草莓根腐病害多種病原菌分子快速檢測方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于果樹病害防治及植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，涉及草莓根腐病害多種病原菌分 子快速檢測方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 草莓根腐病是由土傳病原真菌共同引起的一大類病害總稱。世界范圍內(nèi)草莓主 產(chǎn)區(qū)已報道的根腐病病原物達20余種，是一種較難防治的土傳病害。常見的病原菌有：弓丨 起草莓黑根腐病的主要有鐮刀菌（Fusarium spp.)、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum)、立枯絲核 菌（Rhizoctonia solani)、腐霉菌（Pythium sp.)、擬盤多毛抱菌（Pestalotiopsis sp.); 引起草莓紅中柱根腐病的病原菌為疫霉菌（Phytophthorafragariae C.J. Hickman)。草莓 根腐病典型癥狀是切開病根或剝下根外表皮可看到暗紅色病組織，與健康部位形成鮮明對 照；地下部發(fā)病迅速，地上部分突然凋萎，全株青枯死亡。根腐病發(fā)病率為20 %~30 %，個 別地區(qū)達到50~80%，發(fā)病植株死亡率100%。近年來草莓黑根腐及紅中柱根腐在草莓病 害中的危害最重、影響最大，嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和效益，成為草莓種植發(fā)展的瓶頸問題。
[0003] 引起草莓根腐病的病原真菌具有明顯的潛伏侵染的特征。在草莓上根腐病菌的潛 伏侵染是很普遍的現(xiàn)象，當(dāng)環(huán)境條件適合發(fā)病時，就會發(fā)生草莓根腐病。草莓生產(chǎn)中一般 使用無性種苗繁殖，各地區(qū)間種苗的流動性也很頻繁。如果移栽的種苗上有根腐病原菌的 潛伏侵染，往往會引起病原菌的跨地區(qū)長距離傳播，造成根腐病區(qū)域性暴發(fā)，給草莓生產(chǎn)帶 來巨大經(jīng)濟損失。因此，用無根腐病發(fā)生的育苗基地繁殖的無菌種苗可以從根源上避免草 莓根腐病的發(fā)生。但隨著種植面積擴大，加上病害傳播范圍越來越廣泛，這種方法難度很 大。因此建立有效的種苗檢測技術(shù)是非常重要的，可以有效避免草莓根腐病的傳播與發(fā)生。 但是由于帶菌種苗不顯癥，而且目前發(fā)展的一些檢驗方法因為繁瑣耗時不容易推廣實施， 還是給當(dāng)前根腐病菌檢驗帶來了極大難度。草莓根腐病的病因復(fù)雜，化學(xué)防治方法合理使 用前提就是要搞清楚本地區(qū)草莓根腐病的病原微生物種類，對癥下藥才能起到事半功倍效 果。同時，化學(xué)防治帶來的殘留問題和對生態(tài)環(huán)境的破壞已經(jīng)不容忽視。傳統(tǒng)的病原菌分 離培養(yǎng)鑒定的方法又依賴于專業(yè)人員豐富的經(jīng)驗和系統(tǒng)的病原菌分類的理論知識，這樣就 會貽誤最佳的防治時機。目前，防治草莓根腐病還沒有行之有效的方法。主要是采取以農(nóng) 業(yè)防治為主，化學(xué)防治為輔的綜合治理措施。因此，對草莓根腐病應(yīng)以預(yù)防為主，著重加強 對該病害的檢疫檢測。為防止草莓根腐病從疫區(qū)傳入非疫區(qū)，確保國內(nèi)草莓的安全生產(chǎn)，建 立一套穩(wěn)定、簡便、快速、靈敏的分子檢測方法對草莓種苗進行檢疫檢測是非常必要的。PCR 檢測方法具有靈敏度高、精度高、取樣量微小、檢測時間短等優(yōu)點。通過該技術(shù)對草莓種苗 等定性檢測，為確保我國草莓無病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)、安全生產(chǎn)，同時堵截國外危險性帶 病草莓種苗傳入我國具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的存在的缺陷，提供一種草莓根腐病害病原菌 分子快速檢測方法。該方法操作簡便易行，直接應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，用于帶菌植物組織的高靈 敏度快速檢測，確保為生產(chǎn)提供健康無菌種苗、對病原菌分子預(yù)警具有十分重要的意義。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述草莓根腐病病原菌分子快速檢測方法的應(yīng)用。
[0006] 其具體技術(shù)方案為：
[0007] 草莓根腐病害多種病原菌分子快速檢測方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟1.病原菌的分離
[0009] 采用組織分離法對草莓根部的病原菌進行分離，切取病健交界處的病組織4-5_ 的小塊，置于75%乙醇中浸泡5s，接著將病組織移入0. 1 %升汞溶液中浸泡3-5min，再將病 組織轉(zhuǎn)移到無菌水中漂洗3遍，最后將組織移到PDA培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放置25 °C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)3-5d，菌落直徑lcm即進行DNA提取實驗；
[0010] 步驟2.病原菌DNA少量提取
[0011] 1)用滅菌牙簽刮取PDA平板上的少量病原菌菌絲，裝入2. 0ml的離心管中；
[0012] 2)加入500 y 1 Lysis buffer，1顆破碎珠，多樣品組織研磨機研磨60-90s ;
[0013] 3)室溫靜置 lOmin;
[0014] 4) 13200rpm，室溫離心10min，取上清液400 y 1轉(zhuǎn)入新離心管中；
[0015] 5)加入800 y 1無水乙醇，顛倒混勻；-20°C靜置lOmin沉淀DNA;
[0016] 6) 13200rpm，4°C離心 5min ;
[0017] 7)沉淀用75%乙醇洗絳，空氣中干燥后用50 y 1 ddH20溶解，上清即為提取的DNA 溶液，用于下游PCR模板；
[0018] 步驟3.設(shè)計病原真菌通用引物
[0019]上游引物 ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；下游引物 ITS4: 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；
[0020] 步驟4. PCR擴增
[0021] PCR 反應(yīng)體系為 25yL，反應(yīng)液為：10Xbuffer2. 5yL，dNTPl yL，引物 ITS1 和 ITS4 各 1 y L，Taq 酶 0? 5 y L，DNA 模板 3 y L，ddH2016 y L，PCR 擴增程序：94°C預(yù)變性 5min; 94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin，進行35個循環(huán)；72°C總延伸lOmin;在1%的 瓊脂凝膠上檢測PCR結(jié)果，當(dāng)PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)大約500bp條帶，即樣本中含有草莓根腐病病原 菌，將隨機挑選樣品CY2、JN3、JM2、LW2PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司 測序；
[0022] 步驟5.序列分析
[0023] 測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫
[0024] http：// blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi ? PROGRAM = blastn&PAGE_TYPE =BlastSearch&LINK_L OC = blasthome序列比對，得到明確的草莓根腐病病原菌種類。
[0025] 本發(fā)明所述草莓根腐病害病原菌分子快速檢測方法，在草莓種苗檢疫、田間草莓 根腐病的早期診斷以及病菌的監(jiān)測和鑒定過程中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是：
[0027] 本發(fā)明根據(jù)引起草莓根腐病病原菌的基因組序列，設(shè)計通用特異性引物。通過該 技術(shù)對草莓種苗等定性檢測，從而實現(xiàn)我國草莓無病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)、安全生產(chǎn)，同時 堵截國外危險性帶病草莓傳入的目的。該方法操作簡單，耗時少，通量大。通過該方法對草