽具有中和志賀毒素，有效抑制志賀毒素毒性的效應(yīng)，可以作為毒素拮抗劑用于由產(chǎn)毒志賀菌、腸出血性大腸桿菌O157、霍亂弧菌等引起的疾病的治療。文檔編號A61P39/00GK101016332SQ200710064228公開日2007年8月15日申請日期2007年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日發(fā)明者王慧,包士中,蔭俊,史晶,侯曉軍,蔡昆申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所