本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種乙型肝炎病毒載體，具體涉及一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(HBV)是一種以逆轉(zhuǎn)錄方式復(fù)制的DNA病毒，其基因組結(jié)構(gòu)緊湊，長度只有3.2kb。據(jù)WHO估計(jì)，全球有2.4億人慢性感染HBV，HBV是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等終末肝病的主要致病因素。當(dāng)前正式批準(zhǔn)用于臨床的藥物包括干擾素(IFN)和核苷(酸)類似物(NAs)，但I(xiàn)FN治療常常受限于藥物不良反應(yīng)，NAs類藥物往往需要患者終生服藥，這是由于宿主細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)存在共價(jià)閉合環(huán)狀(ccc)DNA。以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組RNA(pgRNA)以及幾種亞基因組RNA，NAs可以有效的抑制pgRNA的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，進(jìn)而阻斷新病毒的產(chǎn)生，但并不能影響亞基因組RNA產(chǎn)生多種病毒抗原，而研究發(fā)現(xiàn)大量產(chǎn)生的病毒抗原會(huì)影響獲得性免疫應(yīng)答，因此不能減少病毒抗原成為NAs治療的一個(gè)缺憾。

RNA干擾(RNAi)是一種強(qiáng)有力的基因沉默技術(shù)，能夠抑制許多種病毒的復(fù)制。RNAi對HBV復(fù)制及基因表達(dá)的抑制效應(yīng)尤其明顯，因?yàn)镠BV的復(fù)制直接依賴于pgRNA，而且HBV的多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共用3’端的重疊序列，所以只需一個(gè)RNAi效應(yīng)子就可以靶向抑制病毒的多條RNA。然而，抗HBV的RNAi療法走向臨床還面臨諸多嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，其中包括脫靶效應(yīng)和刺激產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)，盡管近年在siRNA非病毒載體的化學(xué)穩(wěn)定性和遞送的器官靶向性方面取得了長足的進(jìn)步，但在徹底清除cccDNA池或者說達(dá)到免疫控制之前，合成的siRNA仍需要多次重復(fù)給藥。載體表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shRNA)也面臨如何靶向性遞送到肝臟并且到達(dá)所有肝細(xì)胞的問題，采用病毒載體可以實(shí)現(xiàn)高效的遞送，例如腺病毒(Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)以及慢病毒，然而，非整合病毒載體只能短暫的表達(dá)shRNA，也需要重復(fù)給藥，這可能要受到抗病毒免疫應(yīng)答的影響，對于整合病毒載體來說，則有插入突變、異常拼接等危險(xiǎn)。

如果把HBV作為遞送shRNA的載體，以一種在特定條件下才具有復(fù)制能力的工作方式，則有希望克服前述大部分的難題。像自發(fā)產(chǎn)生的復(fù)制缺損型HBV病毒顆粒一樣，HBV載體作為真正的HBV具有肝組織靶向性，經(jīng)過設(shè)計(jì)，在居住病毒反式互補(bǔ)作用下可以產(chǎn)生新的載體顆粒并播散，并且當(dāng)野生型(wild-type，wt)HBV消失后載體的播散即停止。但將HBV改造為載體要克服幾個(gè)重要的難題，首先是HBV的基因組結(jié)構(gòu)非常緊湊，每一個(gè)核苷酸都是某個(gè)開放讀碼框(open reading frame，ORF)的編碼核苷酸，并且超過半數(shù)的核苷酸處于兩個(gè)ORF內(nèi)；而且，所有的調(diào)節(jié)原件諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及眾多的復(fù)制順式作用元件，都與ORF重疊，因此，即使是所需的反式互補(bǔ)因子全部存在的情況下，不恰當(dāng)?shù)幕蛐蛄芯庉嬕埠苋菀讓?dǎo)致載體的復(fù)制能力受損。第二，所遞送的shRNA必須有效地靶向HBV，而且shRNA能達(dá)到產(chǎn)生設(shè)計(jì)沉默效應(yīng)水平所需要的數(shù)量，還要把脫靶效應(yīng)降至最小。第三，載體產(chǎn)生的shRNA不能靶向載體自身。至少，用HBV載體重復(fù)感染已經(jīng)感染HBV的細(xì)胞看上去無效，但在NAs治療時(shí)，野生型HBV最終被耐NA變異病毒取代，這種現(xiàn)象顯示重復(fù)感染的確發(fā)生了，而且，在土撥鼠肝炎病毒模型中直接顯示了重復(fù)感染的現(xiàn)象。

因此，研究一種HBV-shRNA雙表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用，采用以野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093為載體進(jìn)行基因修飾，構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1shG-1715U6shG，抑制hrGFP的表達(dá)；構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8，抑制HBV的表達(dá)與復(fù)制。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體，以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093為載體進(jìn)行基因修飾，構(gòu)建HBV-shRNA雙表達(dá)載體：首先，通過點(diǎn)突變，在基因組各蛋白起始密碼ATG后添加終止密碼；其次，將C基因區(qū)的203-407位和S基因區(qū)的1715-1961位的序列刪除；最后，在C基因區(qū)的203-407位之間插入H1-shRNA表達(dá)框；在S基因區(qū)的1715-1961位之間插入U(xiǎn)6-shRNA表達(dá)框，構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體；

其中，所述的H1-shRNA表達(dá)框包括H1啟動(dòng)子、shRNA序列和終止信號(hào)T6；

所述的U6-shRNA表達(dá)框包括U6啟動(dòng)子、shRNA序列和終止信號(hào)T6；

所述的H1啟動(dòng)子和U6啟動(dòng)子的長度分別為103和122bp。

作為本發(fā)明的一種限定，所述的H1-shRNA表達(dá)框的序列為：

AAGAATATTT GCATGTCGCT ATGTGTTCTG GGAAATCACC ATAAACGTGA AATGTCTTTG

GATTTGGGAA TCTTATAAGT TCTGTATGAG ACCACTCGGG CCC-莖環(huán)狀靶序列-TTTTTTCCAA AAGCTT；

所述的U6-shRNA表達(dá)框的序列為：

ATATGCAAAT ATGAAGGAAT CATGGGAAAT AGGATCCCAA AATGGACTAT CATATGCTTA

CCGTAACTTG AAAGTATTTC GATTTCTTGG CTTTATATAT CTTGTGGAAA GGACGAGGGCCC-莖環(huán)狀靶序列-TTTTTTCCAAA AGCTT。

作為本發(fā)明的另一種限定，所述的shRNA序列為包括正義鏈-環(huán)-反義鏈的發(fā)卡狀RNA結(jié)構(gòu)。

作為上述限定的進(jìn)一步限定，所述的shRNA序列為shG、sh6或sh8中的一種，其中，shG為靶向人化的綠色熒光蛋白，即hrGFP；sh6或sh8為HBV RNA。

作為上述限定的更進(jìn)一步限定，所述的sh6和sh8的靶向位分別位于S基因區(qū)內(nèi)的1698-1716位和1953-1971位。

作為上述限定的另一種更進(jìn)一步限定，所述的sh6和sh8為除了HBx mRNA以外的所有HBV RNA。

本發(fā)明還提供了制備上述雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體的方法，它按照以下步驟順序進(jìn)行：

1)在pCH-9/3093質(zhì)粒上引入突變點(diǎn)，以終止各基因翻譯蛋白質(zhì)，形成質(zhì)粒pCH-9/3093M6；

2)在HBV核心蛋白區(qū)插入含有H1啟動(dòng)子的序列，構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-203H1；

3)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達(dá)H1-shG的載體pCH-M6-203H1shG；

4)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達(dá)H1-sh6的載體pCH-M6-203H1sh6；

5)在S區(qū)插入U(xiǎn)6-shRNA表達(dá)盒，shRNA靶向hrGFP，以構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-1715U6shG；

6)構(gòu)建在S區(qū)表達(dá)U6-sh8的載體pCH-M6-1715U6sh8；

7)構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1shG-1715U6shG，抑制hrGFP的表達(dá)；

8)構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8，抑制HBV的表達(dá)與復(fù)制。

作為本發(fā)明的一種限定，其制備方法的具體表現(xiàn)形式為：

1)在pCH-9/3093質(zhì)粒上引入突變點(diǎn)，突變點(diǎn)包括：核心區(qū)-G28 T、聚合酶區(qū)-T444A、preS1區(qū)-C954T、preS2區(qū)-C1275T、S區(qū)-C1482T以及X區(qū)-C2677T，以點(diǎn)突變技術(shù)引入突變點(diǎn)，其中，所應(yīng)用的主引物分別為：

核心區(qū)-G28T：5’-CCCTTATAAAGAATTTtGAGCTACTG；

聚合酶區(qū)-T444A：5’-ACACTTCCGGAGACTACTGTaGTTAGAC；

preS1區(qū)-C954T：5’-AACAAGATCTACAGCATGGGGtAGAATC；

preS2區(qū)-C1275T：3’-CAGGCCATGtAGTGGAATTCCA；

S區(qū)-C1482T：5’-ATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTAtAGGCGGGG；

X區(qū)-C2677T：3’-TGCTGCtAACTGGATCCTGC；

以終止各基因翻譯蛋白質(zhì)，形成質(zhì)粒pCH-9/3093M6；經(jīng)序列測定均正確；

2)在HBV核心蛋白區(qū)插入含有H1啟動(dòng)子的序列，構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-203H1：

在HBV核心蛋白203-407之間插入如下序列：TAAGAATATT TGCATGTCGC TATGTGTTCT GGGAAATCAC CATAAACGTG AAATGTCTTT GGATTTGGGA ATCTTATAAG TTCTGTATGA GACCACTCGG GCCCGATGGA AGCTTGTT；

利用引物5’-CAATTGTCGACACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTA和5’-TCTTA

AGAGTCATTAGTTCCCC，以經(jīng)過了核心區(qū)-G28T突變的pCH-9/3093M6為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳獲得PCR片段1；

利用引物5’-GGGGAACTAATGACTCT TAAGAATATT TGCATGTCGC TATGTGTTCT GGGAAATCAC CATAAACGTG AAATGTCTTT GGATTTGGGAATCTTA和

5’-AGTCTCCGGAAGTGTTGATAGGATAAGGGGCATAACAAGCTTCGATCGGGCCCGAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCC AA，以H1啟動(dòng)子為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳獲得PCR片段2；

再以片段1和片段2的混合物為模板，利用引物5’-CAATTGTCGACACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTA和

5’-AGTCTCCGGAAGTGTTGATAGGATAAGGGGCATAACAAGCTTCGATCGGGCCCGAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAA進(jìn)行擴(kuò)增PCR片段3，經(jīng)純化后插入到pCH-9/3093M6質(zhì)粒的Sall-BspE I位點(diǎn)之間，制得質(zhì)粒pCH-M6-203H1；

3)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達(dá)H1-shG的載體pCH-M6-203H1shG

具體方式為將上述質(zhì)粒pCH-M6-203H1，用ApaI和HindIII酶切，插入并連接如下兩條寡核苷酸退火后的小雙鏈DNA序列，以構(gòu)建表達(dá)靶向hrGFP的小干擾RNA的載體；

hrG(+)：5’CGTTCTACAGCTGCCACATGTTCAAGAGACATGTGGCAGCTGTAGAACTTTTTTCCAAA

hrG(-)：5’AGCTTTTGGAAAAAAGTTCTACAGCTGCCACATGTCTCTTGAACATGTGGCAGCTGTAGAACGGGCC

插入小干擾RNA時(shí)，最終制得載體pCH-M6-203H1shG；

4)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達(dá)H1-sh6的載體pCH-M6-203H1sh6：

將載體pCH-M6-203H1，用ApaI和HindIII酶切，插入并連接如下兩條寡核苷酸退火后的小雙鏈DNA序列，最終制得載體pCH-M6-203H1sh6；

sh6(+)：5’-CAGAAGATGAGGCATAGCAGGACAAGAGACTGCTATGCCTCATCTTCTTTTTTTCCAAA

sh6(-)：5’-AGCTTTTGGAAAAAAAGAAGATGAGGCATAGCAGTCTCTTGTCCTGCTATGCCTCATCTTCTGGGCC；

5)在S區(qū)插入插入U(xiǎn)6-shRNA表達(dá)盒，shRNA靶向hrGFP，以構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-1715U6shG：

在pCH-9/3093-M6質(zhì)粒的1586位MscI至1962位SpeI之間酶切，插入如下一段合成的DNA片段，其中包含了sh6和sh8位點(diǎn)的多個(gè)突變，含有U6啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)表達(dá)靶向shG的小干擾RNA，連接后不再被SpeI酶切，序列如下所示：

CCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCAGCAATGCCCCACTTACTAGAGACCTAGTAGTCAGTTCTTAAGATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGATCCCAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAGGGCCCGTTCTACAGCTGCCACATGTTCAAGAGACATGTGGCAGCTGTAGAACTTTTTTCCAAAAGCTTATCGATACCGTCG

6)構(gòu)建在S區(qū)表達(dá)U6-sh8的載體pCH-M6-1715U6sh8：

在質(zhì)粒pCH-M6-1715U6shG的基礎(chǔ)上，用ApaI和HindIII酶切，插入并連接如下兩條寡核苷酸退火后的小雙鏈DNA序列，以構(gòu)建表達(dá)靶向sh8的小干擾RNA載體；

Sh8(+)：CATGGCACTAGTAAACTGAGCCCAAGAGACTCAGTTTACTAGTGCCATTTTTTTCCAAA

Sh8(-)AGCTTTTGGAAAAAAATGGCACTAGTAAACTGAGTCTCTTGGGCTCAGTTTACTAGTGCCATGGGCC

7)構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1shG-1715U6shG，抑制hrGFP的表達(dá)：

pCH-M6-203H1shG和pCH-M6-1715U6shG均用SalI和EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，前者取小片段，后者取大片段，按1∶43比例混合，加入T4 DNA連接酶混勻16℃水浴連接過夜；將20μl連接產(chǎn)物加入100μl TOP10中混勻，冰浴30min，42℃水浴熱休克90s，迅速冰浴冷卻5min，將混合物平均涂布于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，37℃平放2h后將平板倒置繼續(xù)培養(yǎng)14h，次日可見瓊脂平板上可見多個(gè)針眼大小的單菌落，從中挑取6個(gè)大小相近的單菌落分別接種于5mL濃度為100mg/ml生物含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，180rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜，然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取并獲得載體質(zhì)粒；

8)構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8，抑制HBV的表達(dá)與復(fù)制；

pCH-M6-203H1sh6和pCH-M6-1715U6sh8均用SalI和EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，前者取小片段，后者取大片段，連接酶連接。

本發(fā)明還提供了上述雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體的應(yīng)用，其應(yīng)用于與病毒載體構(gòu)建嵌合載體。

作為本發(fā)明的一種限定，所述的病毒載體為腺病毒、腺相關(guān)病毒或慢病毒。

由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所取得的技術(shù)進(jìn)步在于：

本發(fā)明采用以野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093為載體進(jìn)行基因修飾，構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1shG-1715U6shG，抑制hrGFP的表達(dá)；構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8，抑制HBV的表達(dá)與復(fù)制。

與現(xiàn)有技術(shù)相比所取得的技術(shù)進(jìn)步如下：

1.與化學(xué)合成的siRNA相比

因?yàn)椴荒軓氐浊宄齝ccDNA池，化學(xué)合成的siRNA需要多次重復(fù)給藥。本發(fā)明所述的攜帶雙表達(dá)shRNA表達(dá)框的復(fù)制缺損型HBV載體在野生型HBV存在時(shí)，可成功進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生具有囊膜的完整子代重組病毒顆粒，從而持續(xù)不斷的發(fā)揮抗HBV作用。

2.與其他表達(dá)shRNA的病毒載體相比

腺病毒、腺相關(guān)病毒以及慢病毒載體尚未解決肝組織靶向性的問題，并且不能將shRNA遞送到所有肝細(xì)胞。本發(fā)明所述的HBV載體天然具有嗜肝性，在野生型HBV輔助下，可產(chǎn)生具有感染性的完整子代重組病毒顆粒，可以播散至所有肝細(xì)胞。

3.與復(fù)制型HBV載體相比

復(fù)制型HBV載體可以長期表達(dá)，帶來脫靶效應(yīng)等無法預(yù)料的不良反應(yīng)。本發(fā)明所述的復(fù)制缺損型HBV載體自身不具備復(fù)制能力，但在野生型HBV反式互補(bǔ)作用下可以產(chǎn)生新的載體顆粒并播散，并且當(dāng)野生型HBV消失后載體的播散即停止。

4.與單shRNA表達(dá)框載體相比

針對同一mRNA，采用雙shRNA表達(dá)框靶向mRNA鏈上的不同靶位，可以顯著提高沉默效應(yīng)，并且減少目標(biāo)病毒的逃逸突變。

本發(fā)明適用于雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體及其制備。

本發(fā)明下面將結(jié)合說明書附圖與具體實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1雙表達(dá)shRNA的HBV載體及shRNA表達(dá)框的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中Southern blotting檢測HBV-shRNA復(fù)制水平示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中HBV-shG對細(xì)胞表達(dá)GFP的抑制效應(yīng)示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中重組HBV顆粒感染HepG2-NTCP細(xì)胞系后HBeAg的表達(dá)示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中重組HBV顆粒感染HepG2-NTCP細(xì)胞系后流式細(xì)胞術(shù)分析HBV核心蛋白的表達(dá)示意圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中HBV-shRNA載體抑制野生型HBV復(fù)制的示意圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中抗HBV-shRNA載體抑制野生型HBV基因的表達(dá)的示意圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例3中檢測細(xì)胞外載體衍生的被膜病毒顆粒中的DNA的示意圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例4中非轉(zhuǎn)基因小鼠體重的時(shí)間變化示意圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例4中非轉(zhuǎn)基因小鼠ALT的時(shí)間變化示意圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例4中血清HBsAg水平的時(shí)間變化示意圖；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例4中肝組織HBV核心蛋白的表達(dá)示意圖；

圖13為本發(fā)明實(shí)施例4中肝組織中病毒總RNA示意圖；

圖14為本發(fā)明實(shí)施例4中血清中HBV DNA的時(shí)間變化示意圖；

圖15為本發(fā)明實(shí)施例4中HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中檢測到載體衍生的HBV DNA結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用

一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體，以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093為載體進(jìn)行基因修飾，構(gòu)建HBV-shRNA雙表達(dá)載體：首先，通過點(diǎn)突變，在基因組各蛋白起始密碼ATG后添加終止密碼；其次，將C基因區(qū)的203-407位和S基因區(qū)的1715-1961位的序列刪除；最后，在C基因區(qū)的203-407位之間插入H1-shRNA表達(dá)框；在S基因區(qū)的1715-1961位之間插入U(xiǎn)6-shRNA表達(dá)框，構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體，用于表達(dá)靶向hrGFP的小干擾RNA，其序列如下所示：

其中，HBV核心蛋白起始密碼子ATG：1

終止突變：G28T對應(yīng)野生型HBV核心蛋白

H1啟動(dòng)子：205-307

克隆位點(diǎn)：ApaI 302-307

轉(zhuǎn)錄起始：308

發(fā)夾狀序列(來自hrGFP序列)：308-354

聚合酶III終止密碼：355-360

克隆位點(diǎn)：HindIII 365-370

終止突變：T411A對應(yīng)野生型HBV P蛋白T444A

終止突變：C921T對應(yīng)野生型HBV preS1蛋白C954T

終止突變：C1242T對應(yīng)野生型HBV prS2蛋白C1275T

終止突變：C1449T對應(yīng)野生型HBV S蛋白C1482T

U6啟動(dòng)子：1709-1830

轉(zhuǎn)錄起始：1831

發(fā)夾狀序列(來自hrGFP序列)：1831-1877

聚合酶III終止密碼：1878-1883

克隆位點(diǎn)：HindIII 1888-1893

終止突變：C2622T對應(yīng)野生型HBV X蛋白(C2677T)

CMV啟動(dòng)子：5608-6187

載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8的序列為：

其中，HBV核心蛋白起始密碼子ATG：1

終止突變：G28T對應(yīng)野生型HBV核心蛋白

H1啟動(dòng)子：205-307

克隆位點(diǎn)：ApaI 302-307

轉(zhuǎn)錄起始：308

發(fā)夾狀序列(來自HBV nt 1698-1716序列)：308-354

聚合酶III終止密碼：355-360

克隆位點(diǎn)：HindIII 365-370

終止突變：T411A對應(yīng)野生型HBV P蛋白T444A

終止突變：C921T對應(yīng)野生型HBV preS1蛋白C954T

終止突變：C1242T對應(yīng)野生型HBV prS2蛋白C1275T

終止突變：C1449T對應(yīng)野生型HBV S蛋白C1482T

U6啟動(dòng)子：1709-1830

轉(zhuǎn)錄起始：1831

發(fā)夾狀序列(來自HBV nt 1953-1971)：1831-1877

聚合酶III終止密碼：1878-1883

克隆位點(diǎn)：HindIII 1888-1893

終止突變：C2622T對應(yīng)野生型HBV X蛋白(C2677T)

CMV啟動(dòng)子：5608-6187

其中，所述的H1-shRNA表達(dá)框包括H1啟動(dòng)子、shRNA序列和終止信號(hào)T6；

所述的U6-shRNA表達(dá)框包括U6啟動(dòng)子、shRNA序列和終止信號(hào)T6；

所述的H1啟動(dòng)子和U6啟動(dòng)子的長度分別為103和122bp。

其中，所述的H1-shRNA表達(dá)框的序列為：

AAGAATATTT GCATGTCGCT ATGTGTTCTG GGAAATCACC ATAAACGTGA AATGTCTTTG

GATTTGGGAA TCTTATAAGT TCTGTATGAG ACCACTCGGG CCC-莖環(huán)狀靶序列-TTTTTTCCAAAAGCTT；

所述的U6-shRNA表達(dá)框的序列為：

ATATGCAAAT ATGAAGGAAT CATGGGAAAT AGGATCCCAA AATGGACTAT CATATGCTTA

CCGTAACTTG AAAGTATTTC GATTTCTTGG CTTTATATAT CTTGTGGAAA GGACGAGGGCCC-莖環(huán)狀靶序列-TTTTTTCCAAA AGCTT。

其中，所述的shRNA序列為包括正義鏈-環(huán)-反義鏈的發(fā)卡狀RNA結(jié)構(gòu)，為shG、sh6或sh8中的一種，其中，shG為靶向人化的綠色熒光蛋白，即hrGFP；sh6或sh8為HBV RNA。

所述的sh6和sh8的靶向位分別位于S基因區(qū)內(nèi)的1698-1716位和1953-1971位。

作為上述限定的另一種更進(jìn)一步限定，所述的sh6和sh8為除了HBx mRNA以外的所有HBV RNA。

制備上述雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體的方法，它按照以下步驟順序進(jìn)行：

1)在pCH-9/3093質(zhì)粒上引入突變點(diǎn)，以終止各基因翻譯蛋白質(zhì)，形成質(zhì)粒pCH-9/3093M6；

在pCH-9/3093質(zhì)粒上引入突變點(diǎn)，突變點(diǎn)包括：核心區(qū)-G28T、聚合酶區(qū)-T444A、preS1區(qū)-C954T、preS2區(qū)-C1275T、S區(qū)-C1482T以及X區(qū)-C2677T，以點(diǎn)突變技術(shù)引入突變點(diǎn)，其中，所應(yīng)用的主引物分別為：

核心區(qū)-G28T：5’-CCCTTATAAAGAATTTtGAGCTACTG；

聚合酶區(qū)-T444A：5’-ACACTTCCGGAGACTACTGTaGTTAGAC；

preS1區(qū)-C954T：5’-AACAAGATCTACAGCATGGGGtAGAATC；

preS2區(qū)-C1275T：3’-CAGGCCATGtAGTGGAATTCCA；

S區(qū)-C1482T：5’-ATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTAtAGGCGGGG；

X區(qū)-C2677T：3’-TGCTGCtAACTGGATCCTGC；

以終止各基因翻譯蛋白質(zhì)，形成質(zhì)粒pCH-9/3093M6；經(jīng)序列測定均正確；

2)在HBV核心蛋白區(qū)插入含有H1啟動(dòng)子的序列，構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-203H1：

在HBV核心蛋白203-407之間插入如下序列：TAAGAATATT TGCATGTCGC TATGTGTTCT GGGAAATCAC CATAAACGTG AAATGTCTTT GGATTTGGGA ATCTTATAAG TTCTGTATGA GACCACTCGG GCCCGATGGA AGCTTGTT；

利用引物5’-CAATTGTCGACACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTA和5’-TCTTAAGAGTCATTAGTTCCCC，以經(jīng)過了核心區(qū)-G28T突變的pCH-9/3093M6為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳獲得PCR片段1；

利用引物5’-GGGGAACTAATGACTCT TAAGAATATT TGCATGTCGC TATGTGTTCT GGGAAATCAC CATAAACGTG AAATGTCTTT GGATTTGGGAATCTTA和5’-AGTCTCCGGAAGTGTTGATAGGATAAGGGGCATAACAAGCTTCGATCGGGCCCGAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCC AA，以H1啟動(dòng)子為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳獲得PCR片段2；

再以片段1和片段2的混合物為模板，利用引物

5’-CAATTGTCGACACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTA和

5’-AGTCTCCGGAAGTGTTGATAGGATAAGGGGCATAACAAGCTTCGATCGGGCCCGAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAA進(jìn)行擴(kuò)增PCR片段3，經(jīng)純化后插入到pCH-9/3093M6質(zhì)粒的SalI-BspE I位點(diǎn)之間，制得質(zhì)粒pCH-M6-203H1；

3)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達(dá)H1-shG的載體pCH-M6-203H1shG

具體方式為將上述質(zhì)粒pCH-M6-203H1，用ApaI和HindIII酶切，插入并連接如下兩條寡核苷酸退火后的小雙鏈DNA序列，以構(gòu)建表達(dá)靶向hrGFP的小干擾RNA的載體；

hrG(+)：5’CGTTCTACAGCTGCCACATGTTCAAGAGACATGTGGCAGCTGTAGAACTTTTTTCCAAA

hrG(-)：5’AGCTTTTGGAAAAAAGTTCTACAGCTGCCACATGTCTCTTGAACATGTGGCAGCTGTAGAACGGGCC

插入小干擾RNA時(shí)，最終制得載體pCH-M6-203H1shG；

4)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達(dá)H1-sh6的載體pCH-M6-203H1sh6：

將載體pCH-M6-203H1，用ApaI和HindIII酶切，插入并連接如下兩條寡核苷酸退火后的小雙鏈DNA序列，最終制得載體pCH-M6-203H1sh6；

sh6(+)：5’-CAGAAGATGAGGCATAGCAGGACAAGAGACTGCTATGCCTCATCTTCTTTTTTTCCAAA

sh6(-)：5’-AGCTTTTGGAAAAAAAGAAGATGAGGCATAGCAGTCTCTTGTCCTGCTATGCCTCATCTTCTGGGCC；

5)在S區(qū)插入插入U(xiǎn)6-shRNA表達(dá)盒，shRNA靶向hrGFP，以構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-1715U6shG：

在pCH-9/3093-M6質(zhì)粒的1586位MscI至1962位SpeI之間酶切，插入如下一段合成的DNA片段，其中包含了sh6和sh8位點(diǎn)的多個(gè)突變，含有U6啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)表達(dá)靶向shG的小干擾RNA，連接后不再被SpeI酶切，序列如下所示：

CCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCAGCAATGCCCCACTTACTAGAGACCTAGTAGTCAGTTCTTAAGATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGATCCCAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAGGGCCCGTTCTACAGCTGCCACATGTTCAAGAGACATGTGGCAGCTGTAGAACTTTTTTCCAAAAGCTTATCGATACCGTCG

6)構(gòu)建在S區(qū)表達(dá)U6-sh8的載體pCH-M6-1715U6sh8：

在質(zhì)粒pCH-M6-1715U6shG的基礎(chǔ)上，用ApaI和HindIII酶切，插入并連接如下兩條寡核苷酸退火后的小雙鏈DNA序列，以構(gòu)建表達(dá)靶向sh8的小干擾RNA載體；

Sh8(+)：CATGGCACTAGTAAACTGAGCCCAAGAGACTCAGTTTACTAGTGCCATTTTTTTTCCAAA

Sh8(-)：AGCTTTTGGAAAAAAATGGCACTAGTAAACTGAGTCTCTTGGGCTCAGTTTACTAGTGCCATGGGCC

7)構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1shG-1715U6shG，抑制hrGFP的表達(dá)：

pCH-M6-203H1shG和pCH-M6-1715U6shG均用SalI和EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，前者取小片段，后者取大片段，按1∶43比例混合，加入T4 DNA連接酶混勻16℃水浴連接過夜；將20μl連接產(chǎn)物加入100μl TOP10中混勻，冰浴30min，42℃水浴熱休克90s，迅速冰浴冷卻5min，將混合物平均涂布于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，37℃平放2h后將平板倒置繼續(xù)培養(yǎng)14h，次日可見瓊脂平板上可見多個(gè)針眼大小的單菌落，從中挑取6個(gè)大小相近的單菌落分別接種于5mL濃度為100mg/ml生物含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，180rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜，然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取并獲得載體質(zhì)粒；

8)構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8，抑制HBV的表達(dá)與復(fù)制；

pCH-M6-203H1sh6和pCH-M6-1715U6sh8均用SalI和EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，前者取小片段，后者取大片段，連接酶連接。

上述雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體的應(yīng)用，其應(yīng)用于與病毒載體構(gòu)建嵌合載體，其中，病毒載體為腺病毒、腺相關(guān)病毒或慢病毒。

實(shí)施例2 復(fù)制缺損型HBV載體抑制肝癌細(xì)胞系表達(dá)hrGFP

雙表達(dá)shG的復(fù)制缺損型HBV載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，；此外其缺乏自我復(fù)制能力，只有在居住病毒幫助下可以產(chǎn)生新的載體顆粒并播散，并且當(dāng)野生型HBV消失后載體的播散即停止。

1.復(fù)制缺損型HBV載體雙表達(dá)shG抑制肝癌細(xì)胞表達(dá)hrGFP

1.1.細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌細(xì)胞系HepG2；

1.2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞：分為3組，轉(zhuǎn)染試劑為Fugene6 HD(Roche)；

第一組細(xì)胞：載體pCH-203H1-shG、pCH-203U6-shG、pCH-1715U6-shG、pCH-203H1-shG-1715-U6-shG與pCH-9/3142以1ug∶1ug比例共轉(zhuǎn)染雙份細(xì)胞，以pCH-9/3093為對照；

第二組細(xì)胞：載體pCH-203H1-shG、pCH-1715U6-shG、pCH-203H1-shG-1715-U6-shG分別與pCH-9/3142(+)或pcDNA3.1(-)以1ug∶1ug比例共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染；

第三組細(xì)胞：表達(dá)hrGFP的質(zhì)粒plRES-hrGFP-1質(zhì)粒與pCH-203H1-shG、pCH-1715U6-shG、pCH-203H1-shG-1715-U6-shG、pBSII-H1-shG、pBSII-U6-shG分別以1∶2和1∶4的摩爾比共轉(zhuǎn)染，與pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染作為無shRNA的對照；

1.3轉(zhuǎn)染后96h，提取第一、第二組細(xì)胞胞漿中核殼體DNA，并用α-32P標(biāo)記的HBV特異的探針Southern blotting檢測載體的復(fù)制情況。結(jié)果顯示：在輔助質(zhì)粒pCH-9/3142存在的情況下，1715U6-shG載體產(chǎn)生高水平的總HBV DNA，RC-DNA的比例也最高；與S區(qū)插入的載體相比，在C區(qū)攜帶單shRNA表達(dá)框的兩個(gè)載體都產(chǎn)生大約兩倍的總DNA，但RC-DNA比例較低；雙重shRNA載體與C基因區(qū)的單shRNA載體相比，產(chǎn)生的復(fù)制產(chǎn)物數(shù)量中等，但產(chǎn)生RC-DNA的效率更高，如圖2A所示，在不與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，所有shRNA載體均未產(chǎn)生任何可檢測得到的復(fù)制中間體如圖2B所示，證明HBV載體嚴(yán)格地依賴輔助質(zhì)粒。

1.4轉(zhuǎn)染后72小時(shí)用熒光顯微鏡觀察第三組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照，以每個(gè)培養(yǎng)孔為單位Glomax發(fā)光檢測儀(Promega)定量熒光強(qiáng)度，將pcDNA3.1對照組熒光強(qiáng)度設(shè)為100％，標(biāo)準(zhǔn)化載體組各孔信號(hào)。各shG載體均顯著抑制GFP熒光的表達(dá)，并隨載體量的增加抑制效應(yīng)增強(qiáng)(p＜0.001)，其中，pCH-203H1-shG-1715-U6-shG所產(chǎn)生的沉默效應(yīng)最強(qiáng)(＞80％)，與pCH-203H1-shG相比有顯著差異，陽性對照組pBSII-U6載體沉默效率更高(～90％)，但與pCH-203H1-shG-1715-U6-shG組沒有顯著差異，如圖3所示。

1.5大量制備重組HBV顆粒，感染HepG2-NTCP細(xì)胞系，利用X蛋白決定HBV基因表達(dá)的原理，本組實(shí)驗(yàn)分如下5組：①無病毒組；②細(xì)胞系來源的野生型HBV顆粒；③質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞產(chǎn)生的HBV顆粒；④表達(dá)X蛋白的重組HBV載體顆粒；⑤不表達(dá)X蛋白的重組HBV載體顆粒。分別于第0、1、4、7和8天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA定量檢測HBeAg，可觀察到在表達(dá)X蛋白的重組HBV載體顆粒組HBeAg的表達(dá)逐步升高，而不表達(dá)X蛋白的重組HBV載體顆粒組無變化，如圖4所示。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)觀察核心蛋白陽性細(xì)胞，證實(shí)了在表達(dá)X蛋白的重組HBV載體顆粒組HBV核心蛋白陽性細(xì)胞達(dá)到9.97％，而在不表達(dá)X蛋白的重組HBV載體顆粒組僅為2.03％，如圖5所示，證明重組HBV顆粒具有感染性。

實(shí)施例3 復(fù)制缺損型HBV載體雙表達(dá)抗HBV shRNA抑制肝癌細(xì)胞系中HBV復(fù)制和表達(dá)

雙表達(dá)抗HBV shRNA的HBV載體和pCH-9/3093共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，觀察shRNA載體對野生型HBV復(fù)制和表達(dá)的影響，包括：用HBV全序列探針Southern blotting檢測細(xì)胞質(zhì)核殼體DNA，再用被置換的C或S基因片段序列或插入的H1或U6啟動(dòng)子序列特異的探針，分別重新進(jìn)行Southern blotting，并對條帶信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析；Western blotting檢測細(xì)胞裂解液中HBsAg、HBcAg、甲胎蛋白、白蛋白及微管蛋白；并以跨shRNA表達(dá)框的引物PCR檢測細(xì)胞外具有囊膜的病毒顆粒中HBV DNA，證明載體在野生型HBV存在時(shí)的復(fù)制能力。

1.HepG2細(xì)胞按前述方法培養(yǎng)；

2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞：雙份細(xì)胞用恒定質(zhì)量(0.4ug)的野生型HBV載體pCH-9/3093分別與抗HBV shRNA載體共轉(zhuǎn)染，包括：pCH-203H1-sh6、pCH-1715U6-sh8和pCH-203H1-sh6-1715-U6-sh8，所用載體質(zhì)量遞增為0.2ug、0.4ug、0.8ug、1.6ug；空白對照組只轉(zhuǎn)染0.4ug的pCH-9/3093，以不攜帶抗HBV成份的pCH-203H1-shG-1715U6-shG與pCH-9/3093共轉(zhuǎn)染作為對照，通過添加空質(zhì)粒pcDNA3.1來控制各組加入質(zhì)粒的總質(zhì)量相等。

3.Southern blotting檢測野生型HBV和載體產(chǎn)的DNA

以完整HBV基因組序列為探針(可以同時(shí)檢測野生型HBV和載體衍生的DNA)進(jìn)行Southern blotting檢測，顯示抗HBV shRNA載體抑制了復(fù)制型DNA中間體的產(chǎn)生，并具有劑量依賴效應(yīng)。以204-406序列探針，如圖6的泳道1-4所示，對C基因中插入shRNA的載體，以1716-1960序列探針對其他載體，如圖6的泳道5-17所示，即各個(gè)載體缺失區(qū)域的HBV序列為探針(僅能檢測野生型HBV DNA)重新進(jìn)行Southern blotting檢測，與用HBV全序列探針時(shí)相比，DNA復(fù)制中間體減少更顯著，具有劑量依賴效應(yīng)。

4.Western blot檢測HBV表面蛋白、核心蛋白、甲胎蛋白、白蛋白和微管蛋白的表達(dá)

用免疫印跡法可以檢測抗HBV shRNA載體抑制野生型HBV蛋白表達(dá)，檢測細(xì)胞裂解液中的HBV表面蛋白、核心蛋白以及甲胎蛋白、白蛋白和微管蛋白?？笻BV shRNA載體治療組的HBsAg信號(hào)顯著地降低，其中C基因區(qū)單shRNA載體，如圖7A中的泳道2所示，和雙重shRNA載體，如圖7A中的泳道10所示，的抑制效應(yīng)約為S基因區(qū)shRNA載體的2倍，如圖7A中的泳道7所示，對照組抗hrGFP載體只在最高載體劑量時(shí)方可抑制HBsAg的表達(dá)，如圖7A中的泳道17所示。所有三種抗HBV shRNA載體均導(dǎo)致HbcAb的水平降低，降低的程度與載體量正相關(guān)，各個(gè)載體組間差異不大，如圖7A所示，但與對照組抗hrGFP載體相比有顯著差別。用等量的細(xì)胞裂解物檢測細(xì)胞的甲胎蛋白、白蛋白和微管蛋白，如圖7B所示，然而與對照組相比未檢測到任何差異，表明載體本身對細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性。

5.PCR檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌型顆粒的DNA片段

載體病毒再感染其它細(xì)胞還需要在載體基因組包裝后，再進(jìn)一步添加囊膜并分泌到細(xì)胞外，因此，用提取的細(xì)胞外病毒顆粒的DNA作為模板進(jìn)行PCR，使用的HBV引物跨過插入的shRNA表達(dá)框，由于與HBV序列相比其序列稍短，使得到的PCR產(chǎn)物較小，例如跨越C基因區(qū)的引物產(chǎn)生片段251bp，而原片段為284bp，跨越S基因區(qū)的引物產(chǎn)生片段556bp，而原片段為589bp，如圖8A所示。為了確保只有完整病毒顆粒產(chǎn)生的DNA被擴(kuò)增，細(xì)胞外病毒顆粒首先用鏈霉蛋白酶加DNase及微球菌核酸酶處理，這樣可以有效消化掉游離質(zhì)粒DNA和常見的從HBV感染細(xì)胞中泄露出的無包膜(裸)病毒顆粒，而有包膜的病毒顆粒不被消化。

與對照組如圖8A中的泳道13比較，各抗HBV載體治療組中載體特異的較短的PCR產(chǎn)物的比例有所升高，并與載體量正相關(guān)；而在抗hrGFP載體組比較不明顯，因?yàn)榭笻BV shRNA載體可以有效減少野生型pgRNA，在pgRNA衣殼化時(shí)，可以降低野生型和載體所產(chǎn)生pgRNA之間的競爭。PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳溴化乙啶染色，照片，用Image J2x軟件定量分析載體產(chǎn)生條帶亮度占總亮度的比例，圖8B顯示了野生型HBV和載體DNA之間的相對比例。因此載體基因組的確成功地減少了野生型HBV。

實(shí)施例4 復(fù)制缺損型HBV載體雙表達(dá)抗HBV shRNA抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV復(fù)制和表達(dá)

由于小鼠肝細(xì)胞對HBV不易感，我們把HBV載體基因組插入一種復(fù)制缺損型腺病毒載體，即Ad-HBV-H1sh6-U6sh8，這種嵌合載體可以有效的把HBV載體基因組遞送到小鼠肝臟組織。

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組整合有1.3倍的HBV基因組，可以產(chǎn)生病毒抗原和完全病毒顆粒，而且病毒可以長期高水平復(fù)制。給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠注射Ad-HBV嵌合雙表達(dá)shRNA的HBV載體，通過ELISA檢血清HBsAg的水平、免疫組化檢測肝組織HBcAg水平、Southern blotting檢測血清中HBV DNA水平、Northern blotting檢測血清病毒RNA水平評估抗載體的沉默效應(yīng)，用載體特異的引物PCR檢測血循環(huán)中被膜顆粒的DNA，檢測載體在體內(nèi)的自我更新。由于腺病毒載體存在諸如免疫原性較強(qiáng)、用量較大時(shí)有一定的毒性等不良影響，對于Ad-HBV嵌合載體潛在的毒性應(yīng)該有所考慮。我們先給普通BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射較小劑量的嵌合載體顆粒，并觀察小鼠的體重、ALT隨時(shí)間變化曲線。

1.構(gòu)建復(fù)制缺損型Ad-HBV嵌合載體Ad-HBV-H1sh6-U6sh8和Ad-HBV-H1shG-U6shG

復(fù)制缺損型腺病毒載體質(zhì)粒pBHGLoxΔE1，3Cre分別與重組質(zhì)粒pCH-203H1-sh6-1715U6-sh8、pCH-203H1shG-1715U6shG轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。待有較明顯的病毒克隆斑或蝕斑形成后(轉(zhuǎn)染10-12d)，將293細(xì)胞自培養(yǎng)皿內(nèi)刮下，收集培養(yǎng)物于50ml離心管中，800g/min離心10min，收集沉淀用1mlHBS懸浮，于-70℃/37℃水浴中反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，10000g/min離心10分鐘，收集上清即為收獲的病毒液，分別命名為Ad-HBV-H1shG-U6shG和Ad-HBV-H1sh6-U6sh8，加入10％體積甘油，于-80℃凍存?zhèn)溆谩＝?jīng)測序質(zhì)粒序列正確后，進(jìn)行重組嵌合病毒大量擴(kuò)增，氯化銫不連續(xù)密度梯度離心純化。純化的腺病毒用核酸蛋白分析儀測定A260，然后根據(jù)公式病毒顆粒數(shù)＝A260×稀釋倍數(shù)×1.1×1012病毒顆粒數(shù)/ml(VP/mL)算出腺病毒的滴度。重組腺病毒感染293細(xì)胞檢測空斑形成能力。

2.評估復(fù)制缺損型Ad-HBV嵌合載體的毒性

30只普通BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只；對照組經(jīng)尾靜脈注射0.5ml生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈注射2x1011/kg的AdHBV anti-HBV或anti-hrGFP shRNA載體顆粒(粒子濃度約為HEK293細(xì)胞空斑形成單位(PFU)濃度的十分之一，對于20g重小鼠約～0.4x109PFU)，溶于0.5ml生理鹽水。接種后監(jiān)測小鼠體重、并每周檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，至第8周末處死。

Ad載體接種后，小鼠僅在第1周體重增長變緩，如圖9所示，隨后小鼠的生長恢復(fù)正常；在第1周血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)升高，但低于3倍正常值上限，第2周ALT基本恢復(fù)正常，如圖10所示，表明Ad-HBV嵌合載體本身沒有明確的毒性，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以使用相同的劑量。

3.轉(zhuǎn)基因小鼠分組及處理

3.1 30只HBVtg BALB/c小鼠被隨機(jī)分配到三個(gè)組，每組10只；組1注射0.5ml的生理鹽水，組2注射AdHBV-H1shG-U6shG，組3注射AdHBV-H1sh6-U6sh8，每只小鼠4x109病毒顆粒。

3.2標(biāo)本留取

分別在治療后第0、4、8、12、16、20天經(jīng)尾尖活體取血備用；

分別在接種后第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20測量小鼠體重；

接種后第4天，從三個(gè)組中分別取出3只小鼠處死，接種后第12天再處死3只，接種后第20天處死剩余的4只小鼠；分別經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，分離血清；取部分肝組織，0.5×0.5×0.5cm，10％福爾馬林固定，剩余肝組織液氮保存?zhèn)溆茫?/p>

4.ELISA試劑盒(Abbott)檢測小鼠血清中的HBsAg。

HBsAg滴度在生理鹽水對照組穩(wěn)定在7-8x103IU/ml，抗HBV載體治療組小鼠HBsAg滴度顯著降低，如圖11所示，在接種后第20天，與生理鹽水相比降低3-4倍(p＝0.018)。治療組與抗hrGFP組相比，HBsAg滴度差異在第12天最明顯，第16天和第20天的P值分別為p＝0.058和p＝0.094。兩個(gè)對照組之間的HBsAg滴度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異，說明在第3組，腺病毒穿梭載體本身導(dǎo)致的非特異效應(yīng)對HBsAg滴度的影響有限。

5.免疫組織化學(xué)檢測肝內(nèi)HBV核心蛋白的表達(dá)。

接種后第20天所取各組小鼠肝臟，用4％甲醛溶液固定，室溫過夜后石蠟包埋常規(guī)切片，采用核心蛋白特異的單克隆抗體mc312進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察。與兩個(gè)對照組相比，治療組肝臟切片中肝細(xì)胞核核心蛋白染色變?nèi)趸蛳?，表明肝組織中HBV核心蛋白的表達(dá)受到明顯地抑制，如圖12所示。

6.Northern blotting檢測第20天各組小鼠肝內(nèi)HBV RNA

接種后第20天所取各組小鼠肝臟，分別提取總RNA，以全長HBV探針檢測HBV特異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以3-磷酸甘油醛脫氫(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的mRNA作為對照，如圖13A所示，第1和第2對照組中的小鼠顯示pgRNA和shRNA水平只有微小的差異，而治療組小鼠的病毒RNA平均減少～70％，如圖13B所示。

7.qPCR分析小鼠的HBV DNA水平

定量分析各組HBV的病毒滴度評估病毒的復(fù)制情況，采用qPCR方法檢測每毫升血清中HBV DNA。各組取等量血清，用鏈霉蛋白酶加Dnase處理，然后用qPCR檢測，每個(gè)組的所有小鼠的HBV DNA水平用vge/ml表示，獲得均數(shù)±SD；

在生理鹽水對照組，病毒滴度與治療前無差別，仍為～105vge/ml水平；在抗hrGFP載體對照組，病毒滴度有微弱的降低；在抗HBV載體組，病毒滴度穩(wěn)定持續(xù)下降，在接種后第20天降低18-20倍，如圖14所示。表明抗HBV載體對血循環(huán)中HBV DNA的影響非常顯著。

8.PCR檢測小鼠血清中的被膜載體顆粒的DNA

如果復(fù)制缺損的HBV shRNA載體再野生型HBV幫助下具有復(fù)制能力，血清中的完整HBV病毒顆粒中應(yīng)該包括一部分載體衍生的病毒顆粒，因此通過跨連接區(qū)引物擴(kuò)增，PCR方法可檢測到血清中與野生型HBV DNA大小不同的HBV載體衍生DNA的片段，從而分析載體特異的產(chǎn)物的水平。自三個(gè)組中各取3只小鼠，將它們的血清(接種后第20天采集)用鏈蛋白酶加Dnase處理，然后作為DNA模板，所有來自載體治療組動(dòng)物的樣品，均檢測到載體特異的PCR產(chǎn)物，并且抗HBV組與抗hrGFP組相比血清中載體衍生的DNA比例更高，如圖15所示，表明HBV shRNA載體基因組在野生型HBV輔助下成功的產(chǎn)生子代分泌病毒顆粒。

以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，HBVtg小鼠接種嵌合雙重抗HBV shRNA載體后，有效抑制HBV復(fù)制和表達(dá)：與對照組相比，血循環(huán)中的HBV DNA降低了～20倍，血清HBsAg減少3-4倍，核心蛋白陽性的肝細(xì)胞比例下降，肝內(nèi)病毒RNA顯著減少；并且，HBV shRNA載體基因組成功的產(chǎn)生子代分泌病毒顆粒，其抗HBV的活性與第一代Ad-HBV載體相當(dāng)。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述技術(shù)內(nèi)容作為啟示加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作出的簡單修改，等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。