本發(fā)明涉及一種多糖，尤其涉及一種從鮑魚(yú)肌肉提取的新型多糖及其制備工藝和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鮑魚(yú)被譽(yù)為海洋人參，蛋白、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分有助于促進(jìn)人體健康。由于鮑魚(yú)來(lái)源的多糖具有良好的抗氧化、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗凝血活性等功能，因此近年來(lái)從鮑魚(yú)提取多糖已引起廣泛的關(guān)注。中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN102898538 A公開(kāi)一種鮑魚(yú)內(nèi)臟酸性多糖及含有其的保健品和應(yīng)用，其鮑魚(yú)內(nèi)臟多糖主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖構(gòu)成，可以用作一種保肝護(hù)肝的功能因子。然而，有關(guān)鮑魚(yú)肌肉多糖的結(jié)構(gòu)和功能卻鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鮑魚(yú)肌肉多糖，所述多糖從鮑魚(yú)肌肉中提取，具有良好的抑制乳腺癌和肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的活性。

本發(fā)明還提供了所述鮑魚(yú)肌肉多糖的制備工藝和應(yīng)用。

本發(fā)明的內(nèi)容為：

一種鮑魚(yú)肌肉多糖，主要由葡萄糖及甘露糖組成，分子量為3200Da，其主鏈?zhǔn)怯善咸烟峭ㄟ^(guò)1→4糖苷鍵和1→6糖苷鍵構(gòu)成，側(cè)鏈?zhǔn)怯?→6糖苷鍵組成，糖殘基為α構(gòu)型，具體結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明還提供了所述鮑魚(yú)肌肉多糖的制備方法，步驟為：

1、鮑魚(yú)肌肉去除表面雜質(zhì)后，與2-4倍重量冷水混合攪碎，然后在10-30℃下攪拌萃取0.5-2h，通過(guò)5000rpm離心15-30min除去不溶物后，獲得上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調(diào)整pH至9.0，然后先后加入上清液質(zhì)量體積比的1-2g/L堿性蛋白酶和1-2g/L膠原酶，在45-55℃下酶解1-3h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調(diào)整至6.0-7.0，再分別加入液體質(zhì)量體積比的1-2g/L中性蛋白酶和1-2g/L木瓜蛋白酶，在45-55℃下酶解1-3h。

4、酶解結(jié)束后，通過(guò)旋蒸濃縮后，往濃縮液中加入無(wú)水酒精，使溶液中的酒精濃度達(dá)到20-40％，于常溫下靜置30-60min后，過(guò)濾除去沉淀。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續(xù)緩慢添加無(wú)水酒精，使溶液中的酒精濃度達(dá)到80％，放在4℃下靜置8-16h可以獲得鮑魚(yú)肌肉重量5-6％的沉淀物。

6、上述沉淀物用5-10倍沉淀物重量的蒸餾水溶解后，加入溶液質(zhì)量體積比的5-20g/L的活性炭，在30-40℃下脫色1-3h后，通過(guò)5000rpm離心15-30min、過(guò)濾除去活性炭后，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯(lián)葡聚糖凝膠層析純化，最后通過(guò)冷凍干燥獲得鮑魚(yú)肌肉多糖，純度為92％。

本發(fā)明還提供了上述鮑魚(yú)肌肉多糖在治療乳腺癌藥品和保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述鮑魚(yú)肌肉多糖在治療肝癌藥品和保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提取的鮑魚(yú)肌肉多糖為3200Da的葡聚糖，易于合成；具有良好的抑制乳腺癌和肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的活性；本發(fā)明明確了鮑魚(yú)肌肉多糖的分子結(jié)構(gòu)，可以為合成提供參考；本發(fā)明采用冷水浸提，提取多糖后的鮑魚(yú)肌肉殘?jiān)€可以用于其他產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，將起到多元化綜合利用。

【附圖說(shuō)明】

圖1是鮑魚(yú)肌肉多糖甲基化前(a)和甲基化后(b)的紅外圖譜；

圖2是鮑魚(yú)肌肉多糖的1H NMR譜圖；

圖3是鮑魚(yú)肌肉多糖的13C NMR譜圖；

圖4是鮑魚(yú)肌肉多糖的HSQC譜圖；

圖5是鮑魚(yú)肌肉多糖的COSY譜圖；

圖6是鮑魚(yú)肌肉多糖的TOCSY譜圖；

圖7是鮑魚(yú)肌肉多糖的HMBC譜圖；

圖8是鮑魚(yú)肌肉多糖的ROESY譜圖；

圖9是鮑魚(yú)肌肉多糖主鏈分子結(jié)構(gòu)圖；

圖10是鮑魚(yú)肌肉多糖對(duì)人體肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)生長(zhǎng)抑制的影響；

圖11是鮑魚(yú)肌肉多糖對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231細(xì)胞)生長(zhǎng)抑制的影響。

【具體實(shí)施方式】

以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，以下對(duì)于具體實(shí)施方案的描述僅用于解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

1、1kg的鮑魚(yú)肌肉去除表面雜質(zhì)后，與4L冷水混合攪碎，然后在10℃下攪拌萃取2h，通過(guò)5000rpm離心15min除去不溶物后，獲得4.5L的上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調(diào)整pH至9.0，然后先后加入4.5g堿性蛋白酶和4.5g膠原酶，在50℃下酶解2h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調(diào)整至6.5，再分別加入4.5g中性蛋白酶和4.5g木瓜蛋白酶，在50℃下酶解2h。

4、酶解結(jié)束后，通過(guò)旋蒸濃縮至0.5L，往濃縮液中加入0.33L的無(wú)水酒精，于常溫下靜置30min后，過(guò)濾除去沉淀。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續(xù)緩慢添加1.67L的無(wú)水酒精，放在4℃下靜置8h可以獲得50g左右的沉淀物。

6、上述沉淀物用0.50L的蒸餾水溶解后，加入5g的活性炭，在30℃下脫色3h后，通過(guò)5000rpm離心15min、過(guò)濾除去活性炭后，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯(lián)葡聚糖凝膠層析純化，最后通過(guò)冷凍干燥獲得10g鮑魚(yú)肌肉多糖，純度為92％。

7、采用苯酚-硫酸法，以半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)鮑魚(yú)肌肉多糖的總糖含量；采用凱氏定氮法測(cè)量蛋白含量；單糖組成采用高效液相色譜法測(cè)定；多糖結(jié)構(gòu)采用核磁共振(NMR)進(jìn)行分析；多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用通過(guò)四唑鹽(MTT)比色法進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例2

1、1kg的鮑魚(yú)肌肉去除表面雜質(zhì)后，與2L冷水混合攪碎，然后在20℃恒溫箱里攪拌萃取30min，通過(guò)5000rpm離心30min除去不溶物后，獲得2.5L的上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調(diào)整pH至9.0，然后先后加入5.0g堿性蛋白酶和5.0g膠原酶，在45℃下酶解1h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調(diào)整至6.0，再分別加入5.0g中性蛋白酶和5.0g木瓜蛋白酶，在45℃下酶解1h。

4、酶解結(jié)束后，通過(guò)旋蒸濃縮至0.4L，往濃縮液中加入0.1L的無(wú)水酒精，于常溫下靜置60min后，過(guò)濾除去沉淀。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續(xù)緩慢添加1.5L的無(wú)水酒精，放在4℃下靜置16h可以獲得60g左右的沉淀物。

6、上述沉淀物用0.30L的蒸餾水溶解后，加入3g的活性炭，在35℃下脫色1h后，通過(guò)5000rpm離心30min、過(guò)濾除去活性炭后，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯(lián)葡聚糖凝膠層析純化，最后通過(guò)冷凍干燥獲得11g鮑魚(yú)肌肉多糖，純度為92％。

7、采用苯酚-硫酸法，以半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)鮑魚(yú)肌肉多糖的總糖含量；采用凱氏定氮法測(cè)量蛋白含量；單糖組成采用高效液相色譜法測(cè)定；多糖結(jié)構(gòu)采用核磁共振(NMR)進(jìn)行分析；多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用通過(guò)四唑鹽(MTT)比色法進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例3

1、1kg的鮑魚(yú)肌肉去除表面雜質(zhì)后，與3L冷水混合攪碎，然后在30℃恒溫箱里攪拌萃取30min，通過(guò)5000rpm離心25min除去不溶物后，獲得3.5L的上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調(diào)整pH至9.0，然后先后加入1.75g堿性蛋白酶和1.75g膠原酶，在55℃下酶解3h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調(diào)整至7.0，再分別加入1.75g中性蛋白酶和1.75g木瓜蛋白酶，在55℃下酶解3h。

4、酶解結(jié)束后，通過(guò)旋蒸濃縮至0.3L，往濃縮液中加入0.13L的無(wú)水酒精，于常溫下靜置60min后，過(guò)濾除去沉淀。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續(xù)緩慢添加0.77L的無(wú)水酒精，放在4℃下靜置12h可以獲得60g左右的沉淀物。

6、上述沉淀物用0.40L的蒸餾水溶解后，加入12g的活性炭，在40℃下脫色1h后，通過(guò)5000rpm離心25min、過(guò)濾除去活性炭后，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯(lián)葡聚糖凝膠層析純化，最后通過(guò)冷凍干燥獲得11.5g鮑魚(yú)肌肉多糖，純度為92％。

7、采用苯酚-硫酸法，以半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)鮑魚(yú)肌肉多糖的總糖含量；采用凱氏定氮法測(cè)量蛋白含量；單糖組成采用高效液相色譜法測(cè)定；多糖結(jié)構(gòu)采用核磁共振(NMR)進(jìn)行分析；多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用通過(guò)四唑鹽(MTT)比色法進(jìn)行檢測(cè)。

鮑魚(yú)肌肉多糖組成及結(jié)構(gòu)分析

上述3個(gè)實(shí)施例提取的鮑魚(yú)肌肉多糖總量、蛋白含量及單糖組成如表1所示：

表1鮑魚(yú)肌肉多糖的化學(xué)組成和單糖組成

根據(jù)表1的結(jié)果，3個(gè)實(shí)施例提取的鮑魚(yú)肌肉多糖中的蛋白含量都低于1％，總糖含量都接近90％，而且以摩爾比例計(jì)算，該鮑魚(yú)肌肉多糖含有99％以上的D-葡萄糖，表明本發(fā)明提取的鮑魚(yú)肌肉多糖可能是一種葡聚糖。另外，提取的鮑魚(yú)肌肉多糖的分子量大約為3200Da(數(shù)據(jù)未顯示)。

將鮑魚(yú)肌肉多糖甲基化，甲基化前后產(chǎn)物的紅外光譜結(jié)果如圖1所示，甲基化后的紅外光譜在3400cm^-1附近沒(méi)有出現(xiàn)峰，說(shuō)明鮑魚(yú)肌肉多糖甲基化完全。對(duì)甲基化產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果如表2所示：

表2鮑魚(yú)肌肉多糖甲基化產(chǎn)物分析

由表2可知，葡萄糖Glc檢測(cè)出以下四種鍵型：1→，1→4，1→6，1→4,6；甘露糖(Man)檢測(cè)出了一種鍵型：1→2。與單糖結(jié)果類似，鮑魚(yú)肌肉多糖也檢測(cè)到少量的支鏈(1→2)Man，因此理論上可以認(rèn)為所提取的鮑魚(yú)肌肉多糖是由D-葡萄糖組成的葡聚糖。

鮑魚(yú)肌肉多糖的結(jié)構(gòu)特征通過(guò)1D和2D NMR圖譜確定，如圖2所，¹H-NMR圖譜的異頭氫區(qū)域分別觀察到δ5.35(d, ³J_H-1,H-2＝4.13Hz),5.33(沒(méi)有分裂峰),5.24(d,³J_H-1,H-2＝4.00Hz)，4.98ppm(d,³J_H-1,H-2＝4.13Hz)四個(gè)異頭氫信號(hào)，表明鮑魚(yú)肌肉多糖的糖殘基是通過(guò)α-構(gòu)型的糖苷鍵連接。

從圖3的¹³C NMR圖譜中可以觀察到δ102.83，101.39，100.76，98.58和94.69ppm五個(gè)異頭碳信號(hào)，但在圖4的HSQC圖譜的異頭區(qū)只觀察到了四個(gè)主要的交叉峰。因此可以認(rèn)為鮑魚(yú)肌肉多糖是由四個(gè)糖殘基組成，對(duì)應(yīng)的異頭區(qū)信號(hào)分別為δ5.35/102.83(殘基A)，5.33/100.76(殘基B)，5.24/94.68(殘基C)和4.98/101.63ppm(殘基D)。圖3的¹³C NMR圖譜還可以說(shuō)明鮑魚(yú)肌肉多糖是一種吡喃糖。另一方面，由圖2中異頭氫信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度以及甲基化的結(jié)果可以將殘基A，B，C，D暫時(shí)歸屬為→4)-α-D-Glc-(1→，→4,6)-α-D-Glcp-(1→，→6)-α-D-Glcp-(1→和T-α-D-Glcp-(1→。

根據(jù)圖4的HSQC譜圖，圖5的COSY譜圖和圖6的TOCSY譜圖的結(jié)果及文獻(xiàn)中的數(shù)值對(duì)¹H NMR和¹³C NMR中的信號(hào)進(jìn)行歸屬，結(jié)果如表3所示：

表3鮑魚(yú)肌肉多糖的COSY,TOCSY和HSQC譜峰的歸屬

由表3中的數(shù)據(jù)可以看出，¹³C NMR圖譜中的信號(hào)值80.80和80.87ppm分別屬于殘基A和殘基B的4位碳，表明殘基A和殘基B的4位碳發(fā)生了取代。同樣的，殘基B和殘基C的6位碳也發(fā)生了取代。由此進(jìn)一步證明對(duì)殘基A，B，C，D的歸屬是合理的。此外，在甲基化的結(jié)果中有檢測(cè)到鮑魚(yú)肌肉多糖中含有糖殘基→2)-Man-(1→，但是在核磁分析結(jié)果(圖2、圖3)中沒(méi)有檢測(cè)到它的信號(hào)，這可能是因?yàn)轷U魚(yú)肌肉多糖中的甘露糖含量太低的緣故。

從圖7中可以觀察到鮑魚(yú)肌肉多糖殘基A的H-1(δ5.35ppm) 和C-4的交叉峰(A H-1/A C-1)，殘基B的H-4(δ3.66ppm)和殘基A的C-1的交叉峰(B H-4/A C-1)，殘基B的H-1(δ5.33ppm)和殘基A的C-4的交叉峰(B H-1/A C-4)，表明殘基A和殘基A以及殘基A和殘基B之間都是通過(guò)1,4-糖苷鍵進(jìn)行連接。

從圖8中可以觀察到鮑魚(yú)肌肉多糖殘基A的H-1(δ5.33ppm)和殘基C的H-6的交叉峰(A H-1/C H-6)，殘基D的H-1(δ4.98ppm)和殘基B的H-6的交叉峰(D H-1/B H-6)，表明鮑魚(yú)肌肉多糖中的糖殘基A和殘基C以及殘基D和殘基B之間都是以1,4-糖苷鍵進(jìn)行連接。交叉峰A H-1/A H-4和A H-1/B H-4同樣可以在ROESY圖譜中觀察到。

基于以上所有的化學(xué)及光譜分析結(jié)果，可以推斷出從鮑魚(yú)肌肉中獲得的α-葡聚糖的一個(gè)可能的分子結(jié)構(gòu)如圖9：在鮑魚(yú)肌肉多糖結(jié)構(gòu)的一個(gè)循環(huán)單元中，主鏈上包含八個(gè)1→4糖苷鍵和一個(gè)1→6糖苷鍵，三條側(cè)鏈通過(guò)1→6糖苷鍵與主鏈相連。

鮑魚(yú)肌肉多糖對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的抑制分析

圖10和圖11為鮑魚(yú)肌肉多糖對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231細(xì)胞)和人體肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)生長(zhǎng)抑制的影響，結(jié)果表明提取的鮑魚(yú)肌肉多糖對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用都有抑制效果和明顯量效關(guān)系，可以應(yīng)用在治療乳腺癌和肝癌藥品和保健品中。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發(fā)明之精神與范疇，而對(duì)其進(jìn)行之等效修改或變更，均應(yīng)包含于后附之申請(qǐng)專利范圍中。