本發(fā)明總體上涉及與csf1r和cd3結合以例如用于活化t細胞的抗體。此外，本發(fā)明涉及編碼此類抗體的多核苷酸，以及包含此類多核苷酸的載體和宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及用于產生這些抗體的方法，以及涉及使用這些抗體治療疾病、特別是治療急性髓系白血病(aml)的方法。

背景技術：

1、急性髓系白血病(aml)為成人中最常見的急性白血病，并且其分子異質性已經使新穎治療劑的成功開發(fā)變得復雜(the?cancer?genome?atlas?research?network,n?englj?med(2013)；368:2059-2074)。盡管大多數(shù)接受聯(lián)合化學療法的患者有前期治愈意圖，但疾病復發(fā)頻繁，超過50％經治療的患者會出現(xiàn)疾病復發(fā)(thol和ganser,curr?treatoptions?oncol(2020)；21(8):66。復發(fā)后，同種異體造血干細胞移植(allo-hsct)仍然是唯一的治愈方法，但即便如此，長期存活概率也低于20％。因此，針對aml的創(chuàng)新治療選項代表高度未滿足的醫(yī)療需求。

2、患有難治性或復發(fā)性aml的患者的預后始終很差(megias-vericat等人，annhematol.(2018)；97(7):1115-115)。據(jù)推測，一個可能的原因是免疫療法缺乏相關靶特異性，并且與經由在靶但脫aml(on-target-off-aml)檢測產生的毒性相關(gattinoni等人，nat?rev?immunol.(2006)；6(5):383-93)。

3、因此，有必要鑒定出更有希望的靶分子。針對aml的理想靶結構應盡可能廣泛且同質地表達在aml細胞上，但不表達在健康造血細胞上(或至少僅表達在不常見的亞型上)。目前，尚未鑒定出嚴格的aml特異性或癌癥特異性表面抗原(he等人，blood.(2020)；5；135(10):713-723.)。這被認為是因為此類靶結構也很可能在健康造血或相關細胞類型的細胞上表達(這也解釋了與通過目前為止所測試的各種療法來靶向此類抗原相關的大多數(shù)預期和觀察到的毒性)。與此相反，在健康細胞上不顯著表達的靶結構具有以下缺點：它們通常在aml母細胞上不均勻表達，或僅在特異性aml亞型中表達，從而限制了普遍適用性。因此，靶向更受限制的標志物的預期有益療法減少，并且阻礙了持久的治療效果。

4、t細胞已被確定為腫瘤學中的主要靶結構和效應子。與靶細胞上的表面抗原和活化性t細胞抗原(諸如t細胞上的cd3)結合的雙特異性抗體(在本文中也稱為t細胞雙特異性抗體或“tcb”)對于治療各種癌癥具有很好的前景。這種抗體與其兩個靶標的同時結合將迫使靶細胞和t細胞之間發(fā)生暫時的相互作用，導致t細胞受體交聯(lián)，并隨后活化任何細胞毒性t細胞，隨后裂解靶細胞。鑒于它們在靶細胞殺傷方面的效力，靶標的選擇和靶向抗體的特異性對于t細胞雙特異性抗體避免中靶和脫靶毒性至關重要。

5、在治療aml方面，car?t細胞以及針對cd33的雙特異性抗體正在研究中。然而，它們已被證明會在臨床上導致嚴重的副作用(wang等人，mol?ther.(2015)；23(1):184-91)，這可能是由于cd33作為靶點結構的特異性不夠所致。這進一步證明了有效的t細胞介導的aml治療對適當?shù)陌薪Y構和治療劑的高需求。

6、集落刺激因子1受體(csf1r)為i型單次穿膜蛋白，并且充當針對細胞因子集落刺激因子1(csf1)的受體。已知csf1r在體內表達于不同的骨髓亞群上，諸如m2巨噬細胞(ries等人(2014)cancer?cell?25(6),846-59)。在aml的上下文下，僅針對罕見亞型描述了csf1r信號傳導的擴增及其抑制的治療潛力(edwards等人，blood.(2019)133(6),588-599)。然而，csf1r的廣泛表達和該信號傳導通路的廣泛應用已經被否認(aikawa等人，naturemedicine(2010)；16(5),580-585；edwards等人，blood.(2019)133(6),588-599)。因此，由于其推定的低表達，csf1r尚未被認為是針對aml的合適靶結構。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人已經令人驚奇且出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與本領域的報道相反，csf1r為基于t細胞的療法提供了令人驚訝地有效的靶標。從所附實例可以明顯看出，csf1r被顯示出在大多數(shù)aml亞型上表達，而健康細胞上的表達僅限于不同的骨髓亞群，諸如m2巨噬細胞。本文進一步證明了csf1r作為廣泛表達的aml靶結構，可以有效地用作抗體療法中的靶分子。

2、本發(fā)明部分基于對csf1r作為血液癌癥、特別是aml的標志物的認識，在正常細胞上表達有限，因此涉及csf1r靶向劑及其在治療以表達csf1r為特征的癌癥、特別是aml中的用途。

3、本發(fā)明提供與csf1r結合的抗體，具體是多特異性(例如雙特異性)抗體。特別地，本發(fā)明提供與csf1r和cd3結合的抗體，其能夠特異性結合并誘導t細胞介導的aml細胞殺傷。這些(多特異性)抗體進一步結合了良好的功效和可生產性以及低毒性和有利的藥代動力學特性。

4、在一個方面，本發(fā)明提供一種與cd3和集落刺激因子1受體(csf1r)結合的抗體，該抗體包含：與cd3結合的第一抗原結合結構域；以及與csf1r結合的第二抗原結合結構域和任選的第三抗原結合結構域。在一個方面，第一抗原結合結構域包含重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)，該重鏈可變區(qū)包含seq?id?no:1的重鏈互補決定區(qū)(hcdr)1、seq?id?no:2的hcdr?2和seq?id?no:3的hcdr?3，該輕鏈可變區(qū)包含seq?id?no:4的輕鏈互補決定區(qū)(lcdr)1、seq?id?no:5的lcdr?2和seq?id?no:6的lcdr?3。在一個方面，第一抗原結合結構域的vh包含與seq?id?no:7的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和/或第一抗原結合結構域的vl包含與seq?id?no:8的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在特定的方面，第二抗原結合結構域和在存在時的第三抗原結合結構域包含vh和vl，該vh包含seq?id?no:21的hcdr?1、seq?idno:22的hcdr?2和seq?id?no:23的hcdr?3；該vl包含seq?id?no:24的lcdr?1、seq?id?no:25的lcdr?2和seq?id?no:26的lcdr?3。在進一步的特定方面，第二抗原結合結構域和在存在時的第三抗原結合結構域包含vh和/或vl，該vh包含與seq?id?no:27的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，該vl包含與seq?id?no:28的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一方面，第二抗原結合結構域和在存在時的第三抗原結合結構域包含vh和vl，該vh包含seq?id?no:9的hcdr?1、seq?id?no:10的hcdr?2和seq?id?no:11的hcdr?3，該vl包含seq?id?no:12的lcdr1、seq?id?no:13的lcdr?2和seq?id?no:14的lcdr?3。在進一步的方面，第二抗原結合結構域和在存在時的第三抗原結合結構域包含vh和/或vl，該vh包含與seq?id?no:15的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，該vl包含與seq?idno:16的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

5、在一個方面，所述第一抗原結合結構域、所述第二抗原結合結構域和/或在存在時的第三抗原結合結構域是fab分子。

6、在一個方面，第一抗原結合結構域為fab分子，其中fab輕鏈和fab重鏈的可變結構域vl和vh彼此替換或恒定結構域cl和ch1彼此替換，特別是可變結構域vl和vh彼此替換。

7、在一個方面，第二抗原結合結構域和在存在時的第三抗原結合結構域為常規(guī)fab分子。

8、在一個方面，第二抗原結合結構域以及在存在時的第三抗原結合結構域為fab分子，其中在恒定結構域cl中，位置124處的氨基酸獨立地經賴氨酸(k)、精氨酸(r)或組氨酸(h)取代(根據(jù)kabat編號)，并且位置123處的氨基酸獨立地經賴氨酸(k)、精氨酸(r)或組氨酸(h)取代(根據(jù)kabat編號)；而在恒定結構域ch1中，位置147處的氨基酸獨立地經谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)取代(根據(jù)kabat?eu索引編號)，并且位置213處的氨基酸獨立地經谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)取代(根據(jù)kabat?eu索引編號)。

9、在一個方面，第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域彼此融合，任選地經由肽接頭融合。

10、在一個方面，第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域各自為fab分子，并且(i)第二抗原結合結構域在fab重鏈的c末端處與第一抗原結合結構域的fab重鏈的n末端融合，或者(ii)第一抗原結合結構域在fab重鏈的c末端處與第二抗原結合結構域的fab重鏈的n末端融合。

11、在一個方面，抗體包含fc結構域，該fc結構域包含第一亞基和第二亞基。

12、在一個方面，第一抗原結合結構域、第二抗原結合結構域以及在存在時的第三抗原結合結構域各自為fab分子，并且抗體包含fc結構域，該fc結構域包含第一亞基和第二亞基；并且其中(i)第二抗原結合結構域在fab重鏈的c末端處與第一抗原結合結構域的fab重鏈的n末端融合，并且第一抗原結合結構域在fab重鏈的c末端處與fc結構域的第一亞基的n末端融合，或者(ii)第一抗原結合結構域在fab重鏈的c末端處與第二抗原結合結構域的fab重鏈的n末端融合，并且第二抗原結合結構域在fab重鏈的c末端與fc結構域的第一亞基的n末端融合；并且第三抗原結合結構域在存在時在fab重鏈的c末端處與fc結構域的第二亞基的n末端融合。

13、在一個方面，fc結構域是igg，特別是igg1?fc結構域。在一個方面，fc結構域是人fc結構域。在一個方面，fc包含促進fc結構域的第一亞基和第二亞基進行締合的修飾。在一個方面，fc結構域包含降低與fc受體的結合和/或效應功能的一個或多個氨基酸取代。

14、根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼本發(fā)明的抗體的分離的多核苷酸和包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的宿主細胞。

15、在另一方面，提供了產生與cd3和csf1r結合的抗體的方法，該方法包括以下步驟：(a)在適合表達該抗體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，以及任選地(b)回收該抗體。本發(fā)明還涵蓋通過本發(fā)明的方法產生的與cd3和csf1r結合的抗體。

16、本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的抗體和藥用載體的藥物組合物。

17、本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的抗體和藥物組合物的方法。在一個方面，本發(fā)明提供了用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物。在一個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的用于治療疾病的抗體或藥物組合物。還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物在制造藥物中的用途，以及根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物在制造用于治療疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療個體中的疾病的方法，包括向所述個體施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物。在某些方面，該疾病為癌癥。在特定的方面，疾病為以表達csf1r為特征的癌癥。在甚至更特定的方面，疾病為急性髓系白血病(aml)。