本發(fā)明涉及一種三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針及其制備方法。

背景技術：

pH值是生物體的一個重要指標，特定的pH值在很多生理、病理過程中起著十分重要的作用。細胞內(nèi)的pH在許多生理、病理過程中起著重要的作用。酸性或堿性過強會引起細胞功能紊亂，導致心、肺病變或神經(jīng)類疾病，嚴重時甚至會有生命危險。因此監(jiān)測細胞內(nèi)pH值的變化可以為研究生理和病理過程提供重要信息。大部分文獻報的熒光素類pH探針多以羅丹明B為主體，而且此類的pH探針水溶性很差，這就大大限制了其應用范圍。2015年，報道了一種乙?；溄拥牧_丹明B肼-1-苯基哌嗪pH探針（The Journal of Biological and Chemical Luminescence）的31期的865–870頁公開的文章（Sensitive detection of strong acidic condition by a novel rhodamine-based fluorescent pH chemosensor），此探針的測試液乙醇與水的體積比為1:1，有機溶劑體積分數(shù)占50%，pH在1.75-2.6的范圍內(nèi)隨著pH值增大，熒光值逐步降低，且呈現(xiàn)良好的線性關系。

2014年,報道了一種名為碳碳雙鍵鏈接的熒光素肼-3,4二羥基芐基的熒光探針（Dyes and Pigments）的107期的127-132頁公開的文章（A sensitive and selective fluorescence probe based fluorescein for detection of hypochlorous acid and its application for biological imaging）。此探針的測試液二甲基亞砜與水的體積比為20:1，有機溶劑體積分數(shù)僅占5%。研究發(fā)現(xiàn)此化合物含有四個羥基，這就大大增加了其水溶性。

2016年，報道了一類苯并咪唑pH探針（Dyes and Pigments）的12期的165-169頁公開的文章（Benzimidazole-BODIPY as optical and fluorometric pH sensor）Stokes'位移僅為15 nm。在pH為3.05-8.09的范圍內(nèi)，隨著pH值得增大熒光值逐漸降低。

據(jù)文獻報道的pH熒光探針，多羥基咪唑-熒光素具有以下優(yōu)點：

1、熒光素在結構上含兩個羥基，若以熒光素為熒光主體，可以提高探針的水溶性。

2、以熒光素為信號體的分子探針熒光發(fā)射波長可達550 nm以上，可以實現(xiàn)熒光變化的“裸眼”觀測。如果將熒光素和咪唑有機結合起來不僅可以克服咪唑自身缺點，還可以將大大提高其應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的pH熒光探針水溶性差，咪唑類化合物自身的熒光強度較低，與受體作用后熒光發(fā)射波長沒有太大變化，Stokes 位移變化較小的問題，而提供三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針及其制備方法。

本發(fā)明的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結構式為：

上述三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的制備方法，按以下步驟進行：

一、中間體化合物的合成：

將菲醌、5-硝基水楊醛、苯胺、乙酸銨按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物質(zhì)的量比加入到反應器中，再加入20.0~40.0 ml冰乙酸，升溫至80~130℃并攪拌4~12 h后，冷卻至室溫，向反應器中加入水，再用堿性溶液（質(zhì)量分數(shù)為30~40%氫氧化鈉溶液）調(diào)pH值至8～10，抽濾，收集黃色固體，干燥。乙酸乙酯重結晶，經(jīng)抽濾、干燥，得到土黃色固體（2-羥基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

二、中間體化合物的合成：

稱取2.0 mmol中間體化合物和 0.08~0.22 g 雷尼鎳加入到反應器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮氣保護，在25~30℃ 下攪拌，滴加5.0~12.0 mL質(zhì)量百分濃度為80%的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至50~80℃，反應5~10 h，冷卻至室溫，抽濾，并用大量乙酸乙酯洗滌，收集濾液，濃縮，得到棕色固體（2-羥基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

三、中間體化合物的合成：

將3.0 g熒光素加入到反應器中，加入3.0~8.0 ml甲醇溶液，加入40%~60%的氫氧化鈉溶液，冷至50~60℃，緩慢滴加8.0~16.0 ml氯仿，攪拌3~12 h，停止反應，冷至25~30℃。加入酸性溶液（質(zhì)量分數(shù)為50~70%醋酸溶液），調(diào)至pH值為4~6，抽濾，收集褐色固體，干燥，柱分離。得到淺黃色固體，熒光素單醛，中間體化合物。

四、pH熒光探針的合成：

按照1:1~3物質(zhì)的量比稱取中間體化合物和中間體化合物，加入到反應器中，再加入酸性介質(zhì)為溶劑，25~30℃下攪拌反應4~8 h，停止反應，加水淬滅，再用堿性溶液調(diào)pH值至6～10，抽濾，水洗濾餅至中性，干燥，乙酸乙酯重結晶，得到褐色固體，三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針。

步驟一中堿性介質(zhì)可以是質(zhì)量分數(shù)為30~40%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量分數(shù)為50~60%的碳酸鈉溶液、質(zhì)量分數(shù)為50~70%的碳酸氫鈉溶液、質(zhì)量分數(shù)為40~55%的碳酸鉀溶液、質(zhì)量分數(shù)為48~80%的碳酸氫鉀溶液、質(zhì)量分數(shù)為30~40%的氫氧化鉀溶液。三中所述的酸性介質(zhì)可以是質(zhì)量分數(shù)為98%的濃硫酸、質(zhì)量分數(shù)為36~37%的濃鹽酸、質(zhì)量分數(shù)為50~70%冰乙酸、質(zhì)量分數(shù)為40~50%磷酸、質(zhì)量分數(shù)為30~60%的甲酸、質(zhì)量分數(shù)為10~30%的酸性離子液體。

本發(fā)明的合成過程如下式子所示：

中間體化合物I

中間體化合物

中間體化合物

三羥基咪唑-熒光素

本發(fā)明提供了一種具有良好水溶性，在pH值為6.5~8.0的范圍內(nèi)，具有高選擇性、響應靈敏的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。該pH熒光探針在pH值為6.5~8.0的范圍內(nèi)具有良好的線性關系，而且不受K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺和Hg²⁺；I^-、Cl^-、Br^-、CO₃^2-、HCO₃^-、SO₄^2-、NO^2-、AcO^-、H₂PO₄^-、HPO₄^2-、BrO₃^-、NO₃^-、SO₃^2-、HSO₃^2-、F^-、SCN^-等其他離子的干擾，結構穩(wěn)定，用于pH值的檢驗，方便穩(wěn)定。

附圖說明

圖1是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12) 體系中的紫外光譜圖，橫坐標為波長，縱坐標為吸光度。

圖2是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素為pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 6.5~7.9)，λ= 488 nm處的吸光度線性關系圖,橫坐標為pH值，縱坐標為吸光度

圖3是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素為pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9) 在不同pH下，λ = 488 nm處的吸光度與此波長下最大吸光度之比A/A_max。當A/A_max = 0.5時，根據(jù)公式pK_a= pH ± lg ((A_max-A)/(A-A_min))，計算出pK_a= 6.6319或pK_a= 6.9680，橫坐標為pH值，縱坐標為A/A_max。

圖4是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素為pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)在不同的pH條件下的熒光發(fā)射光譜，橫坐標為pH值，縱坐標為熒光強度。

圖5是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH = 6.5~8.0，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在λ=525 nm處的熒光值線性關系圖，橫坐標為pH值，縱坐標為熒光強度。

圖6是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在λ = 525 nm處的熒光強度與此波長下最大熒光強度之比I/I_max。當I/I_max = 0.5時，根據(jù)公式pK_{a =} pH ± lg((I_max-I)/(I-I_min))，計算出pK_a= 7.0806或pK_a= 6.9193，橫坐標為pH值，縱坐標為I/I_max。

圖7是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在pH = 9.1和pH = 2之間的熒光可逆光譜圖，橫坐標為循環(huán)次數(shù)，縱坐標為熒光強度。

圖8是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH=9.1，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，陰離子對三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針干擾的熒光發(fā)射光譜圖，橫坐標為陰離子，縱坐標為熒光強度。

圖9是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v = 1/9，pH=2，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，陰離子對三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針干擾的熒光發(fā)射光譜圖，橫坐標為陰離子，縱坐標為熒光強度。

圖10是試驗1制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針在DMF/HEPES緩沖溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狹縫寬度為2)，在pH = 9.1, pH = 7.0 ,pH = 2.0 三個不同pH條件下的時間響應及時間穩(wěn)定熒光光譜圖，橫坐標為時間，縱坐標為熒光強度。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結構式為：

具體實施方式二：具體實施方式二的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的制備方法，按以下步驟進行：

一、中間體化合物的合成：

將菲醌、5-硝基水楊醛、苯胺、乙酸銨按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物質(zhì)的量比加入到反應器中，再加入20~40 ml冰乙酸，升溫至80~130℃并攪拌4 ~12 h后，冷卻至室溫，向反應器中加入水，再用堿性溶液（質(zhì)量分數(shù)為30~40%的氫氧化鈉溶液）調(diào)pH值至8～10，抽濾，收集黃色固體，干燥。乙酸乙酯重結晶，經(jīng)抽濾、干燥，得到土黃色固體（2-羥基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

二、中間體化合物的合成：

稱取2.0 mmol中間體化合物和 0.08~0.22 g 雷尼鎳加入到反應器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮氣保護，在25~30℃ 下攪拌，滴加5.0~12.0 mL質(zhì)量百分濃度為80%的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至50 ~80℃，反應5 ~ 10 h，冷卻至室溫，抽濾，并用大量乙酸乙酯洗滌，收集濾液，濃縮，得到棕色固體（2-羥基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

三、中間體化合物的合成：

將3.0 g熒光素加入到反應器中，加入3~8 ml甲醇溶液，加入40%~60% 的氫氧化鈉溶液，冷至50~60℃，緩慢滴加8~16 ml氯仿，攪拌3~12 h，停止反應，冷至25~30℃。加入酸性溶液（質(zhì)量分數(shù)為50~70% 醋酸溶液），調(diào)至pH值為4~6，抽濾，收集褐色固體，干燥，柱分離。得到淺黃色固體，熒光素單醛，中間體化合物。

四、pH熒光探針的合成：

按照1 : 1的物質(zhì)的量的比稱取中間體化合物I和中間體化合物II，加入到反應器中，再加入酸性介質(zhì)為溶劑，常溫攪拌反應6 h，反應結束后，向反應體系中加入水淬滅反應，再用質(zhì)量分數(shù)為5~10％氫氧化鉀溶液調(diào)pH值至7～8，析出固體，然后進行抽濾，濾餅并水洗至中性，烘干，再用乙酸乙酯重結晶，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是步驟三中所述的酸性介質(zhì)為質(zhì)量分數(shù)為98%的濃硫酸、質(zhì)量分數(shù)為36~37%的濃鹽酸、冰乙酸或甲酸。其它與具體實施方式二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式二或三不同的是步驟一中的反應溫度為95~100℃，反應時間為10～12 h。其它與具體實施方式二或三相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式二至四之一不同的是步驟一中的pH值至7~9。其它與具體實施方式二至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式二至五之一不同的是步驟二中反應溫度為70~80℃，反應時間為8~9 h。其它與具體實施方式二至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式二至六之一不同的是步驟三中常溫攪拌反應3~5天。其它與具體實施方式二至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式二至七之一不同的是步驟三中pH值為8~10。其它與具體實施方式二至七之一相同。

用以下實例驗證本發(fā)明的有益效果：

試驗1：本試驗的三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針的制備方法，按以下步驟進行：

一、中間體化合物的合成：

將菲醌、5-硝基水楊醛、苯胺、乙酸銨按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物質(zhì)的量比加入到反應器中，再加入20~40 ml冰乙酸，升溫至80~130℃ 并攪拌4 ~12 h后，冷卻至室溫，向反應器中加入水，再用堿性溶液調(diào)pH值至8～10，抽濾，收集黃色固體，干燥。乙酸乙酯重結晶，經(jīng)抽濾、干燥，得到土黃色固體（2-羥基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

本步驟得到的中間體化合物的產(chǎn)率為95%，熔點：>300℃。用紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜表征該中間體化合物，得到的結果如下：

IR (KBr, cm^–1): 3326, 3080, 1595, 1479, 1332, 1299, 760, 725; ¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H 14.33 (H, s), 9.28 (H, s)，8.90 (2H, d, J = 8.40 Hz )，8.53(2H, d, J = 7.80 Hz), 8.25 (H, d, J = 8.40 Hz), 7.80 (3H, t, J = 7.20 Hz), 7.71 (2H, t, J = 7.80 Hz), 7.26(H, d, J = 9.0 Hz); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO) : δ_C163.4, 147.7, 140.2, 128.5, 128.5, 128.4, 128.4, 127.9, 127.9, 127.9, 126.7, 126.6, 126.6, 124.5, 124.5, 124.5, 122.5, 122.5, 122.5, 118.5, 113.5.

從表征結果知該中間體化合物的結構式為：

二、中間體化合物的合成：

稱取2.0 mmol中間體化合物和 0.08~0.22 g 雷尼鎳加入到反應器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮氣保護，在25~30℃ 下攪拌，滴加5.0 ~12.0 mL質(zhì)量百分濃度為80% 的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至50 ~80℃，反應5 ~ 10 h，冷卻至室溫，抽濾，并用大量乙酸乙酯洗滌，收集濾液，濃縮，得到棕色固體（2-羥基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中間體化合物。

本步驟得到的中間體化合物的產(chǎn)率為91%，熔點：>300℃。用紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜表征該中間體化合物，得到的結果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 3421，1728，1636，1616，1465，1349，757，725;¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H13.60 (H, s, J = 13.60 Hz), 12.23 (H, s, J = 12.23 Hz), 8.90 (2H, q, J = 8.90 Hz), 8.64 (H, d, J = 8.64Hz), 8.49 (H, d, J = 8.49 Hz), 7.77 (2H, q, J = 7.77 Hz), 7.68 (2H, t, J = 7.68 Hz), 7.44 (H, s, J = 7.44 Hz), 6.84 (H, q, J = 6.84 Hz), 6.73 (H, d, J = 6.73 Hz), 4.75 (2H, s, J = 4.75 Hz); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO): δ_C 170.8, 150.4, 149.5, 141.3, 134.8, 128.3, 128.1, 127.9, 127.7, 126.7, 126.2, 126.0, 124.6, 124.4, 122.7, 122.5, 122.2, 119.2, 118.0, 113.2, 110.7.

從表征結果知該中間體化合物的結構式為：

二、中間體化合物的合成：

將3.0 g熒光素加入到反應器中，加入3~8 ml甲醇溶液，加入40%~60% 的氫氧化鈉溶液，冷至50~60℃，緩慢滴加8~16 ml氯仿，攪拌3~12 h，停止反應，冷至25~30℃。加入酸性溶液，調(diào)至pH值為4~6，抽濾，收集褐色固體，干燥，柱分離。得到淺黃色固體，熒光素單醛，中間體化合物。本步驟得到的中間體化合物的產(chǎn)率為24～28%；

用紅外光譜、核磁氫譜進行表征，得到的結果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 2928, 2853, 1727;¹H NMR(200 MHz, DMSO): δ_H 11.88 (H, s), 10.66 (H, s), 10.27 (H, s), 8.02 (H, d, J = 6.6 Hz), 7.86–7.69 (2H, m), 7.32 (H, d, J = 6.6 Hz), 6.96 (H, d, J = 8.8 Hz), 6.85 (H, s), 6.71 (H, d, J = 8.8 Hz), 6.61 (H, s).

從表征結果知該中間體化合物的結構式為：

三、三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的合成：

按照1 :1～3物質(zhì)的量的比稱取中間體化合物和中間體化合物，加入到反應器中，再加入酸性介質(zhì)為溶劑，25℃～30℃ 攪拌反應4～8 h，停止反應，加水淬滅，再用溶液調(diào)pH值至6～10，抽濾，水洗濾餅至中性，干燥，乙酸乙酯重結晶，得到褐色固體，三羥基咪唑-熒光素的pH熒光探針。本步驟中，三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的產(chǎn)率為96%。

三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的熔點為303~305℃。質(zhì)量百分純度大于95%。

用紅外光譜及核磁共振譜進行表征，得到的結果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 3421, 1728, 1636, 1616, 1600, 1465, 1394, 1349, 757, 725, 695; ¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H 15.13 (H, s, J = 15.13 Hz), 13.87 (H, s, J = 13.87 Hz), 13.45 (H, s, J = 13.45 Hz), 10.22 (H, s, J = 10.22 Hz), 9.64 (H, s, J = 9.64 Hz), 8.92 (2H, s, J = 8.92 Hz),8.60 (2H, d, J = 8.60 Hz), 8.46 ( s, J = 8.46Hz, H, ArH), 8.04 ( d, J = 8.04 Hz, H, ArH), 7.82 ( t, J = 7.82 Hz, 3H, ArH), 7.76 (H, q, J = 7.76 Hz), 7.34 (H, d, J = 7.34 Hz), 7.27 (H, d, J = 7.27 Hz), 7.04 (H, d , J = 7.04 Hz) 6.80 (2H, q , J = 6.80 Hz) 6.63 (2H, s, J = 6.63 Hz, ArH);

¹³C NMR (150 MHz, DMSO): δ_C169.12, 164.18, 160.07, 157.61, 156.02, 152.74, 151.74, 151.17, 149.17, 138.96, 136.26, 134.62, 133.18, 130.77, 129.46, 128.58, 128.26, 127.88, 126.59, 125.25, 124.77, 123.44, 122.69, 120.84, 118.86, 114.25, 109.91, 107.24, 103.42, 83.01.

從以上的表征結果可知，三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結構式為：

將本試驗制備的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針進行光譜性能測試，步驟如下：

試驗2：本試驗與試驗1不同的是試驗1的步驟四用以下的操作代替：按照1 : 1 ~ 4的物質(zhì)的量的比稱取0.65 g中間體化合物和0.62~2.5 g中間體化合物，加入到100 ml三口瓶中，同時加入20~30 mL的40~50%的硫酸溶液作為溶劑，常溫攪拌反應2~7小時，反應結束后，向反應體系中加入水淬滅反應，并置于200 mL的燒杯中，用10~30％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8~10，抽濾，濾餅用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結晶，收集固體，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。本試驗三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結構式為：

產(chǎn)率為50%。

試驗3：本試驗與試驗1不同的是試驗1的步驟4用以下的操作代替：按照1~3 : 1的物質(zhì)的量的比稱取0.65~1.9 g中間體化合物和0.62 g中間體化合物，加入到100 ml三口瓶中，同時加入15~50 mL的甲醇作為溶劑，常溫攪拌反應5~10小時，停止反應，旋出甲醇，乙酸乙酯重結晶，收集固體，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。本試驗得到的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針結構為：

產(chǎn)率為75%。

試驗4：本試驗與試驗1不同的是試驗1的步驟四用以下的操作代替：按照2~6 : 1的摩爾比稱取1.3~3.8 g中間體化合物和0.62 g中間體化合物，加入到100 ml三口瓶中，同時加入15~55 mL的37%的濃鹽酸作為溶劑，25~30℃下反應5小時，停止反應，加入水淬滅，并置于200 mL的燒杯中，用5~30％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7~9，抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結晶，收集固體，得到三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針。本試驗得到的三羥基咪唑-熒光素pH熒光探針的結構式為：

產(chǎn)率為40%。