一株花生根際生防菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株花生根際生防菌及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開的花生根際生防菌為活性菌株LX12，通過16SrDNA鑒定菌株LX12為側(cè)孢短芽孢桿菌，該菌株是從花生根際土壤中篩選出對(duì)真菌有拮抗性的細(xì)菌，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC?7420。該菌株對(duì)病原菌有明顯的拮抗作用，對(duì)峙試驗(yàn)顯示，本發(fā)明菌劑對(duì)花生根腐病、白絹病、瘡痂病和葉斑病菌等花生病害有顯著的抑制作用，盆栽和田間試驗(yàn)顯示對(duì)花生根腐病、白絹病、瘡痂病和葉斑病菌均有明顯的防治效果。
【專利說明】一株花生根際生防菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株花生根際生防菌及其制備方法和應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在對(duì)生防細(xì)菌的研究應(yīng)用中，芽孢桿菌和假單胞菌是研究最為深入的兩種生防細(xì)菌。芽孢桿菌(Bacillaceae)是細(xì)菌的一科，能形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌或球菌。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。它們對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等處。芽孢是休眠體，絕大多數(shù)是一個(gè)菌體僅形成一個(gè)芽孢芽孢位于菌體內(nèi)，由核心、皮層、芽孢殼和外壁組成，為革蘭氏陽(yáng)性菌。核心是芽孢的原生質(zhì)體，內(nèi)含DNA、RNA、可能與DNA相聯(lián)系的特異芽孢蛋白質(zhì)以及合成蛋白質(zhì)和產(chǎn)生能量的系統(tǒng)。此外，還有大量的吡啶二羧酸鈣布滿整個(gè)芽孢。由于芽孢具有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu)，所以折光性強(qiáng)、對(duì)染料不易著色，芽孢對(duì)熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，這可能與芽孢獨(dú)具的高含量吡啶二羧酸有關(guān)。
[0003]芽孢桿菌作為微生物種群在自然界土壤中占有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，許多性狀優(yōu)良的天然分離菌株已成功地應(yīng)用于植物病害的生物防治。對(duì)于芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物的探究，發(fā)現(xiàn)其拮抗物質(zhì)主要包括主要為酶類的抗菌蛋白及次生代謝產(chǎn)生的抗菌素，另外還包含一部分揮發(fā)性的抗菌物質(zhì)。
[0004]芽孢具有耐熱抗逆性是芽孢桿菌這一種群與其他種群進(jìn)行區(qū)別的最明顯的特征。這有利于芽孢桿菌作為生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。
[0005]作為芽孢桿菌屬的 側(cè)孢短芽孢桿菌，其主要有以下特點(diǎn):
[0006]第一，能改善土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)團(tuán)粒結(jié)構(gòu)形成，改良土壤質(zhì)地，增大革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌比率。革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌的比率增加是土壤質(zhì)量提高的標(biāo)志。有效菌的大量繁殖產(chǎn)生粘性分泌物，增加土壤有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，改善土壤的通透性、保溫性、保肥性。
[0007]第二，能刺激作物根系發(fā)育、促進(jìn)作物生長(zhǎng)，改善作物品質(zhì)。在土壤中施入側(cè)孢短芽孢桿菌，通過其生命活動(dòng)分泌各種胞外酶如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、淀粉酶、碳解酶、半纖維素酶、脂肪酶等以及天然植物激素(如玉米素、生長(zhǎng)素、赤霉素和異戊烯基腺嘌呤等)，促進(jìn)作物對(duì)養(yǎng)分的吸收，把土壤中豐富的有機(jī)質(zhì)分解為植物可以利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，多種植物激素，刺激作物生長(zhǎng)和根系發(fā)育，從而增產(chǎn)增收。促進(jìn)葉片生長(zhǎng)，增大光合作用的面積和強(qiáng)度，從而增加光合產(chǎn)物合成(即碳合成)促進(jìn)根系生長(zhǎng)，擴(kuò)大根系吸收面積，增強(qiáng)根系活力，保證合成產(chǎn)物所需原料(N、P、K、Mg)。
[0008]第三，減輕病蟲害、降低農(nóng)藥殘留。當(dāng)大量的有益微生物被投放到土壤中，它們迅速增殖形成優(yōu)勢(shì)群體，并在植物根際占據(jù)一定的空間，消耗可被病原菌利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大大削弱了病原菌的生長(zhǎng)、繁殖，使病原菌失去競(jìng)爭(zhēng)力，這是有益菌對(duì)病原菌的“競(jìng)爭(zhēng)抑制作用”。側(cè)孢短芽孢桿菌在生命活動(dòng)過程中，分泌蝕幾丁質(zhì)酶、真菌，線蟲卵壁中含有相當(dāng)數(shù)量的幾丁質(zhì)，蝕幾丁質(zhì)酶分解了壁中的幾丁質(zhì)，使其原生質(zhì)體流出失活，從而起到殺死病蟲的作用。增強(qiáng)供應(yīng)的Ca、S1、K，使植物有關(guān)組織細(xì)胞壁增厚，纖維化、木質(zhì)化程度提高，并在表皮層外形成角質(zhì)雙硅層，形成一道阻止病菌侵襲的屏障。分泌的蝕幾丁質(zhì)酶能裂解線蟲卵殼和真菌細(xì)胞壁，長(zhǎng)期使用對(duì)線蟲、真菌病害防治效果與化學(xué)農(nóng)藥基本相當(dāng)，防病、抗病、抗重茬效果顯著。
[0009]第四，增強(qiáng)光合作用，提高化肥利用率，降低硝酸鹽含量。施用側(cè)孢短芽孢桿菌的作物葉綠素含量普遍高于對(duì)照，提高光合作用能力，可以充足供給作物蛋白質(zhì)合成的碳架，促使吸收到植物體的氮素很快合成蛋白質(zhì)，促進(jìn)氮的轉(zhuǎn)化，少施化肥，提高花費(fèi)利用率。氮素的迅速轉(zhuǎn)化導(dǎo)致植物體內(nèi)硝酸鹽含量減少。
[0010]第五，固化若干重金屬，降低植物體內(nèi)重金屬含量。有效菌的生命活動(dòng)改變環(huán)境條件，其他元素狀態(tài)、有機(jī)質(zhì)等，活化、固化了若干元素。
[0011]作為生防菌的主要生防機(jī)制，生防菌所分泌的抗生素起到了最為重要的作用，同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)作用和溶菌作用等也在發(fā)揮著各自的效果。然而生防菌在植物病害防治中也存在諸多問題，主要問題是在田間條件下生防菌達(dá)不到實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)效果，在田間具體施用時(shí)生防菌常常受到溫度、濕度、PH及農(nóng)藥化肥的影響，具體表現(xiàn)在定殖力差、抗藥性差、穩(wěn)定性差。
[0012]側(cè)孢短芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，革蘭氏染色陽(yáng)性，可變?yōu)殛幮浴Ｅ砬逯业仍趯?shí)驗(yàn)中測(cè)定此類細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果隨著生長(zhǎng)發(fā)育周期的變化而變化:在延遲期和靜止期時(shí)呈革蘭氏陰性，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)呈陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)中只取了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行了測(cè)定，所以對(duì)革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全。芽孢桿菌具有繁殖快速、生命力強(qiáng)、安全無(wú)毒等特點(diǎn)；側(cè)孢短芽孢桿菌能分泌合成多種有機(jī)酸、酶、生理活性物質(zhì)等。 [0013]關(guān)于側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)植物真菌的抑制機(jī)制研究在我國(guó)報(bào)道較少。趙秋敏等在2006年研究了側(cè)孢芽孢桿菌對(duì)小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)、棉花立枯菌(Rhizoctonia solani)、蘋果輪紋菌(Physalospora piricola)、黑曲霉(Aspergilliumniger)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等病原真菌的抑制作用進(jìn)行了研究，初步確定了抑菌物質(zhì)為幾丁質(zhì)酶。
[0014]近年來(lái)，生防細(xì)菌的應(yīng)用日益受到研究人員的重視，其抑菌效果也隨著研究的進(jìn)展得到了提高，在自然界中篩選獲得拮抗生防菌，進(jìn)而通過生物技術(shù)的方法對(duì)其進(jìn)行修飾或通過條件的改變使其抑菌效果增強(qiáng)，探究其使用方法，一般都是通過發(fā)酵的方法制成生物菌劑，發(fā)酵既可以生產(chǎn)生防菌，也可以通過發(fā)酵條件的改變生產(chǎn)抑菌物質(zhì)，使科研成果運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明解決的問題是利用實(shí)驗(yàn)田花生根際土壤資源開發(fā)一種可用于植物病害防治的廣譜、高效、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的活性菌株LX12，提供活性菌株LX12以及該菌株的培養(yǎng)、分離、鑒定、抑制真菌能力的測(cè)定以及在防治花生根腐病、白絹病、瘡痂病和褐斑病中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明參據(jù)的生物材料為L(zhǎng)X12菌株，分類命名為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus Iaterosporus),已于2013年04月07日經(jīng)檢測(cè)存活,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0017]具體地本發(fā)明的技術(shù)方案如下:[0018]一株花生根際生防菌，其特征在于，該菌株為活性菌株LX12，通過16SrDNA鑒定菌株LX12為側(cè)孢短芽孢桿菌，該菌株是從花生根際土壤中篩選出對(duì)真菌有拮抗性的細(xì)菌，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC7420。
[0019]本發(fā)明的活性菌株LX12經(jīng)菌落和形態(tài)的顯微觀察、染色反應(yīng)、常規(guī)生理生化特性實(shí)驗(yàn)以及16SrDNA序列分析，鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌，具有以下特征:
[0020](I)形態(tài)觀察顯示:菌株LX12呈白色，邊緣整齊，有凸起，表面光滑濕潤(rùn)，不透明。
[0021](2)生理生化特征測(cè)定:菌株LX12對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)革蘭氏染色為陽(yáng)性，能以檸檬酸鹽作為碳素的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，具有過氧化氫酶活力，甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，不能分解明膠、淀粉等大分子物質(zhì)，葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，蔗糖、乳糖發(fā)酵呈陰性。
[0022](3)通過16SrDNA鑒定菌株LX12為側(cè)孢短芽孢桿菌，為下一步對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌的探究奠定了基礎(chǔ)。
[0023]一株花生根際生防菌的分離方法，其特征在于，所述的分離方法為:稱取5g山東省花生研究所實(shí)驗(yàn)田花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無(wú)菌水試管中，制成1:100濃度的懸液，然后分別西區(qū)10_2和10_3土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2天。挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養(yǎng)基平板上畫線倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2天。
[0024]一株花生根際生防菌抑制真菌能力的測(cè)定方法，其特征在于，所述的測(cè)定方法包括如下步驟:
[0025](I)真菌的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中將花生根腐病菌、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌用鑷子取約0.5cm*0.5cm的正方形小塊接種至PDA培養(yǎng)基中，于28°C溫室中倒置培養(yǎng)2-3 天。
[0026](2)接種細(xì)菌:挑取對(duì)真菌抑制效果最好的單菌落LX12進(jìn)行真菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn)。待真菌長(zhǎng)至約占培養(yǎng)皿1/3大小時(shí)在距離真菌l-2cm處接種細(xì)菌，繼續(xù)放置28攝氏度溫室培養(yǎng)2-3天，觀察真菌生長(zhǎng)狀況。
[0027]上述的一株花生根際生防菌在防治花生花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌中的應(yīng)用。
[0028](I)菌株發(fā)酵液制備:將菌株活化后接入LB液體培養(yǎng)基，置于28度搖床中180r/min震蕩培養(yǎng)3d。
[0029](2)花生病原菌的接種:將保存的花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病組織清洗干凈后用粉碎機(jī)磨碎，紗布過濾后與無(wú)菌土混合使孢子數(shù)量為106個(gè)/g土。缽體下層為無(wú)菌土，上層為菌土，厚度5cm左右?；ㄉ苯硬シN。
[0030](3)發(fā)病情況調(diào)查:播種前用LX12生防菌發(fā)酵液拌種，播種后15d、30d、45d利用LX12發(fā)酵液灌根，每個(gè)處理10盆，每盆3株，每盆每次澆稀釋100倍發(fā)酵液100mL。設(shè)置50%多菌靈800倍液和清水兩個(gè)對(duì)照。種植75天后調(diào)查花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病的發(fā)病情況。
[0031]本發(fā)明的有益效果:
[0032]1.本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)花生真菌病害和其它幾種植物常見病害有良好的抑制作用。[0033]2.本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌穩(wěn)定性好培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單；
[0034]3.對(duì)峙試驗(yàn)顯示，本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)花生根腐病、白絹病、瘡痂病和褐斑病菌等花生病害有顯著的抑制作用，盆栽和田間試驗(yàn)顯示對(duì)花生根腐病、白絹病、瘡痂病和褐斑病有明顯的防治效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1:LX12菌落形態(tài)特征圖
[0036]圖2:菌株 LX12 的 16srDNA 的 PCR 產(chǎn)物
[0037]圖3:活性菌株LX12的16srDNA序列與GenBank基因庫(kù)中短芽孢桿菌屬的側(cè)孢短芽孢桿菌的16srDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果
[0038]圖4:菌株LX12與其在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)屬種構(gòu)建的以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹
【具體實(shí)施方式】
[0039]1、活性菌株LX12的分離
[0040]稱取5g山東省花生研究所實(shí)驗(yàn)田花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無(wú)菌水試管中，制成1:100濃度的懸液，然后分別西區(qū)10-2和10-3 土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養(yǎng)基平板上畫線倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。
[0041]其中，在LB培養(yǎng)基畫線培養(yǎng)一天后，菌落約0.3mm，呈白色，邊緣整齊，有凸起，表面光滑濕潤(rùn)，不透明。如圖1所示。`
[0042]2、LX12細(xì)菌的生理生化鑒定
[0043]革蘭氏染色、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)等參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化鑒定。
[0044]LX12菌株的生理生化鑒定結(jié)果見表1，結(jié)果顯示LX12菌體表現(xiàn)為革蘭氏陽(yáng)性，能以檸檬酸鹽作為碳素的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，具有過氧化氫酶活力，甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，不能分解明膠、淀粉等大分子物質(zhì)。經(jīng)比照文獻(xiàn)(方中達(dá)，1998 ;布坎南等，1984)，菌株LX12與側(cè)孢短芽孢桿菌的生理生化特性基本一致，初步確定該菌株為側(cè)孢短芽孢桿菌。
[0045]表1活性菌株LX12的生理生化特征
[0046]
1......鑒定項(xiàng) π............1......結(jié)果.......................................1......鑒 >? 項(xiàng) π...........].....結(jié)果.......................................]......鑒走項(xiàng) π...........]......結(jié)果.......................................1
革μ氏染I+I過氧化鋱I+I葡萄糖發(fā)I +
__mm
淀粉水解-_it橡酸鹽+__庶糖發(fā)酵-_
[0047]注:“ + ”表示反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性；“一”表示反應(yīng)結(jié)果為陰性。
[0048]Reference: “ +，，present positive result; “-，，present negative result.[0049]3、細(xì)菌的16SrRNA分子學(xué)鑒定
[0050]3、I菌株DNA提取
[0051]選取對(duì)真菌具有拮抗活性的細(xì)菌菌株，挑取10個(gè)相同的菌落做重復(fù)，進(jìn)行基因組DNA的提取，其提取方法主要參照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行，并略加修改，步驟如下:
[0052](I)取細(xì)菌培養(yǎng)液lmL，1000Orpm離心lmin，盡量吸凈上清；
[0053](2)向菌體沉淀中加入200 μ L緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸??；
[0054](3)加入 4 μ LRNAase (100mg/mL)溶液，震蕩 15s,室溫放置 5min ；
[0055](4)向管中加入20 μ L蛋白酶K溶液，混勻； [0056](5)加入220 μ L緩沖液GB，震蕩15s，70°C放置lOmin，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；
[0057](6)加入220 μ L無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15s，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；
[0058](7)將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0059](8)向吸附柱CB3中放入500 μ L緩沖液⑶(使用前檢查是否加收入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0060](9)向吸附柱CB3中放入700 μ L漂洗液PW (使用前檢查是否加收入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0061](10)向吸附柱CB3中放入500 μ L漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0062](11)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0063](12)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ L洗脫緩沖液TE，室溫放置5min, 12000rpm離心2min,將溶液收集到離心管中，-20°C保存。
[0064]3、2PCR與序列測(cè)定
[0065](I)提取的 DNA 參照 TaKaRa 公司的 16srDNABacterial Identification PCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中正向引物為:5 ’ -AGAGTTTGATCATGG CTCAG-3 ’，反向引物為:3’ -CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’。PCR 擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 Imin ；53°C退火lmin ;72°C延伸90s ;72°C后延伸5min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后置于3UVTMTransilluminator (UVP, USA)下進(jìn)行觀察。
[0066](2)根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的引物與預(yù)期擴(kuò)增片段大小，結(jié)合Marker，目的片段在紫外燈下切割下來(lái)，用回收試劑盒SilicaBeadDNAGelExtractionKit進(jìn)行DNA的回收。16srDNA序列測(cè)定由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。通過BLAST程序?qū)y(cè)定的序列與GenBank (NCBI,網(wǎng)站 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比較，然后從GenBank中獲得和試驗(yàn)菌株序列相近種、屬的16srDNA序列進(jìn)行確定。
[0067]菌株LXl2 的 I6SrDNA 序列:
[0068](16 sF)GACGAACGGCGGGCGGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAGGGTCTTCGGACCCTAGCGGCG
【權(quán)利要求】
1.一株花生根際生防菌，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其特征在于，該菌株為活性菌株LX12，保藏編號(hào)為CGMCC 7420。
2.一種由權(quán)利要求1所述保藏編號(hào)為CGMCC 7420的花生根際生防菌制備的微生物菌劑。
3.—種如權(quán)利要求1所述的花生根際生防菌的制備方法，其特征在于，包含如下步驟: 步驟1)稱取5g花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無(wú)菌水試管中，制成1:100濃度的懸液； 步驟2)然分別吸取10_2和10_3 土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2天； 步驟3)挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養(yǎng)基平板上畫線倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2天。
4.一種如權(quán)利要求1所述的花生根際生防菌抑制真菌能力的測(cè)定方法，其特征在于，包含如下步驟: 步驟1)真菌的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，分別取0.5cm*0.5cm小塊的花生根腐病菌、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌接種至PDA培養(yǎng)基中，于28°C溫室中倒置培養(yǎng)2-3天； 步驟2)接種細(xì)菌:挑取對(duì)真菌抑制效果最好的單菌落LX12進(jìn)行真菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn)；待真菌長(zhǎng)至約占培養(yǎng)皿1/3時(shí)，在距離真菌l_2cm處接種細(xì)菌，繼續(xù)放置28°C溫室中培養(yǎng)2_3天。
5.一種如權(quán)利要求1所述的花生根際生防菌在防治花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103756930SQ201310643869
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】遲玉成, 趙顯民, 許曼琳, 許婷婷, 吳菊香, 王磊, 謝宏峰, 焦坤 申請(qǐng)人:青島潤(rùn)地豐科技有限公司, 山東省花生研究所