本發(fā)明屬于中藥制劑分析領(lǐng)域，涉及一種益氣養(yǎng)血顆粒hplc指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜。

背景技術(shù)：

1、手術(shù)、放化療都是腫瘤患者抗癌去邪的有效手段，治療的目標(biāo)是著眼于消滅癌性病灶和癌細(xì)胞，但會影響機(jī)體的抗癌能力和臟腑功能。腫瘤的消耗，手術(shù)、放化療的介入，特別是化療的毒副作用，使得癌癥患者常存在陰陽失調(diào)、氣血虧虛、臟腑功能低下等正氣虧虛現(xiàn)象。

2、中西醫(yī)結(jié)合在“古為今用，洋為中用，推陳出新”的方針指引下，繼承和發(fā)揚(yáng)祖國醫(yī)學(xué)，針對惡性腫瘤的中醫(yī)病因、病機(jī)、治則進(jìn)行廣泛深入的研究。針對該類患者，以整體觀念為指導(dǎo)，通過辨證論治，以補(bǔ)虛固本的扶正培本法應(yīng)用于腫瘤患者的治療。中醫(yī)藥扶正固本、調(diào)整陰陽，可以提高患者的免疫功能，減輕手術(shù)的損傷及放化療的毒副作用并同時干預(yù)癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到減輕患者痛苦，提高生存質(zhì)量，延長生存期，降低死亡率的目的。

3、益氣養(yǎng)血顆粒由黃芪、黨參、女貞子、當(dāng)歸、淫羊藿、山茱萸、丹參7味原料藥材制成，本組方來源于吳咸中院士“補(bǔ)氣養(yǎng)血法”的代表方“益氣養(yǎng)血方”，具有益氣養(yǎng)血，扶正固本的功效，用于腫瘤患者配合化、放療，以減輕反應(yīng)，平素體弱及術(shù)后調(diào)理。本方以黃芪、黨參健脾補(bǔ)氣固本為君；輔以女貞子、當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血為臣，君臣相配可使氣壯血生，陰陽調(diào)合；佐以山茱萸、淫羊藿以補(bǔ)腎壯陽，填精補(bǔ)髓，以益氣血之源；再以丹參為使藥，起到活血祛瘀通經(jīng)，補(bǔ)益而不滋膩。本方藥簡力專，涉及氣血陰陽及脾腎二臟，對于病后體虛的患者多有裨益。

4、為了確保益氣養(yǎng)血顆粒工藝制備過程質(zhì)量穩(wěn)定可控，本發(fā)明對其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。中藥指紋圖譜是一種多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法，它可以比較全面的反映制劑所含藥效成分的種類和含量，從而能夠全面、宏觀、綜合地反映和控制中藥制劑的質(zhì)量。

5、本發(fā)明公開了一種益氣養(yǎng)血顆粒hplc指紋圖譜的建立方法，以及用該方法制作的益氣養(yǎng)血顆粒hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。在使用相似度進(jìn)行評價的情況下，可用其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對益氣養(yǎng)血顆粒的質(zhì)量進(jìn)行全面地評價和控制，從而保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性及臨床用藥的安全性和有效性。

6、目前尚未見以指紋圖譜控制益氣養(yǎng)血顆粒質(zhì)量的報道，因此，亟需提供一種益氣養(yǎng)血顆粒的指紋圖譜的建立方法，以保證產(chǎn)品質(zhì)量，為益氣養(yǎng)血顆粒的真?zhèn)舞b別和內(nèi)在質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)，為保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性及臨床用藥的安全性與有效性提供了一個可靠的分析方法和技術(shù)手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有益氣養(yǎng)血顆粒的質(zhì)量控制方法不足，提供了一種益氣養(yǎng)血顆粒hplc指紋圖譜的建立方法，該方法將益氣養(yǎng)血顆粒制備成供試品溶液，經(jīng)過hplc分離檢測，從而獲得益氣養(yǎng)血顆粒hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)全方位、多方面檢測，完善其質(zhì)量控制體系，進(jìn)而為益氣養(yǎng)血顆粒的真?zhèn)舞b別和內(nèi)在質(zhì)量提供可靠依據(jù)。

2、本發(fā)明一種益氣養(yǎng)血顆粒hplc指紋圖譜的建立方法，具體技術(shù)方案如下：

3、1）對照品和供試品溶液的制備

4、稱取莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、特女貞苷、黨參炔苷、丹酚酸b、淫羊藿苷、寶藿苷ⅰ對照品適量，用甲醇溶解，作為對照品溶液；

5、精密稱取供試品適量，加入甲醇，超聲處理，放冷，補(bǔ)足減失甲醇重量，離心，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

6、2）hplc色譜條件的確定

7、色譜柱為perkin?elmer?brownlee?validated?aq?c18柱；流動相a為乙腈，流動相b為甲酸溶液；采用梯度洗脫；檢測波長為多波長；流速為1.0?ml/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為10?μl。

8、3）指紋圖譜的制作

9、按步驟2）色譜條件對對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行分析比較，得到由樣品共有特征峰構(gòu)成的益氣養(yǎng)血顆粒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

10、優(yōu)選地，所述的益氣養(yǎng)血顆粒為益氣養(yǎng)血顆粒。

11、優(yōu)選地，步驟1）所述供試品溶液，按如下步驟制備：精密量取益氣養(yǎng)血顆粒5?g，置50?ml三角瓶中，精密加入20?ml甲醇稱定重量，超聲處理，放冷，補(bǔ)足減失甲醇重量，離心，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

12、優(yōu)選地，步驟2）中色譜柱的規(guī)格為4.6×250?mm，粒徑5?μm。

13、優(yōu)選地，步驟2）中流動相b為0.1%的甲酸溶液。

14、優(yōu)選地，步驟2）所述梯度洗脫條件為：

15、

16、優(yōu)選地，步驟2）所述檢測波長條件為：

17、

18、本發(fā)明的另一方面是提供益氣養(yǎng)血顆粒的指紋圖譜，對10批制備的益氣養(yǎng)血顆粒供試品溶液進(jìn)行分析比較，以hplc分離檢測，使用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版》軟件分析，得到由樣品共有特征峰構(gòu)成的益氣養(yǎng)血顆粒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

19、通過對10批次益氣養(yǎng)血顆粒的指紋圖譜進(jìn)行匹配，得到32個共有特征峰，以19號峰（特女貞苷）作為參照峰，確定了6、8、11、13、16、17、18、19、20、22、23、25、27、29、32號峰，共15個益氣養(yǎng)血顆粒的主要特征峰，其相對保留時間分別為0.20、0.25、0.37、0.46、0.62、0.95、1.00、1.10、1.37、1.52、1.63、1.74、1.81、1.85、2.07。

20、經(jīng)對照品保留時間定位及色譜峰分析，指認(rèn)出13號峰為莫諾苷、16號峰為馬錢苷、17號峰為阿魏酸、18號峰為毛蕊異黃酮苷、20號峰為黨參炔苷、23號峰為丹酚酸b、29號峰為淫羊藿苷、32號峰為寶藿苷ⅰ。

21、其中，13號峰、16號峰主要為山茱萸中的成分；17號峰為當(dāng)歸中的成分；18號峰為黃芪中的成分；19號峰為女貞子中的成分；20號峰為黨參中的成分；23號峰為丹參中的成分；29號峰、32號峰為淫羊藿中成分。

22、本發(fā)明的第三方面，提供所述指紋圖譜在益氣養(yǎng)血顆粒質(zhì)量評價中的應(yīng)用。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案取得了以下有益技術(shù)效果：

24、1.?本發(fā)明首次提供了一種益氣養(yǎng)血顆粒hplc指紋圖譜的建立方法，根據(jù)益氣養(yǎng)血顆粒處方成分構(gòu)成特點(diǎn)，優(yōu)選最佳流動相組成及其梯度洗脫程序、流速、檢測波長，所得指紋圖譜分離度高、峰形好，各特征峰均實(shí)現(xiàn)了基線分離，能更全面、準(zhǔn)確地評價益氣養(yǎng)血顆粒的質(zhì)量。

25、2.?本發(fā)明檢測方法以特女貞苷為參比峰，確定32個共有峰為構(gòu)成益氣養(yǎng)血顆粒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的主要特征峰，指紋圖譜的組成更加豐富、全面；從共有峰中鑒定出莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、女貞苷、黨參炔苷、丹酚酸b、淫羊藿苷、寶藿苷ⅰ?9種化學(xué)成分，并對其進(jìn)行成分歸屬，進(jìn)一步闡明了益氣養(yǎng)血顆粒的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

26、3.?本發(fā)明指紋圖譜在益氣養(yǎng)血顆粒質(zhì)量評價中的應(yīng)用，通過對比所得標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中共有峰的有無，可對益氣養(yǎng)血顆粒的質(zhì)量進(jìn)行較為全面的評價，更有效的保證成品的質(zhì)量，可克服現(xiàn)有技術(shù)檢測指標(biāo)單一，不能反映益氣養(yǎng)血顆粒內(nèi)在質(zhì)量不足的問題。