本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，涉及一種有機污染物的定量分析方法，具體地說，是一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，通過計算其比例并折算成為三乙膦酸鋁含量的定量方法。

背景技術(shù)：

三乙膦酸鋁(fosetyl-aluminium)是一種有機磷類高效、廣譜、內(nèi)吸性低毒殺菌劑。它在植物體內(nèi)可以上、下雙向傳導，對單軸霉菌屬、霜霉屬、疫霉屬引起的病害有良好的防治效果，是目前國內(nèi)外防治水稻稻瘟病、果樹、蔬菜霜霉病、疫病應用較多的藥劑。

三乙膦酸鋁由乙基磷酸離子和鋁離子以化學鍵的形式構(gòu)成，其在基質(zhì)中通常解離后以化學離子乙基磷酸和亞磷酸離子的形式存在。傳統(tǒng)的分析方法以絡(luò)合滴定測定三乙膦酸鋁含量[化工技術(shù)與開發(fā),2007,36(1):39-41,35]，但是該方法操作復雜，在做痕量分析時，誤差較大。近年來，隨著色譜技術(shù)的普及，各類基于色譜分離后的分析技術(shù)也被應用于三乙膦酸鋁的測定當中。常規(guī)方法使用三甲基硅重氮甲烷在恒溫下進行衍生化[農(nóng)藥,2009,48(10):747-748,759]，或?qū)⑷异⑺徜X在密閉的反應瓶中完全堿解后生成乙醇[色譜,1993,11(5):285-287]，通過氣相色譜法測定衍生化或堿解后的產(chǎn)物對三乙膦酸鋁進行定量，但是這些方法前處理較復雜，實驗條件較難掌控?？紤]到三乙膦酸鋁以離子的形式存在，有文獻報道使用離子色譜分析樣品離子的含量[Microchemical Journal,1995,52(1):68-76]，并使用乙基膦酸離子的含量進行定量，但是該方法容易受到復雜基質(zhì)的干擾，影響測定結(jié)果。此外，液相色譜技術(shù)也被應用于三乙膦酸鋁的定量分析當中，有文獻報道使用離子對反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定三乙膦酸鋁的含量[色譜,2009,27(6):849-851]，但是該方法的檢出限較高，不能滿足三乙膦酸鋁殘留分析的需求。

我國的食品安全國家標準《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2014)中規(guī)定三乙膦酸鋁的殘留定義為乙基磷酸和亞磷酸及其鹽之和，以乙基磷酸表示。現(xiàn)有的文獻中僅測定乙基磷酸的含量[Journal of AOAC International,2003,86(4):832-838]，不能滿足國家標準中關(guān)于三乙膦酸鋁殘留定義的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測三乙膦酸鋁的方法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，同時通過計算其比例并折算成為三乙膦酸鋁含量，用于三乙膦酸鋁殘留量的準確、快速分析。

本發(fā)明所采用的技術(shù)原理：

低毒殺菌劑--三乙膦酸鋁在溶液中以乙基磷酸和亞磷酸兩種形式存在，對兩種酸進行離子化裂解，然后利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乙基磷酸和亞磷酸兩種離子的含量。根據(jù)不同溶液中兩種離子的存在比例基本為40：60的規(guī)律，將測定的離子含量經(jīng)計算、折算即可得到待測物中三乙膦酸鋁的含量。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：

一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測三乙膦酸鋁的方法，其步驟如下：

1、準確稱取樣品后加入乙腈進行預處理，然后以乙腈為標準按質(zhì)量體積比為1：10～15(g/mL)的比例加入氯化鈉，劇烈震蕩1～3min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心4～6min，取上層乙腈溶液；在乙腈溶液中按體積質(zhì)量比為1：0.02～0.025(mL/g)的比例分別加入無水硫酸鎂和PSA吸附劑，劇烈震蕩1～3min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5～7min，取上清液作為提取液，待測。所述樣品是果蔬樣品、土壤樣品或水樣品。所述預處理過程是：在果蔬樣品中按質(zhì)量體積比為1：2～3(g/mL)的比例加入乙腈，然后高速勻漿2～5min；在土壤樣品中按質(zhì)量體積比為1：2～3(g/mL)的比例加入乙腈，然后振蕩13～18min；在水樣品中按體積比為1：2～3(mL/mL)的比例加入乙腈，然后振蕩13～18min。

2、使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的含量，其中乙基磷酸的母離子和定量離子對分別為109和81/63，亞磷酸的母離子和定量離子對分別為81和79/63。

3、色譜工作條件：UPLC色譜柱為ACQUITYBEH HILIC(1.7μm，2.1mm×50mm)，柱溫：35℃，流速：0.25mL/min，進樣量：2μL；流動相：A相為乙腈，B相為0.05％甲酸水(10/90，v/v)，其梯度洗脫條件為：0～0.5min，流動相A保持10％；0.5～3.0min，流動相A從10％變?yōu)?0％；3.0～3.5min，流動相A從90％變?yōu)?0％；3.5～5.0min，流動相A保持10％；5.0min停止。

4、質(zhì)譜工作條件：掃描方式：電噴霧負離子(ESI-)掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；霧化氣：379.225kPa；噴霧電壓：4500kV。

5、根據(jù)提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例為40：60，利用如下公式計算提取液中三乙膦酸鋁含量：

三乙膦酸鋁含量＝乙基磷酸離子含量×0.4+亞磷酸含量離子×0.6。

本發(fā)明測定的對象為不同樣品中三乙膦酸鋁的含量，具體的樣品可為蘋果、香蕉、黃瓜、甘藍等不同果蔬及水、土壤等。

本發(fā)明根據(jù)不同溶液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例基本為40：60的規(guī)律，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，經(jīng)計算、折算得到待測物中三乙膦酸鋁的含量，在10-500μg/L濃度范圍內(nèi)，乙基磷酸和亞磷酸離子的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，所得結(jié)果更能體現(xiàn)三乙膦酸鋁的含量，且誤差在合理范圍內(nèi)，符合食品安全國家標準《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的規(guī)定，而且測定三乙膦酸鋁的定量限為0.52μg/kg，適用于三乙膦酸鋁殘留量的準確、快速分析。

附圖說明

圖1是在不同溶液中乙基磷酸和亞磷酸離子的比例。

圖2是乙基磷酸和亞磷酸離子的裂解途徑。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明建立一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，通過計算其比例并折算成為三乙膦酸鋁含量。三乙膦酸鋁在溶液中以乙基磷酸和亞磷酸兩種形式存在，兩種酸在溶液中的存在比例對三乙膦酸鋁的定量存在影響。

實施例一

研究不同溶液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例，分別配制0.5μg/mL的三乙膦酸鋁溶液，其中一組為乙腈與水的比例分別為4:1、2:1、1:1、1:2和1:4，另一組為甲醇與水的比例分別為4:1、2:1、1:1、1:2和1:4。使用乙基磷酸和亞磷酸兩種酸的標準溶液對三乙膦酸鋁溶液中的兩種酸進行定量，并計算其與酸總量的比例。實驗結(jié)果見圖1，可以看出，乙基磷酸和亞磷酸兩種離子的比例均約為40％和60％。

實施例二

三乙膦酸鋁在溶液中以乙基磷酸和亞磷酸兩種形式存在，兩種酸在離子化的裂解規(guī)律是其準確定量的關(guān)鍵。本發(fā)明首先選擇負離子模式進行激發(fā)，使用直接進樣的方式優(yōu)化質(zhì)譜分析乙基磷酸和亞磷酸的條件。乙基磷酸和亞磷酸分子在質(zhì)譜中的裂解碎片如圖2所示，在一級質(zhì)譜中，乙基磷酸和亞磷酸分別產(chǎn)生穩(wěn)定的[M－H]－離子，其作為母離子的m/z分別為109和81。在確定其母離子后，在SIM模式下，對化合物的碎裂電壓(DP)進行優(yōu)化，乙基磷酸和亞磷酸的最優(yōu)DP均為-81V。母離子進入二級質(zhì)譜，發(fā)生斷裂或重排等反應產(chǎn)生不同的離子碎片，其中，乙基磷酸的子離子分別為亞磷酸(定量離子，m/z＝81)和偏亞磷酸(定性離子，m/z＝63)，亞磷酸的子離子分別為偏磷酸(定量離子，m/z＝79)和偏亞磷酸(定性離子，m/z＝63)。

實施例三

對質(zhì)譜分析，基質(zhì)中化合物對目標化合物的離子化存在一定的干擾，為了提高樣品中三乙膦酸鋁的定量準確度，實驗以甘藍為例，研究了甘藍基質(zhì)對目標物定量的基質(zhì)效應。以甘藍空白樣品乙腈提取液作為空白基質(zhì)溶液，以純乙腈溶液作為純?nèi)軇┤芤?，分別配制0.1μg/mL的三乙膦酸鋁溶液，上機測定兩種溶液的響應值，并采用相對響應值法(基質(zhì)效應＝空白基質(zhì)標準響應值/純?nèi)軇藴薯憫怠?00％)計算甘藍對三乙膦酸鋁的基質(zhì)效應。用上述兩種不同溶液測定乙基磷酸和亞磷酸的峰面積，結(jié)果見表1，甘藍基質(zhì)對乙基磷酸和亞磷酸的基質(zhì)效應分別為80％和103％，說明基質(zhì)效應對樣品定量存在一定影響。因此，為了降低樣品基質(zhì)效應對目標物離子化帶來的干擾，在樣品分析時需要使用對應基質(zhì)提取液配制標準品。

表1不同樣品中三乙膦酸鋁的添加回收率

實施例四

準確稱取樣品(其中蘋果、香蕉、黃瓜、甘藍、土壤樣品取10g，水樣取10mL)，分別添加0.01、0.10和0.50mg/kg的三乙膦酸鋁標準溶液，每個試樣加入20mL乙腈。果蔬樣品高速勻漿2min，土壤和水樣振蕩15min。分別加入1.5g氯化鈉，劇烈震蕩1min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，分取5mL上層乙腈溶液，加入100mg無水硫酸鎂和100mg PSA吸附劑，劇烈震蕩1min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液2mL作為提取液。

使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的含量，其中乙基磷酸的母離子和定量離子對分別為109和81/63，亞磷酸的母離子和定量離子對分別為81和79/63。

根據(jù)提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例為40：60，利用如下公式計算提取液中三乙膦酸鋁含量：

三乙膦酸鋁含量＝乙基磷酸離子含量×0.4+亞磷酸含量離子×0.6。用常規(guī)分析

方法測定回收率，結(jié)果見表2。

表2不同樣品中三乙膦酸鋁的添加回收率

以上所述僅是本發(fā)明的一般實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。