專利名稱：抗人Ⅲ型前膠原氨基末端肽的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及針對m型前膠原氨基末端肽的單克隆抗體。本發(fā)明 還涉及所述抗體在檢測樣品in型別'膠原氨基末端肽水平中的應(yīng)用，以及利用所述抗體檢測樣 品m型前膠原氨基末端肽水平的試劑盒及該抗體在肝纖維化疾病診斷中的可能應(yīng)用。
背景技術(shù)：
m型前膠原氨基末端肽是肝纖維化的重要血清學(xué)指標(biāo)。它是m型前膠原分泌到細胞外后 被蛋白酶切下的氨基端肽段。血清中的m型前膠原氨基末端肽與肝纖維化形成的活動程度密 切相關(guān)，其升高程度與炎癥、壞死和肝纖維化程度有關(guān)。與體內(nèi)沉積的膠原無關(guān)。而是反映 肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的動態(tài)過程。m型前膠原氨基末端肽持續(xù)升高的慢性活動性肝炎，提示 病情可能會惡化并向肝硬變形成發(fā)展，而in型前膠原氨基末端肽降至正?？深A(yù)示病情緩解， 說明該指標(biāo)不僅在肝纖維化早期診斷上有價值，在慢性肝病的預(yù)后判斷上也有意義。臨床上對m型前膠原氨基末端肽的檢測多采用免疫學(xué)方法，主要有放射免疫法和elisa 方法。目前國內(nèi)外關(guān)于ni型前膠原氨基末端肽的研究均是利用in型甜膠原氨基末端肽的多克 隆抗體進行，未見in型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的報道。多克隆抗體的特異性差，應(yīng)用 于放免檢測或elisa檢測時背景偏高，質(zhì)量不易控制，難以在臨床診斷中推廣。單克隆抗體在臨床檢測中的應(yīng)用廣泛，可以在免疫組化、elisa等多種方法中使用，具有特異性強、敏感性高的優(yōu)點。目前，臨床迫切需要高特異性的m型前膠原氨基末端肽單克隆抗體以及由此 衍生出的檢測試劑盒，以便對肝纖維化疾病進行早期診斷，指導(dǎo)臨床治療。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人通過親和純化的方法獲得純化的in型前膠原氨基末端肽，并通過雜交瘤技術(shù)獲 得in型前膠原氨基末端肽的單克隆抗體。本發(fā)明以純化m型前膠原為原料，通過蛋白酶切割，通過谷胱甘肽瓊脂糖柱親和層析獲 取其純化氨基端片段。參照Kohler和Milstein建立的B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)(KohlerG, MilsteinC ， Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity . Nature . 1975 Aug7 ; 256 (5517 ):495 — 7.)，本發(fā)明用純化的III型前膠原氨基末端肽免疫BALB / c小鼠。將免疫小 鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，制備雜交瘤細胞。用ELISA方法篩選陽性細胞克隆。本發(fā)明人經(jīng)過多次試驗，獲得了多株陽性細胞克隆。對這些陽性克隆所分泌的單克隆抗體進行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)一株雜交瘤細胞株。經(jīng)鑒定，所述單克隆抗體的亞類是IgG。本發(fā)明進一步涉及所述m型前膠原氨基末端肽單克隆抗體在檢測樣品ni型前膠原氨基末端肽水平中的應(yīng)用。所用檢測方法主要為免疫學(xué)方法中的ELISA、免疫熒光、放射免疫分析等。本發(fā)明提供一種檢測樣品中ffl型前膠原氨基末端肽水平的elisa試劑盒，包括用in型前 膠原氨基末端肽多克隆抗體包被的微孔板，ni型前膠原氨基末端肽標(biāo)準(zhǔn)抗原，辣根過氧化物 酶標(biāo)記的in型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，標(biāo)記酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液。 該試劑盒適用于檢測血液或組織液中的in型前膠原氨基末端肽水平。本發(fā)明還提供一種肝纖維化疾病的診斷方法，其特征為用本發(fā)明的單克隆抗體體外檢測 血清中in型前膠原氨基末端肽的表達水平。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，如上所述，應(yīng) 用本發(fā)明所述in型前膠原氨基末端肽單克隆抗體對取自肝纖維化患者的血清進行常規(guī)ELISA 實驗，檢測血清中ni型前膠原氨基末端肽的水平。如其水平顯著高于正常參考值，則提示被 檢者可能患有肝纖維化。本發(fā)明還提供一種肝纖維化疾病患者的病情監(jiān)測方法，包括用本發(fā)明的單克隆抗體在體 外檢測肝纖維化患者樣本中in型前膠原氨基末端肽水平的動態(tài)變化。在本發(fā)明的一個具體實 施例中，如上所述，應(yīng)用本發(fā)明所述m型前膠原氨基水端肽單克隆抗體對取自肝纖維化患者 的血清進行常規(guī)ELisA實驗，檢測血清中ni型前膠原氨基末端肽的水平。如果治療效果好， 則與治療前相比患者血清中的in型前膠原氨基末端肽水平降低；如果病情出現(xiàn)反復(fù)，則血清 中m型前膠原氨基末端肽的水平增高。
具體實施方式
本發(fā)明將結(jié)合具體實例作進一步詳述。本發(fā)明用純化的in型前膠原氨基末端肽作為免疫原，獲得了m型前膠原氨基末端肽單克 隆抗體。具體步驟如下(1) 制備免疫小鼠脾細胞用純化的ni型前膠原氨基術(shù)端肽與等量佐劑充分混勻免疫，分別注入BALB / c小鼠頸背部兩側(cè)、腹股溝部皮下；每只每次劑量為20—80 pg，間隔2—4周，同法重復(fù)注入至少1次；第一次免疫用弗氏完全佐劑、第二次改用弗氏不完全佐劑、第三次不用佐劑；最后一次免疫后兩周，測小鼠血清中III型前膠原氨基末端肽抗體滴度，將顯示有足夠高抗體滴度的小鼠作為免疫脾細胞的來源。(2) 制備骨髓瘤細胞選用SP2/0骨髓瘤細胞，在進行細胞融合前，將其在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3—4天。(3) 細胞融合將按步驟(1)中得到的免疫小鼠脾細胞沉淀與按步驟(2)中得到的骨髓瘤細胞沉淀分別用1640培養(yǎng)液懸浮，并將脾細胞與骨髓瘤細胞按數(shù)量比5: 10混合，然 后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比l: 2加入濃度為50 %的聚乙二醇， 再靜置1—2分鐘后離心去上清液，并緩慢加入沉淀物體積的25 —35倍的HAT培養(yǎng)液懸 浮融合細胞，最后補加HAT液至沉淀物體積的140—160倍，再將融合細胞按100ul/孔加入 至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100ulHAT液小鼠腹水細胞(約l一2X10SM/孔)作為飼養(yǎng)細 胞。將上述培養(yǎng)孔置于濃度為3—7 %的二氧化碳培養(yǎng)箱中，在溫度為35—38 °C條件下培 養(yǎng)10—14小時，從第3天開始，每隔2—3天用每孔半量HAT液換液一次。當(dāng)觀察培養(yǎng)孔中出現(xiàn)雜交細胞集落時，再在每孔加半量HA培養(yǎng)液，取培養(yǎng)上清液，用 ELISA方法篩選陽性細胞克隆。將上述抗人III型前膠原氨基末端肽抗體陽性、滴度高的雜交 瘤轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進行克隆。通過經(jīng)有限稀釋該雜交瘤使一孔中只含有一個單一雜 交瘤細胞的方法來進行克隆?？寺∵^程中采用1640培養(yǎng)液，并用ELISA檢測克隆細胞孔上 清培養(yǎng)液中抗體及滴度。對抗體陽性、滴度高的孔繼續(xù)進行克隆3—4次，直至再次克隆時， 所有克隆孔均呈抗體陽性，篩選具有一個穩(wěn)定抗體滴度的克隆作為產(chǎn)生抗人III型前膠原氨基 末端肽抗體的雜交瘤細胞系。(4) 制備單克隆抗體將上述步驟(3)中得的雜交瘤細胞，注入經(jīng)降植烷處理的雌性 小鼠(4至8周齡)腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成份，其上清液即含有抗人in型前膠原氨基末端肽單克隆抗體。如果需要進一步純化，可采用硫酸銨沉淀和親和層析方法純化。經(jīng)鑒定，所述單克隆抗體的亞類是IgG。本發(fā)明進一步涉及所述iii型前膠原氨基末端肽單克隆抗體在檢測樣品m型前膠原氨基末端肽水平中的應(yīng)用。所用檢測方法主要為免疫學(xué)方法中的ELISA、免疫熒光、放射免疫分析 等。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，使用ELISA方法檢測血清中III型前膠原氨基末端肽的水平。所用試劑盒包括用純化的ni型前膠原氨基末端肽多克隆抗體包被的微孔板，m型前膠 原氨基末端肽標(biāo)準(zhǔn)抗原，由辣根過氧化物酶標(biāo)記的所述ni型前膠原氨基末端肽單克隆抗體。標(biāo)記酶的相應(yīng)顯色底物TMB，以及適宜的緩沖液。在微孔板用于作標(biāo)準(zhǔn)抗原曲線的各孔中依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液，在樣品孔中 加入待測血清樣品，溫育一段時間以使in型前膠原氨基末端肽與m型前膠原氨基末端肽多克 隆抗體充分結(jié)合。洗滌微孔板，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的ni型前膠原氨基末端肽單克隆抗 體，以使ni型前膠原氨基末端肽單克隆抗體固定于微孔板上的in型前膠原氨基末端肽充分結(jié)合。洗滌微孔板，加入TMB顯色底物液，室溫避光顯色。用酶標(biāo)儀讀取每個反應(yīng)孔的OD450nm值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品中in型前膠原氨基末端肽的濃度。本發(fā)明還提供一種肝纖維化疾病的診斷方法，其特征為用本發(fā)明的單克隆抗體體外檢測血清中m型前膠原氨基末端肽的表達水平。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，如上所述，應(yīng)用本發(fā)明所述III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體對取自肝纖維化患者的血清進行常規(guī)ELISA 實驗，檢測血清中III型前膠原氨基末端肽的水平。如其水平顯著高于正常參考值，則提示被 檢者可能患有肝纖維化。本發(fā)明還提供一種肝纖維化疾病患者的病情監(jiān)測方法，包括用本發(fā)明的單克隆抗體在體外檢測肝纖維化患者樣本中in型前膠原氨基末端肽水平的動態(tài)變化。在本發(fā)明的一個具體實 施例中，如上所述，應(yīng)用本發(fā)明所述m型前膠原氨基末端肽單克隆抗體對取自肝纖維化患者 的血清進行常規(guī)EusA實驗，檢測血清中in型前膠原氨基末端肽的水平。如果治療效果好， 則與治療前相比患者血清中的ni型前膠原氨基末端肽水平降低；如果病情出現(xiàn)反復(fù)，則血清 中m型前膠原氨基末端肽的水平增高。
權(quán)利要求
1、一種人III型前膠原氨基末端肽的單克隆抗體。
2、 權(quán)利要求1中的單克隆抗體在檢測樣品中人III型前膠原氨基末端肽水平的應(yīng)用。
3、 一種以免疫學(xué)方法檢測樣品III型前膠原氨基末端肽水平的試劑盒，其含有權(quán)利要求l 中的單克隆抗體。
4、 一種檢測樣品中m型前膠原氨基末端肽水平的ELisA試劑盒，包括用in型前膠原氨 基末端肽多克隆抗體包被的微孔板，ni型前膠原氨基末端肽標(biāo)準(zhǔn)抗原，辣根過氧化物酶標(biāo)記 的權(quán)利要求i所述單克隆抗體，標(biāo)記酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液。
5、 一種肝纖維化疾病的診斷方法，其特征為用權(quán)利要求i的抗體體外檢測患者組織樣 本中ni型前膠原氨基末端肽水平。
全文摘要
本發(fā)明提供一種針對III型前膠原氨基末端肽的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了檢測樣品III型前膠原氨基末端肽水平的ELISA試劑盒。與已有的III型前膠原氨基末端肽多克隆抗體相比，本發(fā)明的單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的特點。應(yīng)用該抗體開發(fā)的ELISA試劑盒可對肝纖維化病人的III型前膠原氨基末端肽水平進行檢測，用于早期診斷肝纖維化，判斷慢性肝病預(yù)后，以指導(dǎo)臨床治療。還可對肝纖維化疾病患者進行病情監(jiān)測。
文檔編號G01N33/577GK101333253SQ20071004289
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者周季余 申請人:上海貝西生物科技有限公司