本發(fā)明涉及中藥活性成分分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是涉及一種西紅花色香味多組分定量結(jié)合指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

西紅花(Crocus sativus L.)又稱(chēng)藏紅花，以雌蕊上部三根紅色柱頭入藥，具有獨(dú)特的顏色、香氣和苦味，價(jià)格昂貴，為名貴中藥，也是世界上最名貴香料，目前從西紅花中分離得到的化合物已達(dá)到50余種，主要可分為二萜類(lèi)(以西紅花苷類(lèi)化合物為代表，為西紅花紅色的主要成分)、單萜類(lèi)(以苦藏花素和藏花醛為代表，分別是西紅花的苦味和香氣成分)、黃酮類(lèi)(以山奈酚為苷元)，其中西紅花苷中的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦藏花素含量較高，三者之和可占干重的40％以上，其它化合物的質(zhì)量比例都較小。作為食品添加劑的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 3632-2(2010版)，用分光光度法分別于λmax440nm、λmax 330nm和λmax 257nm測(cè)定西紅花水提取液中色、香、味的代表成分西紅花苷、藏花醛和苦藏花素的色價(jià)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制與分級(jí)。規(guī)定西紅花苷色價(jià)大于190，苦藏花素色價(jià)大于70，藏花醛色價(jià)介于20-50之間為一級(jí)品。但該方法專(zhuān)屬性不強(qiáng)，不能精確表示色、香、味三類(lèi)組分的含量，如西紅花苷類(lèi)，在257nm和330nm處也有吸收，存在干擾。

2015年版《中國(guó)藥典》用HPLC法測(cè)定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量，規(guī)定兩者總含量大于10％為合格品，該標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)西紅花苷中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ進(jìn)行含量控制，對(duì)其他西紅花苷、苦藏花素、藏花醛等則沒(méi)有規(guī)定?？嗖鼗ㄋ睾筒鼗ㄈ┚哂休^強(qiáng)的藥理活性，為西紅花的藥效成分，并且苦藏花素在西紅花中含量均較高，苦藏花素納入西紅花質(zhì)量控制指標(biāo)能更有效地控制和評(píng)價(jià)西紅花藥材的質(zhì)量。

定量指紋圖譜技術(shù)是以指紋圖譜與多成分定量相結(jié)合的綜合評(píng)價(jià)方法，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，且能夠同時(shí)進(jìn)行多種藥效成分的定量分析，進(jìn)而可以對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，體現(xiàn)出中藥的整體觀(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，不同產(chǎn)地，不同質(zhì)量等級(jí)的西紅花所含化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量有較大的差異，使用定量指紋圖譜技術(shù)更能全面反映西紅花藥材質(zhì)量，為臨床安全、合理用藥提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種測(cè)定西紅花提取液中色、香、味的代表成分西紅花苷、藏花醛和苦藏花素等多組份含量；對(duì)其他復(fù)雜成分利用指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種西紅花色香味多組分定量結(jié)合指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，包括步驟：

a.確定高效液相色譜條件；

b.確定質(zhì)譜條件；

c.制備供試品溶液；

d.制備色味混合對(duì)照品和藏花醛對(duì)照品溶液；

e.取對(duì)照品和西紅花樣品溶液進(jìn)樣分析，得對(duì)照品和西紅花樣品高效液相色譜圖和質(zhì)譜總離子流色譜圖，首先基于液相色譜的在線(xiàn)紫外圖譜判斷化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，再利用波峰在正負(fù)離子模式下離子裂解規(guī)律推斷化合物的結(jié)構(gòu)；

f.光譜和質(zhì)譜分析西紅花中的色譜峰特征；

g.建立西紅花定量指紋圖譜方法：

精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液按指紋圖譜的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版計(jì)算其相似度；

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，在步驟b中的色譜條件下分別在0、2、4、8、12、20、24h測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)定樣品穩(wěn)定性；

重復(fù)性試驗(yàn)：取西紅花樣品6份，精密稱(chēng)定，按照步驟c中的方法制備供試品溶液，按照步驟a中的液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性；

h.西紅花樣品波長(zhǎng)切換HPLC指紋圖譜的建立和定量：取干品西紅花，按步驟供試品溶液制備方法和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，得到樣品的高效液相色譜圖，將西紅花樣品的高效液相色譜圖譜信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)軟件進(jìn)行處理，設(shè)定第一個(gè)樣品為參照?qǐng)D譜，選取時(shí)間窗寬度為0.1min，對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法為中位數(shù)，選擇穩(wěn)定性和重復(fù)性在0.999以上、吸收較強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有特征峰，進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，11個(gè)共有色譜峰為：苦藏花素、槐糖苷、trans-5-tG、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、trans-2-G、藏花醛、西紅花苷-Ⅰ的順式異構(gòu)體、西紅花苷-Ⅱ的順式異構(gòu)體以及trans-1-g；然后進(jìn)行各樣品的相似度評(píng)價(jià)，以供試品溶液指紋圖譜中西紅花苷-Ⅰ的保留時(shí)間及峰面積來(lái)計(jì)算其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

優(yōu)選地：所述步驟a中，高效液相色譜條件：Ultimate XB C18色譜柱；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.4％甲酸-甲醇，梯度洗脫，0-60min，甲醇濃度：20％-100％；DAD波長(zhǎng)范圍200～600nm，檢測(cè)時(shí)間在25min內(nèi)測(cè)定波長(zhǎng)為260nm，25-29min之間測(cè)定波長(zhǎng)為440nm，29-36min之間測(cè)定波長(zhǎng)為260nm，36-40.5min之間測(cè)定波長(zhǎng)為440nm，40.5-42.5min之間測(cè)定波長(zhǎng)為310nm，42.5-60min之間測(cè)定波長(zhǎng)為440nm；流速：0.8ml·min-1；進(jìn)樣量：10μl。

優(yōu)選地：所述步驟b中，所述質(zhì)譜條件進(jìn)一步為，離子源：大氣壓電噴霧離子源ESI；檢測(cè)模式：正負(fù)離子；全掃描質(zhì)核比：50-1200m/z；干燥氣溫度：350℃，干燥氣流量：12.0L·min-1，霧化氣壓力：35.0psi；毛細(xì)管電壓：4.5kV；碰撞電壓1.0V；進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相流速分流至0.4ml·min^-1。

優(yōu)選地，所述步驟c，進(jìn)一步為，稱(chēng)取西紅花樣品粉末10mg，精密稱(chēng)定，置25ml棕色量瓶中，加甲醇20ml，冰浴超聲處理30min，放置室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。

優(yōu)選地，其特征在于，所述步驟d，進(jìn)一步為，

1)制備色味混合對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?、以及苦藏花素置于棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得濃度?9.6μg·mL-1、29.6μg·mL-1和40.8μg·mL-1的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦藏花素混合對(duì)照品溶液，搖勻，備用；

2)制備藏花醛對(duì)照品溶液：精密吸取藏花醛對(duì)照品51.5mg，置25mL 棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為2.06mg·mL-1對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液。從中精密吸取0.5mL，置25mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度為41.2μg·mL-1對(duì)照品溶液。

優(yōu)選地，其特征在于，所述步驟e中，進(jìn)一步為，采用波長(zhǎng)切換方法在440nm、250nm和330nm下測(cè)定西紅花中的西紅花苷、苦藏花素和藏花醛化合物，得對(duì)照品和西紅花樣品高效液相色譜圖和質(zhì)譜總離子流色譜圖。

西紅花的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 3632-2，用分光光度法測(cè)定西紅花的色價(jià)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制與分級(jí)，該方法專(zhuān)屬性不強(qiáng)，不能精確表示色、香、味三類(lèi)組分的含量?！吨袊?guó)藥典》用HPLC法測(cè)定，但該標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)西紅花苷中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ進(jìn)行含量控制，對(duì)其他藥效成分如苦藏花素、藏花醛等則沒(méi)有規(guī)定。本發(fā)明首先采用HPLC-DAD-ESI-MSn技術(shù)對(duì)西紅花中主要化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒別，在基于西紅花中“色香味”多藥效組分和質(zhì)譜鑒定的基礎(chǔ)上，利用波長(zhǎng)切換HPLC-DAD技術(shù)通過(guò)色-香-味多組分定量結(jié)合指紋圖譜，構(gòu)建了西紅花的多組分質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，可對(duì)西紅花進(jìn)行較全面的質(zhì)量分析，可提高西紅花臨床應(yīng)用的安全性和有效性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的西紅花色香味多組分定量結(jié)合指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，達(dá)到了如下效果：

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 3632-2，用分光光度法測(cè)定西紅花水提取液中色、香、味的代表成分西紅花苷、藏花醛和苦藏花素的色價(jià)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制與分級(jí)。但該方法專(zhuān)屬性不強(qiáng)，不能精確表示色、香、味三類(lèi)組分的含量?！吨袊?guó)藥典》用HPLC法測(cè)定，但該標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)西紅花苷中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ進(jìn)行含量控制，對(duì)其他藥效成分如苦藏花素、藏花醛等則沒(méi)有規(guī)定，因此現(xiàn)行國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)與中國(guó)藥典對(duì)西紅花質(zhì)量評(píng)價(jià)尚存在較大的缺陷。

本發(fā)明首先采用HPLC-DAD-ESI-MSn技術(shù)對(duì)西紅花中主要化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒別，在基于西紅花中“色香味”多藥效組分和質(zhì)譜鑒定的基礎(chǔ)上，利用波長(zhǎng)切換HPLC-DAD技術(shù)通過(guò)色-香-味多組分定量結(jié)合指紋圖譜，構(gòu)建了西紅花的多組分質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，可對(duì)西紅花的14種成分進(jìn)行定性與定量分析，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，比現(xiàn)有方法更全面評(píng)價(jià)西紅花質(zhì)量，可提高西紅花臨床應(yīng)用的安全性和有效性。

本發(fā)明采用HPLC-DAD-ESI-MSn技術(shù)對(duì)西紅花中主要化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒別，在基于西紅花中“色香味”多藥效組分和質(zhì)譜鑒定的基礎(chǔ)上，利用波長(zhǎng)切換HPLC-DAD技術(shù)通過(guò)色-香-味多組分定量結(jié)合指紋圖譜，構(gòu)建了西紅花的多組分質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，可對(duì)西紅花進(jìn)行較全面的質(zhì)量分析，可提高西紅花臨床應(yīng)用的安全性和有效性。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為實(shí)施例1中對(duì)照品和樣品波長(zhǎng)切換液相色譜圖；

圖2a－圖2b為西紅花總離子流圖，圖2a為正離子模式，圖2b為負(fù)離子模式；

圖3為實(shí)施例1中的精密度試驗(yàn)色譜圖；

圖4為實(shí)施例1中的穩(wěn)定性試驗(yàn)色譜圖；

圖5為不同提取溶劑液相色譜HPLC圖；

圖6為超聲提取不同時(shí)間HPLC圖；

圖7為對(duì)照?qǐng)D譜；

圖8a－圖8c為28批西紅花樣品的共有模式圖，其中s1－s28分別代表樣品1－樣品28；

圖9a－圖9c為西紅花對(duì)照品和樣品波長(zhǎng)切換HPLC圖。

具體實(shí)施方式

如在說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來(lái)指稱(chēng)特定組件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，硬件制造商可能會(huì)用不同名詞來(lái)稱(chēng)呼同一個(gè)組件。本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求并不以名稱(chēng)的差異來(lái)作為區(qū)分組件的方式，而是以組件在功能上的差異來(lái)作為區(qū)分的準(zhǔn)則。如在通篇說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開(kāi)放式用語(yǔ)，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問(wèn)題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說(shuō)明書(shū)后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說(shuō)明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例提供了一種西紅花色香味多組分定量結(jié)合指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，具體步驟如下：

A.高效液相色譜條件：Ultimate XB C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.4％甲酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0-60min(B：20％-100％)；DAD波長(zhǎng)范圍200～600nm，0-25min(260nm)，25-29min(440nm)，29-36min(260nm)，36-40.5min(440nm)，40.5-42.5min(310nm)，42.5-60min(440nm)；流速：0.8ml·min-1；進(jìn)樣量：10μL。

B.質(zhì)譜條件：離子源：大氣壓電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)模式：正負(fù)離子；全掃描質(zhì)核比(m/z)：50-1200；干燥氣溫度：350℃，干燥氣流量：12.0L·min^-1，霧化氣壓力：35.0psi；毛細(xì)管電壓：4.5kV；碰撞電壓1.0V；進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相流速分流至0.4ml·min-1。

C.供試品溶液制備

稱(chēng)取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱(chēng)定，置25ml棕色量瓶中，加甲醇20mL，冰浴超聲處理30min，放置室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

D.對(duì)照品溶液制備

1)色-味混合對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品2.98mg，西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?.48mg，苦藏花素2.02mg置50ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得濃度為59.6μg·ml^-1、29.6μg·ml^-1和40.8μg·ml-1的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦藏花素混合對(duì)照品溶液，搖勻，備用。

2)藏花醛對(duì)照品溶液制備：精密吸取藏花醛對(duì)照品51.5mg，置25ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為2.06mg·ml-1對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液。從中精密吸取0.5ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度為41.2μg·ml^-1對(duì)照品溶液。

E.液相色譜圖和總離子流圖的建立

通過(guò)對(duì)流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)考察，建立了較佳的液相色譜分析條件，基本實(shí)現(xiàn)了西紅花中主要化合物的基線(xiàn)分離。由于西紅花中的西紅花苷、苦藏花素和藏花醛三類(lèi)主要化合物在440nm、250nm和330nm下有特征性吸收，但吸收強(qiáng)度相差很大，所以本發(fā)明采用了波長(zhǎng)切換技術(shù)。按上述實(shí)驗(yàn)條件，取對(duì)照品和西紅花樣品溶液進(jìn)樣分析，得對(duì)照品和西紅花樣品高效液相色譜圖(圖1)和質(zhì)譜總離子流色譜圖(圖2a和圖2b)。

從HPLC圖和總離子流圖可看出，液相上的色譜峰基本均有質(zhì)譜響應(yīng)，正離子模式比負(fù)離子模式色譜峰多，并且響應(yīng)峰的強(qiáng)度大，但有的色譜峰在負(fù)離子下有響應(yīng)的，正離子無(wú)響應(yīng)。所以本發(fā)明首先基于HPLC的在線(xiàn)紫外圖譜，判斷化合物的可能結(jié)構(gòu)類(lèi)型，再進(jìn)一步利用各峰在正負(fù)離子模式下離子裂解規(guī)律推斷化合物的結(jié)構(gòu)。

F.西紅花中14個(gè)色譜峰光譜和質(zhì)譜特征分析

由于流動(dòng)相中存在鈉離子和甲酸根離子，通過(guò)正負(fù)離子模式下的總離子流圖可發(fā)現(xiàn)，西紅花中多種西紅花苷類(lèi)成分、苦藏花素和黃酮類(lèi)成分在正離子模式下主要產(chǎn)生[M+Na]+峰，在負(fù)離子模式下主要產(chǎn)生[M-H]-和[M+HCOO]-峰。為了更好地歸納分析西紅花化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間、在線(xiàn)紫外圖譜和化合物的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)質(zhì)譜裂解特征，并通過(guò)對(duì)比同類(lèi)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律和質(zhì)譜碎片特征，參考現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行推測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 14個(gè)峰UV和質(zhì)譜裂解規(guī)律

G.西紅花定量指紋圖譜方法建立

精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液按指紋圖譜的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”計(jì)算其相似度在0.999以上，表明儀器的精密度良好。見(jiàn)圖3。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，在前述色譜條件下分別在0、2、4、8、12、20、24h測(cè)定，記錄色譜圖，考察樣品穩(wěn)定性。經(jīng)相似度評(píng)價(jià)，均在0.999以上，表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)圖4。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S15樣品6份，精密稱(chēng)定，按照“供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在前述色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。經(jīng)相似度評(píng)價(jià)，均在0.999以上，表明方法重復(fù)性良好。

H.西紅花樣品波長(zhǎng)切換HPLC指紋圖譜的建立和定量

取干品西紅花，按以上供試品溶液制備方法和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，得到樣品的高效液相色譜圖。將樣品HPLC圖譜信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)》軟件進(jìn)行處理，設(shè)定第一個(gè)樣品為參照?qǐng)D譜，選取“時(shí)間窗寬度”為0.1min，對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法為“中位數(shù)”，選擇穩(wěn)定性和重復(fù)性好，吸收較強(qiáng)，特征明顯的11個(gè)色譜峰為共有特征峰，進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成“對(duì)照?qǐng)D譜”，11個(gè)共有色譜峰為：

1：苦藏花素，2：槐糖苷，3：trans-5-tG，4：未鑒定出，5：西紅花苷-Ⅰ，6：西紅花苷-Ⅱ，7：trans-2-G，8：藏花醛，9：西紅花苷-Ⅰ的順式異構(gòu)體(cis-4-GG)，10：西紅花苷-Ⅱ的順式異構(gòu)體(cis-4-Gg)，11：trans-1-g；

然后進(jìn)行各樣品的相似度評(píng)價(jià)，以供試品溶液指紋圖譜中西紅花苷-Ⅰ的保留時(shí)間及峰面積來(lái)計(jì)算其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

實(shí)例2：西紅花供試液制備方法的優(yōu)化

1.儀器、試劑和材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Agilent 6330離子阱質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)(美國(guó)Agilent公司)；AG135電子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

西紅花苷-Ⅰ(批號(hào)：111588-201202)，西紅花苷-Ⅱ(批號(hào)：111589-201304)，供HPLC含量測(cè)定用，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；藏花醛(批號(hào)：101198434，Sigma公司，含量>88％)；苦藏花素(自制，含量>90％)；甲醇和甲酸均為色譜純(美國(guó)Tedia公司)，其余化學(xué)試劑均為分析純。

西紅花藥材由湖州西紅花種植基地提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定為Crocus sativus L.的干燥花柱。研磨后，過(guò)60目篩，避光干燥保存。

2.方法

2.1供試品溶液制備

2.1.1提取溶劑選擇

鮮品西紅花柱頭主要含有多種西紅花苷類(lèi)成分(以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ?yàn)橹?，占總西紅花苷90％以上)和苦藏花素，兩類(lèi)成分可占干重的40％以上，極性較大，溶于水、甲醇和乙醇。加熱干燥過(guò)程中苦藏花素會(huì)部分水解，生成苷元，進(jìn)一步脫水生成藏花醛，含量較低。藏花醛為西紅花的香氣成分，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚等。本研究以西紅花中的色-香-味三類(lèi)成分為指標(biāo)，對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察。見(jiàn)圖5。

結(jié)果表明，水對(duì)西紅花苷-Ⅰ的提取率最低，并且無(wú)藏花醛色譜峰。50％乙醇、70％甲醇和甲醇對(duì)苦藏花素和西紅花苷-Ⅰ、Ⅱ提取率基本相似，但甲醇對(duì)藏花醛的提取率較高，并且樣品在甲醇中的穩(wěn)定性最好，故本研究以甲醇為提取溶劑。

2.1.2提取時(shí)間

現(xiàn)有技術(shù)中的文獻(xiàn)報(bào)道，西紅花中的西紅花苷類(lèi)成分穩(wěn)定性較差，2015年版《中國(guó)藥典》西紅花項(xiàng)下，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量測(cè)定，用超聲法提取，并要求在冰浴上操作，本研究為進(jìn)一步考察超聲法對(duì)西紅花苷類(lèi)成分，苦藏花素和藏花醛的提取率的影響，對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。見(jiàn)圖6。

結(jié)果表明，不同超聲提取時(shí)間，成分種類(lèi)基本一致，但提取率有差異。隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦藏花素提取率增加，達(dá)到30min時(shí)提取率最高，之后變化不大。故超聲提取30min。

2.1.3供試品溶液制備

在優(yōu)化了提取溶劑和超聲時(shí)間的基礎(chǔ)上，最終確定了供試品溶液的制備方法，具體如下：

稱(chēng)取西紅花樣品粉末約10mg，精密稱(chēng)定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇20mL，冰浴超聲處理30min，放置室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

實(shí)例3：28批國(guó)產(chǎn)西紅花波長(zhǎng)切換HPLC指紋圖譜的建立和分析

取不同來(lái)源的28批干品西紅花，按以上供試品溶液制備方法和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，得到28批樣品的高效液相色譜圖。將28批樣品HPLC圖譜信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)》軟件進(jìn)行處理，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，選取“時(shí)間窗寬度”為0.1min，對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法為“中位數(shù)”，選擇穩(wěn)定性和重復(fù)性好，吸收較強(qiáng)，特征明顯的11個(gè)色譜峰為共有特征峰，進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成“對(duì)照?qǐng)D譜”，見(jiàn)圖7。11個(gè)共有色譜峰為：

1：苦藏花素，2：槐糖苷，3：trans-5-tG，4：未鑒定出，5：西紅花苷-Ⅰ，6：西紅花苷-Ⅱ，7：trans-2-G，8：藏花醛，9：西紅花苷-Ⅰ的順式異構(gòu)體(cis-4-GG)，10：西紅花苷-Ⅱ的順式異構(gòu)體(cis-4-Gg)，11：trans-1-g

匹配后的28批樣品譜圖見(jiàn)圖8a－8c。然后進(jìn)行各樣品的相似度評(píng)價(jià)，見(jiàn)表3。除樣品S5、S7和S20三個(gè)樣品外，其余25批樣品相似度均在0.98以上，尤其S7相似度最低。從圖8a－8c和表3相似度可知，S5、S7和S20的9號(hào)、10號(hào)和11號(hào)色譜峰響應(yīng)值較高，從表5相對(duì)峰面積可看出，這三批樣品的9號(hào)色譜峰相對(duì)峰面積在1以上，而其他樣品的該色譜峰的相對(duì)峰面積在1以下，可能是引起3批樣品相似度低的主要原因。根據(jù)第一章質(zhì)譜鑒定結(jié)果，表明該成分為西紅花苷-Ⅰ的順式異構(gòu)體(cis-4-GG)，后期研究表明，該成分在鮮品中含量較低，其干品中的含量與干燥溫度等有關(guān)。并且S7的相似度最低(0.934)，從表5可看出，該樣品1號(hào)色譜峰(苦藏花素)相對(duì)峰面積為1，其他樣品該色譜峰的相對(duì)峰面積均大于1，8號(hào)色譜峰(藏花醛)和9號(hào)色譜峰相對(duì)峰面積均較其他樣品高，可能是該樣品相似度低的主要原因。

通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照和結(jié)合第一章質(zhì)譜鑒定結(jié)果，確定5號(hào)峰為西紅花苷-Ⅰ。以5號(hào)峰作為參照峰S，以供試品溶液指紋圖譜中西紅花苷-Ⅰ的保留時(shí)間及峰面積來(lái)計(jì)算其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。

表3 28批國(guó)產(chǎn)西紅花指紋圖譜相似度

表4 28批西紅花共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間

表5 28批西紅花共有色譜峰相對(duì)峰面積

從相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)可看出，不同來(lái)源國(guó)產(chǎn)西紅花藥材指紋圖譜中共有峰相對(duì)保留時(shí)間基本一致(RSD<0.5％)；但由于來(lái)源不同，可能采后加工方法等不同，各批藥材共有峰的相對(duì)峰面積有較大差異(即各峰代表成分含量的相對(duì)比值則有較大差別)，差異最大的是峰8(藏花醛) 和峰10(cis-4-Gg)；其次是峰9(cis-4-GG)和峰11(trans-1-g)。由此可知，建立的色譜方法可以使不同來(lái)源西紅花藥材具有基本一致的色譜行為(相對(duì)保留時(shí)間)，但藥材之間西紅花苷類(lèi)和苦藏花素等成分的含量受多種因素的影響，具有較大差異(相對(duì)峰面積)。提示不同產(chǎn)地西紅花存在差異，必須嚴(yán)格控制西紅花質(zhì)量，確保其臨床療效。

實(shí)例4：色香味HPLC法同時(shí)定量分析國(guó)內(nèi)外西紅花樣品

1.1儀器、試劑和材料

儀器、試劑、材料同實(shí)例2

1.2方法

1.2.1供試品溶液制備

同實(shí)例2

1.2.2對(duì)照品溶液制備

同實(shí)例2

1.2.2.1色-味混合對(duì)照品溶液制備

同實(shí)例2

1.2.2.2藏花醛對(duì)照品溶液制備

同實(shí)例2

1.3色譜條件

Ultimate XB C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.4％甲酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0-60min(B：20％-100％)；DAD波長(zhǎng)范圍200～600nm，0-25min(260nm)，25-29min(440nm)，29-36min(260nm)，36-40.5min(440nm)，40.5-42.5min(310nm)，42.5-51min(440nm)；流速：0.8mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。波長(zhǎng)切換代表色譜圖見(jiàn)圖9a－9c。

1.4方法：方法于現(xiàn)有技術(shù)中的定量指紋圖譜的方法相同

1.4.1線(xiàn)性關(guān)系考察

1.4.1.1色味線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦藏花素混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X,μg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得回歸方程和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表8，三個(gè)成分在各自濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.4.1.2香(藏花醛)線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取藏花醛對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X,μg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得回歸方程和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表8，藏花醛在一定濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表8西紅花中4個(gè)成分的線(xiàn)性關(guān)系

1.5樣品含量測(cè)定

按前述供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定28批國(guó)產(chǎn)西紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、苦藏花素和藏花醛的含量，結(jié)果見(jiàn)表10。

2.UV法測(cè)定總西紅花苷含量方法的建立

西紅花中的西紅花苷類(lèi)成分有其特殊性，苷元均為西紅花酸，紫外吸收光譜特征基本相同，最大吸收波長(zhǎng)均為440nm?！吨袊?guó)藥典》方法測(cè)定的28批西紅花樣品的結(jié)果表明，西紅花苷-Ⅰ含量均比西紅花苷-Ⅱ含量高，基本是西紅花苷-Ⅱ的2倍以上；并且西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌返膬r(jià)格是西紅花苷-Ⅰ的2倍以上，故本文以西紅花苷-Ⅰ為對(duì)照，有其合理性。

2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品6.20mg，置25mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。從中精密移取2.0mL置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為49.6μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液制備

精密吸取“色-香-味HPLC法同時(shí)定量分析方法”供試品溶液5mL，置50mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

對(duì)照品溶液及供試品溶液分別于200-700nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)兩者均在440nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm。與西紅花苷類(lèi)成分的最大吸收波長(zhǎng)相一致。

2.4線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，以甲醇作空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，于440nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得回歸方程為Y＝0.1130X+0.0012(r＝0.9999)。結(jié)果表明，西紅花苷-Ⅰ在0.496-4.96μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.5精密度和穩(wěn)定性考察

精密吸取0.6mL對(duì)照品溶液，按2.4項(xiàng)下方法操作，重復(fù)測(cè)定6次，吸光度的RSD為0.032％，說(shuō)明儀器精密度良好。

取S1樣品液，按2.4項(xiàng)下方法操作，分別在0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min測(cè)定吸光度，RSD為0.38％，說(shuō)明樣品在1h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復(fù)性考察

取S1樣品，平行6份，精密稱(chēng)定，分別按2.2和2.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別計(jì)算總西紅花苷含量，計(jì)算平均含量為27.60％，RSD為1.98％。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率考察

取已知總西紅花苷含量(27.60％，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果)的S1樣品，平行6份，每份5.0mg，精密稱(chēng)定，各加入西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品溶液5mL，分別按2.2和2.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別計(jì)算總西紅花苷含量，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表9。表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表9西紅花中總西紅花苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8UV法樣品中總西紅花苷含量測(cè)定

取28批西紅花藥材，分別按“2.2”中的方法制備供試品溶液，按“2.4”中的方法操作，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別計(jì)算總西紅花苷含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 HPLC法和UV法測(cè)定西紅花中色-香-味的含量

從表10可看出，國(guó)產(chǎn)不同來(lái)源的28批西紅花色香味三類(lèi)成分的含量有較大差異。苦藏花素含量最高的(S27)是含量最低的(S7)的近3倍。紫外測(cè)定的總西紅花苷含量最高的(S27)是含量最低的(S26)的1.5倍。而藏花醛含量最高的(S7)是含量最低的(S19)的25倍。藏花醛在新鮮西紅花柱頭中基本不存在，是新鮮西紅花在加熱干燥過(guò)程中由苦藏花素水解后生成苷元，在高溫作用下進(jìn)一步脫水生成。即藏花醛實(shí)際上不是新鮮西紅花的原始積累產(chǎn)物，是一個(gè)采后“干燥脅迫”誘導(dǎo)產(chǎn)物。后期研究表明，該成分的含量與干燥溫度有關(guān)，S7苦藏花素含量最低，可能是干燥時(shí)溫度高，苦藏花素?zé)峤到猓D(zhuǎn)化成藏花醛。

3.基于TOPSIS分析樣品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣

西紅花藥材質(zhì)量與色-香-味多組分的含量有關(guān)，是一個(gè)典型的多指標(biāo)決策問(wèn)題。由于各指標(biāo)成分含量不同，且在數(shù)量級(jí)上也存在較大差異，簡(jiǎn)單加和顯然不能客觀(guān)全面反映樣品質(zhì)量，因此需要選擇合理的綜合評(píng)價(jià)方法，以兼顧各種成分在質(zhì)量評(píng)價(jià)中所占權(quán)重均等。TOPSIS分析法是一種有效的多指標(biāo)較理想的綜合評(píng)價(jià)方法，其中心思想是首先確定各項(xiàng)指標(biāo)的正理想值A(chǔ)+和負(fù)理想值A(chǔ)-，即各指標(biāo)的最優(yōu)解和最劣解。然后求出各樣品與正、負(fù)理想值之間的加權(quán)歐式距離D+和D-，從而求出各樣品與理想方案的貼近程度Ci，作為評(píng)價(jià)方法優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。即靠即近正理想和遠(yuǎn)離負(fù)理想的程度，來(lái)對(duì)方案進(jìn)行排序，相對(duì)貼近度越大，說(shuō)明越靠近正理想而遠(yuǎn)離負(fù)理想，方案越優(yōu)；反之，方案越劣。

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以28批樣品中的7個(gè)指標(biāo)成分組成28×11矩陣，基于TOPSIS通過(guò)Matlab軟件編程實(shí)現(xiàn)其貼近度大小，利用貼近度(Ci)對(duì)28批樣品進(jìn)行綜合排序，結(jié)果見(jiàn)表11。首先分別找出7個(gè)指標(biāo)的正負(fù)理想如下：

正理想(A+)：19.84，18.98，8.84，27.60，28.90，4.06，0.999

負(fù)理想(A-)：6.65，11.59，4.25，16.89，19.05，0.16，0.934

表11 TOPSIS綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

TOPSIS評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，前5批由優(yōu)至劣順次排序的樣品為：S27(浙江杭州)，S1(浙江建德三都西紅花合作社)，S15(浙江余杭)，S22(江西南昌)，S2(浙江建德三都西紅花合作社)。28批樣品排序后5批的樣品為：S11(浙江湖州安吉)，S25(西藏)，S26(浙江湖州)，S9(浙江金華浦江縣)，S5(浙江建德楊樹(shù)橋鎮(zhèn))。本研究基于“色-香-味多指標(biāo)定量結(jié)合指紋圖譜相似度，應(yīng)用TOPSIS法評(píng)價(jià)”，可全面表征不同來(lái)源西紅花藥材的化學(xué)成分的差別，比各項(xiàng)指標(biāo)簡(jiǎn)單加和更能客觀(guān)全面反映西紅花藥材質(zhì)量，可以為西紅花藥材產(chǎn)地選擇，臨床應(yīng)用及質(zhì)量快速評(píng)價(jià)提供參考。在此基礎(chǔ)上，若能將藥效、毒性與物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合起來(lái)，深入開(kāi)展譜效學(xué)研究，則更有利于闡明中藥作用機(jī)制，完善西紅花的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為用藥安全提供進(jìn)一步保障。

從TOPSIS評(píng)價(jià)結(jié)果可看出，S5的貼近度(Ci)最小，質(zhì)量最差。從表10數(shù)據(jù)可看出，該樣品的苦藏花素，西紅花苷類(lèi)成分的含量均比S7高，指紋圖譜的相似度也比S7高，但藏花醛含量比S7低，如果從色香味結(jié)果的表面去分析，S7質(zhì)量相對(duì)最差。

2015年版《中國(guó)藥典》用HPLC法測(cè)定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量，規(guī)定兩者總含量大于10％為合格品，28批樣品均為合格品，如按照中國(guó)藥典評(píng)價(jià)，質(zhì)量最差的是S26。因此，僅由西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總量評(píng)價(jià)西紅花有一定局限性。

因此，本研究基于“色-香-味多指標(biāo)定量結(jié)合指紋圖譜相似度，應(yīng)用TOPSIS法評(píng)價(jià)”，所得出的樣品質(zhì)量?jī)?yōu)劣順序較簡(jiǎn)單加和法將更能綜合反映各樣品的綜合質(zhì)量。

實(shí)例5：色-香-味多指標(biāo)定量結(jié)合指紋圖譜對(duì)進(jìn)口西紅花的質(zhì)量評(píng)價(jià)

國(guó)產(chǎn)西紅花色香味多組分指紋圖譜在進(jìn)口西紅花鑒別中的應(yīng)用，結(jié)果已表明，12批進(jìn)口西紅花的相似度均在0.9以下，均比國(guó)產(chǎn)西紅花的相似度低，為了進(jìn)一步考察本發(fā)明建立的“色-香-味多指標(biāo)定量結(jié)合指紋圖譜相似度綜合評(píng)價(jià)進(jìn)口西紅花的質(zhì)量”，將在前面研究基礎(chǔ)上，利用TOPSIS法評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口西紅花的質(zhì)量差異。色香味含量和相似度結(jié)果見(jiàn)表12。

表12 HPLC法和UV法測(cè)定進(jìn)口西紅花中色-香-味的含量

比較表10和表11，可看出進(jìn)口西紅花其西紅花苷類(lèi)和苦藏花素的含量均比國(guó)產(chǎn)西紅花低，但藏花醛的含量進(jìn)口西紅花整體比國(guó)產(chǎn)西紅花高。進(jìn)一步利用TOPSIS綜合評(píng)價(jià)，通過(guò)比較貼近度(Ci)，從排序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，排在后十二位的除國(guó)產(chǎn)S5號(hào)外，都是進(jìn)口西紅花，說(shuō)明進(jìn)口西紅花距離正理想遠(yuǎn)而距離負(fù)理想近；而且，負(fù)理想中的數(shù)據(jù)基本來(lái)自于進(jìn)口西紅花組，正理想中的數(shù)據(jù)基本來(lái)自國(guó)產(chǎn)西紅花組。

因此，TOPSIS綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)西紅花質(zhì)量整體優(yōu)于進(jìn)口西紅花?？赡芘c國(guó)內(nèi)外西紅花栽培方式和采后加工等因素有關(guān)。種球大小與西紅花苷和苦藏花素含量有關(guān)，種球越大，積累西紅花苷和苦藏花素含量越高。進(jìn)口西紅花采用連續(xù)栽培方式，種球較小，成分含量較低。而國(guó)產(chǎn)西紅花采用二段式栽培方式，室內(nèi)開(kāi)花，開(kāi)花后，種球再種于室外，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，培育種球，種球較大，成分含量較高。

上述說(shuō)明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。