用于測定食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(stec)的存在或不存在的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及將在短時間段內(nèi)產(chǎn)生關(guān)于食物樣品中的致病性STEC(產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌)的存在或不存在的可靠結(jié)果的方法。該方法包括-使食物樣品在允許大腸桿菌生長的培養(yǎng)基中溫育，以獲得大腸桿菌儲液培養(yǎng)基；-執(zhí)行儲液培養(yǎng)基中的大腸桿菌裂解，以獲得包含大腸桿菌DNA的樣品溶液；和-使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對樣品溶液實施第一系列的聚合酶鏈反應(PCR)：●分別編碼志賀毒素1和志賀毒素2的stx1和/或stx2，●對于待測定的每個STEC血清群，編碼緊密粘附素的該血清群的eae基因的亞型，和●對于待測定的每個STEC血清群，對于該血清群特異性的生物標記基因；并且在第一系列的PCR中擴增stx1和/或stx2以及至少一個血清群的eae基因和特異性生物標記基因的情況下：-通過對大腸桿菌儲液培養(yǎng)基的濃縮物執(zhí)行第二系列的PCR，和任選地，對衍生自濃縮物的單一大腸桿菌菌落執(zhí)行第三系列的PCR，驗證STEC的一個或多個特異性血清群的存在。
【專利說明】用于測定食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC)的存在 或不存在的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于測定食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Escherichia coli) (STEC)的存在或不存在的方法，在此類方法中使用的反應盒，以及容納反應盒的儀器。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在STEC的菌株中，已鑒定了與人的嚴重疾病相關(guān)的七個血清群，即0157、026、 045、0103、0111、0121和0145。這些血清群在下文中被稱為STECTop7。美國農(nóng)業(yè)部（United States Department of Agriculture) (USDA)已實施可應用于某些生牛肉產(chǎn)品的分析的法 規(guī),該法規(guī)將除血清群0157之外的如上鑒定的六種其他血清群定義為摻雜物。
[0004] 當測定這些STEC菌株的存在或不存在時，通常將食物樣品加入允許大腸桿菌生 長的培養(yǎng)基中，以提供大腸桿菌儲液培養(yǎng)基。
[0005] 隨后，儲液培養(yǎng)基中的大腸桿菌的裂解提供了包含大腸桿菌DNA的樣品溶液。
[0006] 使用常規(guī)方法以可靠方式在樣品中對上述血清群的后續(xù)檢測是耗時操作。
[0007] 在IS013136技術(shù)規(guī)范（IS0/TS13136:2012)中闡述使用聚合酶鏈反應（PCR)用于 檢測主要STEC毒力基因 stxl、stx2、eae和血清群特異性基因。PCR陽性樣品必須通過培 養(yǎng)方法加以證實，因為不同的基因可以屬于不同的菌株，導致假陽性結(jié)果。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明的目的是提供在更短的時間段內(nèi)產(chǎn)生關(guān)于食物樣品中致病性STEC的存在 或不存在的可靠結(jié)果的方法。
[0010] 這個目的通過如權(quán)利要求1中所述的方法得到解決。
[0011] 令人驚訝的是，由于其特定的工作流程，根據(jù)本發(fā)明的方法允許假陽性結(jié)果率的 降低以及菌落分離的優(yōu)化。由此可以顯著簡化食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC)的 一個或多個特異性血清群的存在或不存在的測定。
[0012] 更具體而言，本發(fā)明提供了以非常有時間效率的方式用于鑒定和證實食物樣品中 高致病性STEC的存在或不存在的方法，在所述方法中，通過使食物樣品在培養(yǎng)基中溫育而 獲得大腸桿菌儲液培養(yǎng)基以及裂解儲液培養(yǎng)基中含有的大腸桿菌后，對這種含DNA的樣品 溶液實施使用特異性引物的第一系列的PCR反應。這可以稱為第一篩選步驟。該第一篩選 步驟允許同時檢測編碼志賀毒素的stxl和/或stx2毒力基因、編碼與一個或多個血清群 特異性相關(guān)的緊密粘附素（intimin)的eae亞型、以及每個血清群的生物標記基因。
[0013] 隨后，假定的陽性標品將必須加以證實。
[0014] eae亞型的檢測允許基本上減少假陽性樣品的數(shù)目。
[0015] 在優(yōu)選實施方案中，對陽性樣品實施第二篩選步驟，其中衍生自大腸桿菌儲液培 養(yǎng)基的免疫濃縮物再一次在PCR分析中進行檢查。
[0016] 在該第二篩選步驟獲得陽性結(jié)果的情況下，將免疫濃縮物的部分在顯色培養(yǎng)基上 鋪平板，以將各自STEC菌株分離為菌落。
[0017] 衍生自這些分離的菌落的DNA可以進行PCR測試，以證實stx和eae毒力基因以 及任選地血清群生物標記基因的存在。
[0018] 在陰性樣品的情況下，最終結(jié)果在從食物樣品開始的約12小時內(nèi)是可獲得的。在 陽性樣品的情況下，最終結(jié)果在約2天內(nèi)是可獲得的。
[0019] 此外，本發(fā)明還涉及設計用于上文概述的本發(fā)明方法中的根據(jù)權(quán)利要求13的反 應盒。
[0020] 本發(fā)明的另一個方面在于權(quán)利要求15中限定的儀器。
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括驗證STEC的一個或多個特異性血清群的存在，其包括
[0023] -使用針對各自血清群的STEC的抗體，對于每個血清群具有溫育的食物樣品的培 養(yǎng)基執(zhí)行免疫濃縮；
[0024] -從免疫濃縮物中分離DNA ;和
[0025] -使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對DNA實施第二系列的PCR :
[0026] · stxl 和 / 或 stx2，
[0027] ?各自血清群的eae基因的亞型，和
[0028] ?任選地，對于各自血清群特異性的生物標記基因。
[0029] 更優(yōu)選地，在第二系列的PCR中擴增stxl和/或stx2以及eae基因的情況下， STEC的一個或多個特異性血清群的存在的驗證進一步包括：
[0030] -在顯色培養(yǎng)基上鋪平板免疫濃縮物，以允許分離的大腸桿菌菌落的生長；
[0031] -從分離的菌落中分離DNA ;和
[0032] -使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對DNA實施第三系列的PCR :
[0033] · stxl 和 / 或 stx2，
[0034] ?各自血清群的eae基因的亞型，和
[0035] ?任選地，對于各自血清群特異性的生物標記基因。
[0036] 優(yōu)選地，用特異性標記的DNA探針執(zhí)行系列的PCR，以允許檢測擴增的基因或其片 段。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明，待測定的特異性血清群優(yōu)選地選自0157、026、045、0103、0111、0121 和 0145。
[0038] 雖然本發(fā)明的方法允許鑒定一個或幾個特異性血清群，但更優(yōu)選地，該方法包括 在一步中測定所有血清群0157、026、045、0103、0111、0121和0145的存在或不存在。
[0039] 此外，優(yōu)選從下述中選擇在系列的PCR中擴增的eae基因的亞型：關(guān)于026的 eaeP，關(guān)于 0145 和 0157 的 eae Y，關(guān)于 045、0103 和 0121 的 eae ε，以及關(guān)于 0111 的 eae Θ。
[0040] 當執(zhí)行本發(fā)明的方法時，優(yōu)選地特異性生物標記基因選自各自血清群的0-抗原 轉(zhuǎn)運蛋白基因。
[0041] 雖然本發(fā)明的方法可應用于廣泛范圍的食物樣品，但優(yōu)選地，食物樣品選自生肉、 生乳制品或生蔬菜制品特別是芽。
[0042] 用于溫育步驟的培養(yǎng)基優(yōu)選地選自緩沖蛋白胨水，任選包含吖啶黃素；胰蛋白酶 大豆培養(yǎng)湯（TSB)，任選包含新生霉素（novobiocine);和經(jīng)修飾的胰蛋白酶大豆培養(yǎng)湯 (mTSB)，任選包含新生霉素。
[0043] 本發(fā)明的方法優(yōu)選以自動化方式同時執(zhí)行每個系列的PCR，從而使得用于PCR的 裝置允許最終結(jié)果的自動評估和指示。
[0044] 依照本發(fā)明方法的優(yōu)選變體，用于免疫濃縮的抗體選自單克隆抗體或多克隆抗 體。
[0045] 用于將免疫濃縮物鋪平板的顯色培養(yǎng)基優(yōu)選地選自頭孢克肟-亞碲酸鹽山梨糖 醇麥康凱（Cefixime-Tellurite Sorbitol McConkey) (CT-SMAC);含有新生霉素、頭孢克月虧 三水合物和亞碲酸鉀的改良彩虹瓊脂（mRBA);胰蛋白胨膽汁X葡糖苷酸培養(yǎng)基（TBX);和 頭孢克廂-亞締酸鹽鼠李糖麥康凱（Cefixime-Tellurite Rhamnose McConkey) (CT-RMAC)。
[0046] 本發(fā)明還涉及特別適合用于本發(fā)明的方法中的反應盒。
[0047] 此類反應盒設計用于對含DNA樣品溶液執(zhí)行系列的PCR，并且包括多個反應室和 儲庫。樣品溶液可以進料到儲庫內(nèi)，并且經(jīng)由連接每個反應室與儲庫的導管均勻分布到反 應室內(nèi)。反應室的至少一些預裝載有引物和探針，以擴增下述大腸桿菌基因或其片段：
[0048] -stxl 和 / 或 stx2，
[0049] -選自0157、026、045、0103、0111、0121和0145的一個或多個血清群的eae基因 的亞型，和
[0050] -任選地，對于選自0157、026、045、0103、0111、0121和0145的一個或多個血清 群特異性的生物標記基因。
[0051] 此外，本發(fā)明還涉及自動執(zhí)行系列的PCR的儀器，其中該儀器適合于容納上述反 應盒。該儀器包括
[0052] -借助于各自探針，用于檢測擴增的大腸桿菌基因的檢測工具；
[0053] -用于控制PCR執(zhí)行的控制工具，其中軟件儲存于控制工具中，所述軟件能夠根據(jù) 算法評估檢測到的大腸桿菌基因，從而使得對于每個血清群生成最終結(jié)果，其取決于關(guān)于 stxl和/或stx2、該血清群的eae基因的亞型和任選地對于該血清群特異性的生物標記基 因的檢測結(jié)果；和
[0054] -用于在光學和/或聽覺上指示每個血清群的最終結(jié)果的指示器工具。
[0055] 本發(fā)明的上述方面和優(yōu)點在下文與附圖和具體實施例結(jié)合更詳細地公開。
[0056] 附圖簡述
[0057] 在附圖中：
[0058] 圖1顯示與現(xiàn)有技術(shù)方法（IS013136技術(shù)規(guī)范）比較的本發(fā)明方法；
[0059] 圖2顯示與其他現(xiàn)有技術(shù)方法比較的本發(fā)明方法；
[0060] 圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的用于PCR分析的儀器的圖示；
[0061] 圖4顯示本發(fā)明的PCR反應盒的橫斷面視圖；
[0062] 圖5顯示本發(fā)明的PCR反應盒的頂視圖；和
[0063] 圖6顯示用于生成作為PCR結(jié)果的函數(shù)的最終結(jié)果的算法的流程圖。
[0064] 附圖和實施例詳述
[0065] 圖1在左側(cè)上顯示關(guān)于名稱為STEC Top7的本發(fā)明方法的優(yōu)選工作流程。在右側(cè) 上顯示對應于IS0/TS13136:2012的常規(guī)工作流程。
[0066] 兩種方法均以食物樣品開始，所述食物樣品已在允許大腸桿菌生長的培養(yǎng)基中溫 育，導致富集的樣品（大腸桿菌儲液培養(yǎng)基）。
[0067] 后續(xù)，執(zhí)行在培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌的裂解例如在96管的裂解平板（未示出） 中，以便獲得包含大腸桿菌DNA的樣品溶液。
[0068] 迄今為止操作對于本發(fā)明方法和常規(guī)工作流程是相同的。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明工作流程，使用擴增特異性大腸桿菌基因或其片段的引物和探針，對 樣品溶液實施第一系列的聚合酶鏈反應（PCR)。優(yōu)選地，如圖1中所示，工作流程在該步驟 包括所有 STEC Top7 的擴增，S卩關(guān)于 0157、026、045、0103、0111、0121 和 0145 各自的 stxl、 Stx2、eae變體（亞型）和生物標記基因。在不存在這些血清群中任一個的情況下，本發(fā)明 工作流程在約12小時或更少的時期內(nèi)終止（溫育和裂解約11小時和PCR約1小時）。
[0070] 在報告陽性結(jié)果的情況下，使用針對各自的一個或多個血清群的STEC的抗體制 備大腸桿菌儲液培養(yǎng)基的免疫濃縮物，隨后
[0071] -從免疫濃縮物中分離DNA ;和
[0072] -使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對DNA實施第二系列的PCR :
[0073] · stxl 和 / 或 stx2，
[0074] ?各自血清群的eae基因的亞型，和
[0075] ?任選地，對于各自血清群特異性的生物標記基因。
[0076] 如果獲得陰性結(jié)果，則工作流程可以終止。
[0077] 在獲得陽性結(jié)果的情況下，優(yōu)選地，將免疫濃縮物另外鋪平板到顯色培養(yǎng)基上，以 允許分離的大腸桿菌菌落的生長。在進一步的步驟中，從分離的菌落中分離DNA，并且使用 擴增大腸桿菌基因或其片段的引物，實施第三系列的PCR。由此，可以鑒定致病性STEC的血 清群。在此類情況下，最終結(jié)果在約2天或更少時間內(nèi)可獲得。
[0078] 根據(jù)常規(guī)IS0/TS13136:2012的工作流程不同于本發(fā)明方法之處在于第一篩選針 對stx和一般的eae基因。在第二篩選步驟中，僅覆蓋STEC Top5,而本發(fā)明的方法可以覆 蓋所有Τορ7血清群。
[0079] 在第一階段僅獲得陰性結(jié)果的情況下，常規(guī)工作流程需要約24小時。在必須證實 陽性結(jié)果的情況下，工作流程花費約4天。
[0080] 圖 2 顯不與如由 Microbiology Laboratory Guidebook of the US-Department of Agriculture，第3版，1998 (MLG5&MLG5B. 01)提出的方法（其在僅獲得陰性結(jié)果的情況 下，需要約24小時，并且需要約3天證實陽性結(jié)果）相比較的本發(fā)明方法。
[0081] 圖3顯示了適合于執(zhí)行本發(fā)明方法的PCR的儀器10的圖示。
[0082] 儀器10包括優(yōu)選盤狀配置的反應盒12,其具有在其外周上的多個反應室或孔14 和在中央位置中的儲庫16,所述反應室14經(jīng)由徑向延長的管道18與儲庫連接。
[0083] 此類優(yōu)選反應盒12在下文中也被稱為"GeneDisc"，在圖4和5中更詳細地顯示。
[0084] 反應盒12的孔14的典型數(shù)目為三十六?？?4可以分組為多個扇區(qū)19例如六個 扇區(qū)（被稱為GeneDisc扇區(qū)）。一組扇區(qū)19的孔14可以經(jīng)由個別通道18與儲庫16的共 同分區(qū)22連接。
[0085] 此類盒12可以進行修飾，以提供本發(fā)明的盒，其中反應室14中的至少一些預裝載 有引物和探針，以擴增stxl和/或stx2、和選自0157、026、045、0103、0111、0121和0145 的一個或多個血清群的eae基因的亞型，或各自基因的片段。優(yōu)選地，反應器14也預裝載 有引物和探針以擴增對于這些血清群中的一個或多個特異性的生物標記基因。
[0086] 儀器10進一步包括具有四個不同區(qū)（其中三個區(qū)26、27、28是可見的）的優(yōu)選環(huán) 狀的加熱裝置24,其可以加熱至四個不同溫度。反應盒12置于加熱裝置24之上。反應盒 12的孔14放置接近于加熱裝置24或與加熱裝置24接觸。
[0087] 儀器10包括用于旋轉(zhuǎn)反應盒12的工具30,其就加熱裝置24而言允許在反應室或 孔14的溫度的循環(huán)變化。
[0088] 加熱裝置24的每個區(qū)中的溫度可以是均一的，或必要時，溫度可以沿著梯度改 變。
[0089] 儀器10進一步包括設置在盒12上方的熒光激發(fā)和檢測工具32,以便對于每個循 環(huán)激發(fā)并測量反應室14的內(nèi)容物的熒光。
[0090] 此類儀器10詳細公開于W02002/009877A1中，并且可作為GeneDisc Cycler(Pall GeneDisc Technologies)獲得。
[0091] 通常，每個PCR循環(huán)要求其中孔加熱至約95°C的溫度以使靶DNA變性的第一時期， 隨后使用約55°C至約65°C的溫度用于引物退火的第二時期，和通常在約72°C下進行的用 于DNA鏈延長的第三時期。然而，PCR可以依照本發(fā)明方法用簡化循環(huán)進行，其中退火和延 伸在相同溫度下進行，從而使得每個循環(huán)僅需要兩個不同溫度。儀器10的加熱裝置24的 單個區(qū)設為實現(xiàn)此類溫度。
[0092] 優(yōu)選地，對于待擴增的靶序列特異性的引物和探針預分布在反應室或孔14中。儲 庫16或其分區(qū)意欲接受由待分析的核酸樣品和聚合酶鏈擴增反應所需的試劑（除了引物 和探針之外）組成的流體。
[0093] 在優(yōu)選變化中，能夠?qū)碜詢斓暮写治龅暮怂針悠泛蚉CR所需的試劑的流 體分布在含有用于待擴增的靶核酸序列的特異性引物和探針的多個反應室中，并且借助于 包括所述反應室14和所述加熱裝置24(具有可以加熱至不同溫度的四個不同區(qū)）的反應 盒12的循環(huán)相對運動，通過連續(xù)多次對室的內(nèi)容物順序?qū)嵤┎煌瑴囟龋醋冃?、退火和?伸所需的那些）引起擴增過程。
[0094] 必要時，反應室14可以含有除上述引物外的實時PCR反應所需的試劑。在儀器的 優(yōu)選實施方案中，除引物之外，反應室14還包含對于待擴增的序列特異性的一種或多種探 針。探針在反應室14中的分布還可以是這樣的，從而使得某些室包含對于待擴增的序列特 異性的探針，并且其他室包含不先驗識別待擴增的序列的對照探針。這些探針可以進行標 記，并且如果多種探針存在于一個和相同反應室（例如對于待擴增的序列特異性的探針和 對照探針）中，則這些探針優(yōu)選用不同熒光團進行標記。
[0095] 優(yōu)選地，通過儀器10以自動方式進行并評估PCR反應，即在反應盒12已插入儀器 10內(nèi)之后無需用戶干預。借助于熒光標記的探針，擴增的序列可以通過如上所述的檢測工 具32進行檢測，并且待擴增的每個序列的結(jié)果可以對用戶指示。
[0096] 在優(yōu)選實施方案中，儀器10根據(jù)本發(fā)明進行修飾，并且進一步包括不僅控制PCR 執(zhí)行，還用于評估由檢測工具32檢測的擴增序列的控制工具，以給用戶提供最終結(jié)果。 [0097] 當執(zhí)行本發(fā)明方法時，根據(jù)算法評估對應于檢測到的大腸桿菌基因的來自檢測工 具32的輸入信號，從而使得取決于關(guān)于stxl和/或stx2、該血清群的eae基因的亞型和 任選地對于該血清群特異性的生物標記基因的檢測結(jié)果，對于每個血清群通過改良儀器10 生成最終結(jié)果。
[0098] 改良儀器10中實現(xiàn)的優(yōu)選算法的簡化工作流程顯示于圖6中。在這種情況下，評 估關(guān)于Stx、給定血清群的eae變體（亞型）和生物標記基因的PCR結(jié)果。PCR結(jié)果可以 是"陽性的"、"陰性的"或"不可用的"。在該算法中，編碼志賀毒素的stx基因是優(yōu)先靶，從 而使得關(guān)于這些基因的陰性PCR結(jié)果導致陰性最終結(jié)果，不管eae和生物標記基因的PCR 結(jié)果是什么。最終結(jié)果可以是"陽性的"（存在STEC)、"陰性的"（不存在STEC)或"無效 的"（在所述情況下，測定法應重復）。陽性最終結(jié)果需要關(guān)于所有三種靶基因的陽性PCR 結(jié)果。
[0099] 算法通過儲存于根據(jù)本發(fā)明的改良儀器10的控制工具中的軟件執(zhí)行。
[0100] 本發(fā)明的儀器10進一步包括指示器，例如用于在光學和/或聽覺上指示例如顯示 每個STEC血清群的最終結(jié)果的顯示工具（未示出）。 實施例
[0101] 樣品制備
[0102] 待檢查產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的一個或多個特異性血清群的存在或不存在的食物 樣品，在41.5±1°C下預加溫的常規(guī)培養(yǎng)基（例如緩沖蛋白胨水）中溫育，以允許大腸桿菌 的生長，獲得富集的樣品（大腸桿菌儲液培養(yǎng)基）。將50 μ L份的富集的樣品轉(zhuǎn)移到包含 96管的預填充的裂解平板內(nèi)，所述管各自預填充有500 μ L在水中稀釋至按重量計20 %的 Chelex-100。在用鋁片封閉管后，將裂解平板在預加熱至102±2°C的熱塊中放置10分鐘。 當裂解步驟完成時，鋁片用尖端刺穿，以收集36 μ L份的裂解產(chǎn)物，將所述裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至 6扇區(qū)的盤狀反應盒中。
[0103] 將剩余大腸桿菌儲液培養(yǎng)基貯存于5±3°C下用于后續(xù)驗證步驟。
[0104] GeneDisc PCR 測定法
[0105] 允許裂解產(chǎn)物在室溫下靜置5分鐘，隨后裝載到反應盒（即一份樣品/扇區(qū)）內(nèi)。 該STEC Top7GeneDiSC的每個扇區(qū)包含6個單獨孔，所述孔含有允許檢測14種靶基因的脫 水的引物和探針（參見表1和2,其中血清群代表各自的生物標記基因）。
[0106] 通過使用由下述兩種熒光團（報道物）之一標記的探針進行PCR產(chǎn)物的熒光檢 測：FAM(=羧基熒光素）和R0X(=羧基羅丹明），從而使得每個孔可以用于擴增兩種或三 種基因。
[0107] 表 I :STEC Top7GeneDisc 扇區(qū)的配置。
[0108]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于測定食物樣品中致病性產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC)的一個或多個特異性 血清群的存在或不存在的方法，其包括 -使所述食物樣品在允許大腸桿菌生長的培養(yǎng)基中溫育，以獲得大腸桿菌儲液培養(yǎng) 基； _執(zhí)行所述儲液培養(yǎng)基中的大腸桿菌裂解，以獲得包含大腸桿菌DNA的樣品溶液；和 -使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對所述樣品溶液實施第一系列的聚合 酶鏈反應（PCR): ?分別編碼志賀毒素1和志賀毒素2的stxl和/或stx2, ?對于待測定的每個STEC血清群，編碼緊密粘附素的該血清群的eae基因的亞型，和 ?對于待測定的每個STEC血清群，對于該血清群特異性的生物標記基因； 并且在第一系列的PCR中擴增stxl和/或stx2以及至少一個血清群的所述eae基因 和所述特異性生物標記基因的情況下： -通過對大腸桿菌儲液培養(yǎng)基的濃縮物執(zhí)行第二系列的PCR，和任選地，對衍生自所述 濃縮物的單一大腸桿菌菌落執(zhí)行第三系列的PCR，以驗證STEC的一個或多個特異性血清群 的存在。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中對STEC的一個或多個特異性血清群的存在的驗證包括 _使用針對所述各自血清群的STEC的抗體，執(zhí)行關(guān)于每個血清群的所述大腸桿菌儲液 培養(yǎng)基的免疫濃縮； -從所述免疫濃縮物中分離DNA ;和 -使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對所述DNA實施第二系列的PCR : ? stxl 和 / 或 stx2, 籲所述各自血清群的eae基因的亞型，和 ?任選地，對于所述各自血清群特異性的生物標記基因。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中在所述第二系列的PCR中擴增stxl和/或stx2以及eae 基因的情況下，存在STEC的一個或多個特異性血清群的驗證進一步包括： -在顯色培養(yǎng)基上鋪平板所述免疫濃縮物，以允許分離的大腸桿菌菌落的生長； -從所述分離的菌落中分離DNA ;和 -使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對所述DNA實施第三系列的PCR : ? stxl 和 / 或 stx2, 籲所述各自血清群的eae基因的亞型，和 ?任選地，對于所述各自血清群特異性的生物標記基因。
4. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中用特異性標記的DNA探針執(zhí)行所述系列的PCR， 以允許檢測所述擴增的基因或片段。
5. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中待測定的一個或多個特異性血清群選自0157、 026、045、0103、0111、0121 和 0145。
6. 權(quán)利要求5的方法，其包括測定所有血清群0157、026、045、0103、0111、0121和0145 的存在或不存在。
7. 權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的方法，其中待在所述系列的PCR中擴增的所述eae基因的 亞型選自關(guān)于026的eae 0，關(guān)于0145和0157的eae Y，關(guān)于045、0103和0121的eae e， 以及關(guān)于0111的eae 9。
8. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述特異性生物標記基因選自所述各自血清群 的〇-抗原轉(zhuǎn)運蛋白基因。
9. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述食物樣品選自生肉特別是生牛肉、生乳制 品或生蔬菜制品特別是芽。
10. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中用于所述溫育步驟的所述培養(yǎng)基選自 緩沖蛋白胨水，任選包含吖啶黃素；胰蛋白酶大豆培養(yǎng)湯（TSB)，任選包含新生霉素 (novobiocine);和經(jīng)修飾的胰蛋白酶大豆培養(yǎng)湯（mTSB)，任選包含新生霉素。
11. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述每個系列的PCR優(yōu)選以自動化方式同時 執(zhí)行。
12. 權(quán)利要求3-11中任一項的方法，其中所述顯色培養(yǎng)基選自頭孢克肟-亞碲酸鹽 山梨糖醇麥康凱（CT-SMAC);含有新生霉素、頭孢克肟三水合物和亞碲酸鉀的改良彩虹瓊 月旨（mRBA);胰蛋白胨膽汁X葡糖苷酸培養(yǎng)基（TBX);和頭孢克肟-亞碲酸鹽鼠李糖麥康凱 (CT-RMAC)。
13. -種用于對含DNA樣品溶液執(zhí)行系列的PCR的反應盒，其包括多個反應室和儲庫， 所述樣品溶液可以由所述儲庫均勻分布到所述反應室內(nèi)，其中所述反應室的至少一些預裝 載有引物和探針，以擴增下述大腸桿菌基因或其片段 -stxl 和 / 或 stx2,和 -選自0157、026、045、0103、0111、0121和0145的一個或多個血清群的eae基因的亞 型。
14. 權(quán)利要求13的反應盒，其中進一步地，所述反應室的至少一些預裝載有引物和探 針，以擴增下述大腸桿菌基因或其片段： -對于選自0157、026、045、0103、0111、0121和0145的一個或多個血清群特異性的生 物標記基因。
15. -種用于自動執(zhí)行系列的PCR的儀器，其中所述儀器適合于容納權(quán)利要求13或14 的反應盒，并且其中所述儀器包括 _借助于所述各自探針，用于檢測所述擴增的大腸桿菌基因的檢測工具； -用于控制所述PCR執(zhí)行的控制工具，其中軟件儲存于所述控制工具中，所述軟件能夠 根據(jù)算法評估所述檢測到的大腸桿菌基因，從而使得對于每個血清群生成最終結(jié)果，其取 決于關(guān)于stxl和/或stx2、該血清群的eae基因的亞型和任選地對于該血清群特異性的生 物標記基因的檢測結(jié)果；和 _用于在光學和/或聽覺上指示每個血清群的最終結(jié)果的指示器工具。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419766SQ201410442833
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】S·哈利爾-蘇里爾, Y·王, C·納許特, M·魯梅爾哈德, S·耶馬爾, S·布頓, V·V·威爾德 申請人:帕爾基因盤技術(shù)公司