專利名稱：一種抗Ⅲ型前膠原氨基末端肽單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及一種抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體及其用途，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
III型前膠原氨基末端肽(簡(jiǎn)寫為PIIINP)是III型前膠原分泌到細(xì)胞外后被蛋白酶 切下的N端肽，前膠原轉(zhuǎn)化為膠原時(shí)，被分解下來的前膠原肽可在體內(nèi)存在一定時(shí)間， 血清中的III型前膠原氨基末端肽可作為判定肝纖維化的指標(biāo)。III型前膠原氨基末端肽與 肝纖維化形成的活動(dòng)程度密切相關(guān)。其升高程度與炎癥、壞死和肝纖維化程度有關(guān)。與 體內(nèi)沉積的膠原無關(guān)。而是反映肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程。III型前膠原氨基末端 肽持續(xù)升高的慢性活動(dòng)性肝炎，提示病情可能會(huì)惡化并向肝硬變形成發(fā)展，而III型前膠 原氨基末端肽降至正?？深A(yù)示病情緩解，因此，測(cè)定血清中III型前膠原氨基末端肽含量 在輔助診斷肝纖維化中具有重要價(jià)值。肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，由于細(xì)胞外基質(zhì)的形成和降解的 平衡失調(diào)，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。臨床上對(duì)肝纖維化的診斷方 法主要有肝組織病理學(xué)診斷、影像學(xué)檢查及血清學(xué)診斷。血清學(xué)診斷是研究最廣泛的肝 纖維化診斷方法，其最常用的肝纖維化指標(biāo)有透明質(zhì)酸、層粘蛋白、III型前膠原氨基末 端肽、IV型膠原等。這些血清學(xué)指標(biāo)的高低與肝纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因而可用于 診斷肝纖維化。血清化驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是取材方便、容易復(fù)查，如果能定期檢查(如每半年或 一年)則可以根據(jù)這些指標(biāo)是升高或降低的總趨勢(shì)來了解肝臟纖維化的發(fā)展變化情況， 也能大致了解抗纖維化的治療的臨床效果。除了對(duì)肝纖維化進(jìn)行輔助診斷，有文獻(xiàn)報(bào)道將血漿III型前膠原氨基末端肽 (PIIINP)作為心肌纖維化的指標(biāo)，用來評(píng)估在急性心肌梗死(AMI)、高血壓時(shí)心肌纖維 化的情況。聞心培等報(bào)道的肺部疾病PIIINP值均增高，反映肺內(nèi)膠原合成代謝處于活躍 階段，大量膠原(包括I、II、III型膠原)沉積臟器而致臟器纖維化?；陔p抗體夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫法(ELISA)是檢測(cè)抗原最常用的方法， 在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg, AFP、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶 結(jié)合物而建立此法。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗， 分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可 以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測(cè)。在一步法測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢 抗原的含量很高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合 物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過 剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測(cè)讀， 所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect)，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá) 高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。但用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高親和力的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體及其 在雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，以克服此類試劑容易產(chǎn)生的 鉤狀效應(yīng)，提高對(duì)III型前膠原氨基末端肽的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明所提供的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于其輕鏈的 氨基酸殘基序列如SEQ ID Nal所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ IDNo.2所示。所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CCTCC NO.C201058的雜交瘤細(xì)胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生。所述的雜交瘤細(xì)胞株是以III型前膠原氨基末端肽為免疫源，小鼠為免疫對(duì)象， 通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液，并使之與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得。所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，屬于IgG亞型。所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的腹水效價(jià)為1 106。本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體可以與III型前膠原氨基末端肽高 度特異性結(jié)合，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的的方法，制備成III型前膠原氨基末端肽 的各種檢測(cè)試劑盒。尤其是，應(yīng)用本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體和雙抗 體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的III型前膠原氨基末端肽的檢測(cè)試劑盒，不僅可以定量檢測(cè) 人血清中III型前膠原氨基末端肽的含量，使檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0.974ng/ml，檢測(cè)準(zhǔn)確性 在0.9至1.1之間，劑量-反應(yīng)曲線的線性在0.998以上，批內(nèi)不精密度小于10%，批間 不精密度小于15%，而且與對(duì)比檢測(cè)試劑配對(duì)T檢驗(yàn)P值>0.05，與對(duì)比檢測(cè)試劑相關(guān) 性 r(Pearson Correlation) > 0.90、P (Sig. (2-tailed)) < 0.01，具有較高的診斷一致性，可 用于臨床上對(duì)肝纖維化的輔助診斷。


圖1為5’ RACE產(chǎn)物電泳圖，其中1號(hào)為輕鏈結(jié)果，2號(hào)為重鏈結(jié)果，M為 DNA Marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要 求書所限定的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中 所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的制備一、動(dòng)物免疫取雌性6 8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用濃度為5mg/ml的III型前膠原氨基末端肽純品，經(jīng)腹腔和四肢腋下注射，總量lml。每隔2周以同樣的方法加強(qiáng)免疫 1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，從經(jīng)三次免疫后小鼠眼球采血，離心分離血 清，用ELISA法選出效價(jià)高的小鼠準(zhǔn)備融合。二、雜交瘤細(xì)胞系的制備 完成免疫過程的小鼠準(zhǔn)備取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，在融合前一 天制備飼養(yǎng)細(xì)胞。融合時(shí)無菌下取小鼠脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞以10 1混合，以50% PEG介導(dǎo)融合，離心后重懸于HAT選擇性培養(yǎng)基中，接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔微孔板 中，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培養(yǎng)液半量換液， 兩周后換用HT培養(yǎng)液。觀察雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，等克隆長(zhǎng)至孔底面積的1/3 1/2，取培養(yǎng)上清 液，用ELISA法進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對(duì)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞 進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細(xì)胞抗體陽性率為100%，選出高分泌特異性細(xì)胞株(即 ELISA效價(jià)在1 IO6以上的陽性克隆)，此時(shí)可將陽性克隆細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。將雜 交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個(gè)月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，定期收集上清，用篩選抗體的 方法測(cè)定上清中的抗體，直至細(xì)胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。三、單克隆抗體的制備和純化選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，1 2周后收集生長(zhǎng)狀態(tài) 良好的單克隆雜交瘤細(xì)胞株4E5F4A1該細(xì)胞株已在設(shè)置于中國武漢大學(xué)內(nèi)的中國典 型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期為2010年7月1日，保藏號(hào)為CCTCC NO.C201058，每只腹腔注射lml。接種2周左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫 臼法處死后打開腹腔，取出腹水。離心后吸取上清，用硫酸銨沉淀后，再用DEAE離子 交換柱純化，用PH5.6，20mM的醋酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液。再用親和層析純化法 (蛋白A-Sepharose4B柱)繼續(xù)純化，上樣條件樣品和蛋白A_Sepharose4B柱用PH8.2， 1.0M的Tris緩沖液平衡后再上樣。洗脫條件用PH3.0，50mM的甘氨酸緩沖液洗脫， 收集洗脫液，制得特異的單克隆抗體。四、單克隆抗體的腹水效價(jià)及鑒定取小鼠腹水抗體，用篩選抗體的方法測(cè)定效價(jià)為1 106，亞型鑒定為IgG型。實(shí)施例2 單克隆抗體的特異性鑒定材料透明質(zhì)酸、層粘蛋白、I型膠原、III型膠原、IV型膠原。方法采用ELISA法檢測(cè)，以III型前膠原氨基末端肽為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示透明質(zhì)酸、層粘蛋白、I型膠原、III型膠原、IV型膠原均為陰性。說明本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體對(duì)III型前膠原氨基末端肽 具有高度特異性。雖然鄧修惠等通過常規(guī)單抗雜交瘤細(xì)胞技術(shù)也獲得了抗III型前膠原氨 基末端肽單克隆抗體，但所述抗體與I型膠原、III型膠原有交叉反應(yīng)，特異性不高。實(shí)施例3 單克隆抗體的可變區(qū)序列的克隆與測(cè)序采用5，RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends，快速擴(kuò)增 cDNA 末端)技術(shù)，
從分泌抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4E5F4A11中克隆功能性抗 體的可變區(qū)序列。其步驟可簡(jiǎn)述為由一個(gè)反義的基因特異性引物(GSPl)來合成cDNA 第一鏈，cDNA第一鏈純化后，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidytransferase, TdT)在cDNA的3’末端加上一個(gè)合成的同聚核苷酸錨定序列。利用第 二個(gè)巢式基因特異性引物(GSP2)和一個(gè)與同聚核苷酸尾巴可以退火的錨定引物來擴(kuò)增 cDNA。具體實(shí)驗(yàn)過程如下材料-由雜交瘤細(xì)胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體-大腸桿菌ToplO菌株-pGEM-T Easy 克隆載體引物設(shè)計(jì) 根據(jù)免疫球蛋白基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩套分別對(duì)應(yīng)Ig和Kappa恒定區(qū)的基因特異 性引物GSP1、GSP2,引物序列如下pRace-H-GSPl GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTGpRace-H-GSP2 GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCCpRace-K-GSPl ACTTGACATTGATGTCTTTGpRace-K-GSP2 CACGACTGAGGCACCTCCAGATG克隆過程A、第一鏈合成以總RNA為模板，以GSPl為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈。 具體步驟如下1)在一個(gè)0.5ml的微量離心管中加入以下組分GSPl2.5ml總 RNA1 5 μ g補(bǔ)充經(jīng)DEPC處理的水至總體積為15.5 μ 1，混勻。2)70°C變性lOmin，冰浴Imin，短暫離心后依次加入以下組分IO^PCRbuffer 2.5 μ 125mM MgCl2 2.5 μ 1IOmM dNTP mix 1.0 μ 10.IM DTT 2.5 μ 1。3)混勻，短暫離心后置42°C lmin。4)在反應(yīng)體系中加入1 μ 1 SuperScriptTMII RT (Invitrogen公司)，輕輕混勻后置 42°C 反應(yīng) 50min。5)反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后置70°C、15min以終止反應(yīng)。6)離心10 20秒后置于37°C。7)加入1 μ 1 RNase mix,輕輕混勻后置于37°C反應(yīng)30min。8)將反應(yīng)管取出置冰上備用。B、DNA 純化使用QIAGEN公司QIAquick PCR純化試劑盒。1)加5倍體積于反轉(zhuǎn)錄體系的PB緩沖液于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中，混勻。2)將QIAquick離心柱置于2ml收集管中，把樣品加入離心柱，13000rpm離心60秒。3)棄去液體，將離心柱放回原來的收集管中，加入0.75ml PE緩沖液于QIAquick離心柱，13000rpm離心60秒。4)棄去液體，將QIAquick離心柱放回原來的收集管，13000rpm離心60秒。5)將QIAquick離心柱置于一干凈的1.5ml離心管，在QIAquick膜中央加入30 μ 1 EB緩沖液，靜置Imin后，13000rpm離心60秒。C、cDNA 加尾1)在一個(gè)0.5ml的微量離心管中一次加入以下組分DEPC 處理的水 6.5 μ 15*tailing buffer 5.0 μ 12mM dCTP2.5 μ 1純化的cDNA 10.0 μ 1，混勻。2)將反應(yīng)管置94°C維持3min后，冰浴lmin，短暫離心后置冰上。3)加入 1 μ 1 TdT,混勻后置 37°C反應(yīng) lOmin。4)將反應(yīng)管置于65°C中作用30min終止反應(yīng)，離心后置于冰上備用。D、PCR在一個(gè)0.2ml的PCR薄壁管中加入以下組分滅菌水31.5 μ 110*PCR Buffer 5.0 μ 125mM MgCl2 3.0 μ 1
IOmM dNTP mix 1.0 μ 1GSP2 (lOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1ΑΑΡ (IOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1dC-tailed cDNA 5.0 μ 1Tag 酶0.5 μ 1合計(jì)50.0 μ 1混勻后置PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。E、PCR產(chǎn)物電泳純化PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示其中1號(hào)為輕鏈結(jié) 果，在450bp處有一特異性條帶；2號(hào)為重鏈結(jié)果，在470bp處有一特異性條帶。F、使用Promega公司的pGEM-T Easy試劑盒，將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-TEasy 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO (Invitrogen公司)具體過程為1)輕鏈和重鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收450bp和470bp的條 帶，最終定容于20 μ 1體積的滅菌水中；2)在一個(gè)0.5ml的微量離心管中，加入以下組分2*連接緩沖液5 μ 1pGEM-T Easy50ng(l μ 1)PCR 產(chǎn)物25ng (3 μ 1)Τ4 連接酶1 μ 1 混勻后室溫連接2小時(shí)或者4°C連接16小時(shí)以上。3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37 °C培養(yǎng)12小時(shí)左右。G、測(cè)定所克隆的PCR產(chǎn)物的堿基序列各選取至少5個(gè)質(zhì)粒測(cè)定其所含的PCR產(chǎn)物的堿基序列。H、根據(jù)堿基序列與氨基酸編碼序列的相應(yīng)關(guān)系，分析PCR產(chǎn)物的閱讀框架， 確定相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列，其輕鏈和重鏈的序列分別如SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 所示。根據(jù)免疫球蛋白基因的特點(diǎn)驗(yàn)證其為抗體序列。實(shí)施例4 本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應(yīng)用采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的基于雙抗體夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫技術(shù)，制作III型前膠原氨基末端肽檢測(cè)試劑盒，在體外定量檢測(cè)人血清中的III型前膠原氨基末端 肽的含量，用于臨床上輔助診斷肝纖維化疾病。一、檢測(cè)原理采用基于雙抗體夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫方法(ELISA)。微孔內(nèi)包被抗III型 前膠原氨基末端肽的單克隆抗體，將標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)標(biāo)本加入微孔中進(jìn)行溫育，在溫育過 程中，標(biāo)本中的III型前膠原氨基末端肽與單克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物。洗滌除掉未結(jié)合 的物質(zhì)，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體進(jìn)行溫育， 則酶標(biāo)記單克隆抗體與微孔內(nèi)的復(fù)合物形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合 的物質(zhì)，加底物顯色。顏色的強(qiáng)弱反映了結(jié)合的酶標(biāo)抗體的量。它與標(biāo)本中的III型前 膠原氨基末端肽的濃度成正比。終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀在450nm讀吸光度，其值與標(biāo)本 中的III型前膠原氨基末端肽濃度成正比。根據(jù)所測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 待測(cè)標(biāo)本中的III型前膠原氨基末端肽濃度值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得。二、檢測(cè)方法A、試劑配制1)配制洗滌液將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按1 20比例稀釋，得到洗 滌液備用。2)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品原液(200ng/ml)倍比稀釋，得到濃度 為 100ng/ml，50ng/ml, 25ng/ml, 12.5ng/ml, 6.2ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品。B、操作步驟1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量，取出相應(yīng)數(shù)量的板條，其余板條放回密封袋中，于2 8°C下 密封保存。2)在相應(yīng)的微孔中分別加入已倍比稀釋的III型前膠原氨基末端肽標(biāo)準(zhǔn)品或被測(cè) 血清標(biāo)本100 μ 1 ；另取1孔加入100 μ 1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(則該孔III型前膠原氨基末端肽濃 度為Ong/ml)。37°C溫箱中溫育反應(yīng)90分鐘。3)棄去微孔中液體，用洗滌液洗滌4 5次，洗滌完畢后，將微孔板在吸水紙上 拍干。4)每孔加入酶標(biāo)抗體100 μ 1，37°C溫箱中反應(yīng)45分鐘。5)棄去微孔中液體，用洗滌液洗滌4 5次，洗滌完畢后，將微孔板在吸水紙上 拍干。6)每孔加底物液A，底物液B各1滴，避光37。C反應(yīng)10分鐘。7)每孔加終止液一滴終止反應(yīng)，在終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)于酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔0.D值。C、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以450nm處的O.D. 值為縱座標(biāo)，III型前膠原氨基末端肽的濃度為橫座標(biāo)，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及相應(yīng)的實(shí)際O.D.值制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。D、結(jié)果計(jì)算根據(jù)被測(cè)血清標(biāo)本在450nm處的實(shí)際O.D.值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其相對(duì)應(yīng)的III 型前膠原氨基末端肽濃度(ng/ml)。三、結(jié)果判定正常參考值范圍3 12ng/ml。選取123例正常個(gè)體作為參考人群進(jìn)行檢測(cè)，采用百分位數(shù)法確定參考值范 圍。以可信度95%為正常值范圍，計(jì)算單測(cè)上限P95。四、臨床應(yīng)用結(jié)果為評(píng)價(jià)III型前膠原氨基末端肽檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)在臨床上應(yīng)用于定量 測(cè)定人血清中III型前膠原氨基末端肽的含量的適用性與準(zhǔn)確性，在上海瑞金醫(yī)院，青海 省第四醫(yī)院檢驗(yàn)科兩個(gè)地點(diǎn)對(duì)此試劑盒進(jìn)行了臨床研究。從臨床中選出281例樣本作為 研究對(duì)象，入選對(duì)象以慢性肝炎，肝硬化，脂肪肝病人為主，也包括部分無癥狀的就診 患者。采用與德國Behringwercke AG公司的III型前膠原氨基末端肽定量檢測(cè)試劑盒(放 射免疫法)作為參比的方法。比較檢測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1所示。表1本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用結(jié)果
項(xiàng)目上海瑞金醫(yī)院試驗(yàn)結(jié)果青海省第四醫(yī)院試驗(yàn)結(jié)果
分析靈敏度1.254ng/ml0.974ng/ml
準(zhǔn)確性0.9至1.1之間0.9至1.1之間
劑量一反應(yīng)曲線的線性__0998__0999_
批內(nèi)不精密度__小于10%__小于10%
批間不精密度小于15%小于15%
與對(duì)比檢測(cè)試劑
0.059>0.05
配對(duì)T檢驗(yàn)P值
與對(duì)比檢測(cè)試劑r (PearsonCorrelation) =0.954>0.90
相關(guān)性P(Sig. (2-tailed))=0.000<0.01
1-1-1 V由表1結(jié)果可說明應(yīng)用本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體和基于雙抗體夾心法原理的 固相酶聯(lián)免疫技術(shù)制備的III型前膠原氨基末端肽檢測(cè)試劑盒，對(duì)III型前膠原氨基末端肽 檢測(cè)具有較好的靈敏度，較高的準(zhǔn)確性、批內(nèi)不精密度和批間不精密度，且劑量-反應(yīng) 曲線的線性也能較好的擬合。另外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果也表明該方法與現(xiàn)有產(chǎn)品具有較好的診斷一致性， 可適用于在臨床上對(duì)肝纖維化進(jìn)行輔助診斷。
權(quán)利要求
1.一種抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于其輕鏈的氨基酸殘基序 列如SEQ ID No.l所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO.C201058的雜交瘤細(xì) 胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的雜交瘤細(xì)胞株是以III型前膠原氨基末端肽為免疫源，小鼠為免疫對(duì)象，通過免疫注射 小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液，并使之與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體屬于IgG亞型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的腹水效價(jià)為1 106。
6.一種權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在 于用于III型前膠原氨基末端肽檢測(cè)試劑盒的制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在 于用于雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的III型前膠原氨基末端肽檢測(cè)試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在 于用于臨床上對(duì)肝纖維化疾病的輔助診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，所述抗體的輕鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.1所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ IDNo.2所示。所述的抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO.C201058的雜交瘤細(xì)胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生。本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體可應(yīng)用于III型前膠原氨基末端肽的各種檢測(cè)試劑盒的制備中。使用本發(fā)明的單克隆抗體和雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的III型前膠原氨基末端肽檢測(cè)試劑盒，不僅可以定量檢測(cè)人血清中III型前膠原氨基末端肽的含量，而且具有高靈敏度、準(zhǔn)確性和較高的診斷一致性，可用于臨床上對(duì)肝纖維化的輔助診斷。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102020715SQ20101051799
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者周季余, 黃桂民, 黃波 申請(qǐng)人:上海貝西生物科技有限公司