本描述涉及治療具有B型肝炎病毒(HBV)感染或HBV/肝炎δ病毒(HDV)共感染的對(duì)象的方法，其包含給予第一藥學(xué)上可接受的硫代磷酸酯化核酸聚合物制劑和抑制HBV聚合酶的第二藥學(xué)上可接受的核苷/核苷酸類(lèi)似物制劑。

背景技術(shù)：

HBV折磨全世界4億個(gè)體，并導(dǎo)致每年估計(jì)有600,000例因HBV感染引起的并發(fā)癥的死亡。雖然已經(jīng)批準(zhǔn)一些抗病毒治療供使用，但這些治療除在一小部分經(jīng)歷治療的患者以外都無(wú)法引起能夠提供感染的持久控制的治療有效的免疫反應(yīng)。

HBV感染導(dǎo)致產(chǎn)生兩種不同的顆粒：1)感染性HBV病毒本身(或戴恩粒子(Dane particle))，其包括從HBV核心抗原蛋白(HBcAg)組裝且由HBV表面抗原(HBsAg)覆蓋的病毒衣殼，和2)亞病毒顆粒(或SVP)，其是包括脂質(zhì)、膽固醇、膽固醇酯和具有非感染性的中小型形式的HBV表面抗原(HBsAg)的高密度脂蛋白樣顆粒。對(duì)于所產(chǎn)生的每一種病毒顆粒，1,000至10,000個(gè)SVP被釋放到血液中。因此，SVP(和其攜帶的HBsAg蛋白)表示血液中的絕大多數(shù)病毒蛋白。HBV感染的細(xì)胞也分泌稱(chēng)為HBV e-抗原(HBeAg)的前核心蛋白的可溶性蛋白水解產(chǎn)物。

HDV使用HBsAg形成其病毒結(jié)構(gòu)(Taylor，2006，Virology，344：71-76)，且因此，HDV感染可僅在具有伴隨HBV感染的對(duì)象中發(fā)生。雖然無(wú)癥狀HBV攜帶者和慢性HBV相關(guān)的肝病中的HDV共感染的發(fā)病率在具有低HBV感染發(fā)病率的國(guó)家中較低，但其在具有高HBV感染發(fā)病率的國(guó)家中在HBV感染的對(duì)象中是顯著并發(fā)癥且可增加肝病至肝硬化的進(jìn)展速率。在HBV/HDV共感染的對(duì)象中，HBV感染的未滿(mǎn)足的醫(yī)療需求甚至更為緊迫；不存在直接靶向HDV病毒的具體經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)的藥劑，且患者即使對(duì)于用于HBV治療的經(jīng)批準(zhǔn)藥劑的組合療法的反應(yīng)也比在具有HBV單純感染的患者中的反應(yīng)差(Wedemeyer等,2014,Oral abstract 4,49^thAnnual Meeting of the European Association for the Study of the Liver,April9-14,London,UK)。

目前批準(zhǔn)的針對(duì)HBV的治療包括基于干擾素-α或胸腺素α1的免疫療法，和通過(guò)核苷/核苷酸類(lèi)似物抑制HBV聚合酶來(lái)抑制病毒產(chǎn)生。HBV聚合酶抑制劑可有效減少感染性病毒體的產(chǎn)生，但對(duì)減少HBsAg極少甚至沒(méi)有效果，或僅在有限數(shù)量的患者進(jìn)行長(zhǎng)期治療下極緩慢減少HBsAg(Fung等,2011,Am.J.Gasteroenterol.,106:1766-1773；Reijnders等,2011,J.Hepatol.,54:449-454；Charuworn等,2014,Poster abstract 401,48^th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver,April 24-28,Amsterdam,The Netherlands)。HBV聚合酶抑制劑的主要作用是阻斷前基因組病毒mRNA轉(zhuǎn)化成部分雙鏈的DNA，該DNA存在于感染性病毒體中?；诟蓴_素的免疫治療可以實(shí)現(xiàn)感染性病毒的減少和從血液去除HBsAg，但僅在小百分比的受治療的對(duì)象中實(shí)現(xiàn)。

血液中的HBsAg可隔絕抗HBsAg抗體且允許感染性病毒顆粒逃避免疫檢測(cè)，這可能是HBV感染保持慢性病癥的原因之一。另外，HBsAg、HBeAg和HBcAg都具有如以下所述的免疫抑制性質(zhì)，且在施用以上所述的針對(duì)HBV的目前可用的治療中的任一個(gè)之后，這些病毒蛋白在患者血液中的存留可能對(duì)防止患者實(shí)現(xiàn)其HBV感染的免疫控制具有顯著影響。

盡管三種主要HBV蛋白(HBsAg、HBeAg和HBcAg)都具有免疫抑制性質(zhì)(參見(jiàn)下文)，但HBsAg在HBV感染的對(duì)象的循環(huán)中占HBV蛋白的絕大多數(shù)，并有可能是抑制宿主對(duì)HBV感染的免疫反應(yīng)的主要介導(dǎo)物。盡管HBeAg的去除、抗HBe的出現(xiàn)或血清病毒血癥的減少與在停止治療后HBV感染的持續(xù)控制的發(fā)展不相關(guān)，但在HBV感染中血清HBsAg從血液的去除(和游離抗HBsAg抗體的出現(xiàn))是治療時(shí)抗病毒反應(yīng)的公認(rèn)的優(yōu)良預(yù)后指標(biāo)，其在停止治療后，將導(dǎo)致對(duì)HBV感染的控制(雖然這僅在一小部分接受免疫治療或HBV聚合酶抑制劑的患者中發(fā)生)。因此，雖然所有三種主要HBV蛋白(HBsAg、HBeAg和HBcAg)的減少可導(dǎo)致抑制效果的最佳去除，但HBsAg的去除是必需的，且其單獨(dú)去除可能足以去除具有HBV感染的對(duì)象中對(duì)免疫功能的大部分抑制。

慢性HBV感染的另一關(guān)鍵特征是在感染的細(xì)胞的細(xì)胞核中建立HBV遺傳信息的穩(wěn)定儲(chǔ)存庫(kù)(reservoir)，其被稱(chēng)為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。cccDNA作為染色體外游離基因以多個(gè)拷貝存在于細(xì)胞核內(nèi)，其用作用于產(chǎn)生編碼所有病毒蛋白的mRNA的轉(zhuǎn)錄模板和用于產(chǎn)生新病毒體的未成熟的基因組(前基因組mRNA)。在細(xì)胞質(zhì)中衣殼化后，將未成熟的前基因組mRNA通過(guò)HBV聚合酶(其和前基因組mRNA共同衣殼化)轉(zhuǎn)化為成熟的部分雙鏈DNA基因組，從而在原始細(xì)胞或先前感染的細(xì)胞中使成熟HBV基因組有能力建立或補(bǔ)充cccDNA儲(chǔ)存庫(kù)。感染過(guò)程的結(jié)束由這部分雙鏈基因組HBV模板輸送至細(xì)胞核中以及其轉(zhuǎn)化為cccDNA組成。

可在被感染細(xì)胞的細(xì)胞核中經(jīng)由細(xì)胞核輸入含有補(bǔ)充cccDNA拷貝數(shù)的成熟HBV基因組的HBV衣殼來(lái)補(bǔ)充cccDNA。該細(xì)胞核cccDNA補(bǔ)充可通過(guò)以下兩種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)：從細(xì)胞質(zhì)直接細(xì)胞核輸入經(jīng)組裝衣殼，或再感染先前感染的肝細(xì)胞，且隨后使內(nèi)化衣殼穿梭至細(xì)胞核中(Rabe等,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9849-9854)。細(xì)胞核中該基因組HBV儲(chǔ)存庫(kù)的轉(zhuǎn)錄抑制或消除對(duì)治療后建立HBV感染的長(zhǎng)期控制是至關(guān)重要的。

利用核苷/核苷酸HBV聚合酶抑制劑長(zhǎng)期治療可減少細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA拷貝數(shù)，這和HBV聚合酶抑制劑能夠阻斷cccDNA通過(guò)細(xì)胞核輸入含有成熟HBV基因組的衣殼的補(bǔ)充一致。然而，雖然cccDNA拷貝數(shù)/肝細(xì)胞減少，但其仍保持轉(zhuǎn)錄活性，因此HBsAg水平在很大程度上不受影響(Werle-Lapostolle等,2004,Gastroenterol.,126:1750-1758；Wong等,2013,Clin.Gastroenterol.Hepatol.,11:1004-1010；Wong等,2014,Poster abstract 1074,49^th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver,April 9-14,London,UK)?？梢酝ㄟ^(guò)免疫介導(dǎo)的過(guò)程將cccDNA轉(zhuǎn)錄失活(Belloni等,2012,J.Clin.Inv.,122:529-537)，但免疫反應(yīng)激發(fā)為cccDNA失活所需的細(xì)胞因子應(yīng)答的能力可如U.S.2014/0065102(其通過(guò)引用全部并入本文)中所述通過(guò)持續(xù)循環(huán)HBsAg來(lái)阻斷，并且與免疫療法在治療HBV感染的無(wú)效性一致。

因此，醫(yī)學(xué)上明確需要可以在大比例的接受這種治療的患者中引發(fā)HBV感染的持久免疫控制的治療方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

按照本描述，現(xiàn)在提供用于治療對(duì)象中的HBV感染或HBV/HDV共感染的組合物，其包含第一藥學(xué)上可接受的藥劑，該藥劑包含至少一種硫代磷酸酯化核酸聚合物；和第二藥學(xué)上可接受的藥劑，該藥劑包含至少一種核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑。

也提供用于治療對(duì)象中的HBV感染或HBV/HDV共感染的組合物，其包含第一藥學(xué)上可接受的藥劑，該藥劑包含至少一種硫代磷酸酯化核酸聚合物的螯合復(fù)合物；和第二藥學(xué)上可接受的藥劑，該藥劑包含至少一種核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑。

進(jìn)一步提供包含至少一種硫代磷酸酯化核酸聚合物的第一藥學(xué)上可接受的藥劑和包含至少一種核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑的第二藥學(xué)上可接受的藥劑用于治療對(duì)象中的HBV感染或HBV/HDV共感染的用途。

另外提供包含至少一種硫代磷酸酯化核酸聚合物的第一藥學(xué)上可接受的藥劑和包含至少一種核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑的第二藥學(xué)上可接受的藥劑在制備用于治療對(duì)象中的HBV感染或HBV/HDV共感染的藥物中的用途。

進(jìn)一步提供包含至少一種硫代磷酸酯化核酸聚合物的螯合復(fù)合物的第一藥學(xué)上可接受的藥劑和包含至少一種核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑的第二藥學(xué)上可接受的藥劑用于治療對(duì)象中的HBV感染或HBV/HDV共感染的用途。

另外提供包含至少一種硫代磷酸酯化核酸聚合物的螯合復(fù)合物的第一藥學(xué)上可接受的藥劑和包含至少一種核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑的第二藥學(xué)上可接受的藥劑在制備用于治療對(duì)象中的HBV感染或HBV/HDV共感染的藥物中的用途。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供用于治療HBV感染或HBV/HDV共感染的組合物，其包含第一藥學(xué)上可接受的藥劑，該藥劑包含一種或多種選自以下的核酸聚合物的螯合復(fù)合物：

SEQ ID NO：2；

SEQ ID NO：10；

SEQ ID NO：13；

SEQ ID NO：1、3-9、11、12和14-20；

包含序列AC的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列CA的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列TG的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；和

包含序列GT的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

和第二藥學(xué)上可接受的藥劑，該藥劑包含以下的一種或多種：

拉米夫定(lamivudine)；

阿德福韋酯(adefovir dipivoxil)；

恩替卡韋(entecavir)；

替比夫定(telbivudine)；

富馬酸替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate)；

恩曲他濱(entricitabine)；

克來(lái)夫定(clevudine)；

貝斯福韋(besifovir)；

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺(tenofovir alafenamide fumarate)；

AGX-1009；

艾夫他濱(elvucitabine)；

拉昔洛韋瓦拉他特(lagociclovir valactate)；

甲磺酸帕拉德福韋(pradefovir mesylate)；

伐托他濱(valtorcitabine)；和

抑制HBV聚合酶的任意核苷/核苷酸類(lèi)似物。

在實(shí)施方式中，提供第一藥學(xué)上可接受的藥劑和第二藥學(xué)上可接受的藥劑用于治療HBV感染或HBV/HDV共感染的用途，該第一藥學(xué)上可接受的藥劑包含選自以下的一種或多種核酸聚合物的螯合復(fù)合物：

SEQ ID NO：2；

SEQ ID NO：10；

SEQ ID NO：13；

SEQ ID NO：1、3-9、11、12和14-20；

包含序列AC的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列CA的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列TG的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；和

包含序列GT的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

和該第二藥學(xué)上可接受的藥劑包含以下的一種或多種：

拉米夫定；

阿德福韋酯；

恩替卡韋；

替比夫定；

富馬酸替諾福韋二吡呋酯；

恩曲他濱；

克來(lái)夫定；

貝斯福韋；

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺；

AGX-1009；

艾夫他濱；

拉昔洛韋瓦拉他特；

甲磺酸帕拉德福韋；

伐托他濱；和

抑制HBV聚合酶的任意核苷/核苷酸類(lèi)似物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供第一藥學(xué)上可接受的藥劑和第二藥學(xué)上可接受的藥劑在制備用于治療HBV感染或HBV/HDV共感染的藥物中的用途，該第一藥學(xué)上可接受的藥劑包含選自以下的一種或多種核酸聚合物的螯合復(fù)合物：

SEQ ID NO：2；

SEQ ID NO：10；

SEQ ID NO：13；

SEQ ID NO：1、3-9、11、12和14-20；

包含序列AC的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列CA的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列TG的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；和

包含序列GT的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

和該第二藥學(xué)上可接受的藥劑包含以下的一種或多種：

拉米夫定；

阿德福韋酯；

恩替卡韋；

替比夫定；

富馬酸替諾福韋二吡呋酯；

恩曲他濱；

克來(lái)夫定；

貝斯福韋；

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺；

AGX-1009；

艾夫他濱；

拉昔洛韋瓦拉他特；

甲磺酸帕拉德福韋；

伐托他濱；和

抑制HBV聚合酶的任意核苷/核苷酸類(lèi)似物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物包括包含序列AC的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物包括包含序列CA的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物包括包含序列TG的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物包括包含序列GT的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含至少一種2'核糖修飾。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含具有2'修飾的所有核糖。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含至少一種2'O甲基核糖修飾。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含具有2'O甲基修飾的所有核糖。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含至少一種5'甲基胞嘧啶。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含作為5'甲基胞嘧啶存在的所有胞嘧啶。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含至少一種2'核糖修飾和至少一種5'甲基胞嘧啶。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，硫代磷酸酯化核酸聚合物還包含具有2'O甲基修飾的所有核糖和作為5'甲基胞嘧啶存在的所有胞嘧啶。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物選自SEQ ID NO：1-20。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物被制備成包含選自SEQ ID NO：1-20的寡核苷酸的寡核苷酸螯合復(fù)合物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物由SEQ ID NO：2組成的寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物被制備成包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸螯合復(fù)合物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物是由SEQ ID NO：10組成的寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物被制備成包含SEQ ID NO：10的寡核苷酸螯合復(fù)合物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物是由SEQ ID NO：13組成的寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸聚合物被制備成包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸螯合復(fù)合物。

在一個(gè)實(shí)施方式中，螯合復(fù)合物是鈣螯合復(fù)合物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，螯合復(fù)合物是鎂螯合復(fù)合物。

在另外的實(shí)施方式中，螯合復(fù)合物是鈣/鎂螯合復(fù)合物。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第一和第二藥學(xué)上可接受的藥劑被配制在相同藥物組合物中。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第一藥劑和第二藥劑被配制在單獨(dú)的藥物組合物中。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第一藥劑和第二藥劑被配制用于同時(shí)施用。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第一藥劑和第二藥劑被配制用于通過(guò)不同的途徑施用。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第一藥劑和第二藥劑被配制用于使用以下的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行施用：經(jīng)口攝取、氣溶膠吸入、皮下注射、靜脈注射和靜脈輸注。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，核酸聚合物是以下的至少一種：

SEQ ID NO：2；

SEQ ID NO：10；

SEQ ID NO：13；

SEQ ID NO：1、3-9、11、12和14-20；

包含序列AC的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列CA的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列TG的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；和

包含序列GT的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，下面的核酸聚合物可以進(jìn)一步被配制成寡核苷酸螯合復(fù)合物：

SEQ ID NO：2；

SEQ ID NO：10；

SEQ ID NO：13；

SEQ ID NO：1、3-9、11、12和14-20；

包含序列AC的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列CA的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；

包含序列TG的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸；和

包含序列GT的重復(fù)的長(zhǎng)度為20-120個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯化寡核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑包含下列的一種或多種：

拉米夫定；

阿德福韋酯；

恩替卡韋；

替比夫定；

富馬酸替諾福韋二吡呋酯；

恩曲他濱；

克來(lái)夫定；

貝斯福韋；

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺；

AGX-1009；

艾夫他濱；

拉昔洛韋瓦拉他特；

甲磺酸帕拉德福韋；

伐托他濱；和

抑制HBV聚合酶的任意核苷/核苷酸類(lèi)似物。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用NAP REP 2055(SEQ ID NO：2)和恩替卡韋(ETV)的組合治療對(duì)HBsAg的血清水平降低的協(xié)同效應(yīng)。

圖2A顯示作為鈣螯合復(fù)合物給予被DHBV感染的北京鴨(Pekin duck)的NAP的抗病毒活性，其通過(guò)在治療結(jié)束時(shí)通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)血清DHBsAg來(lái)測(cè)量。

圖2B顯示作為鈣螯合復(fù)合物給予被DHBV感染的北京鴨的NAP的抗病毒活性，其通過(guò)在治療結(jié)束時(shí)通過(guò)定量PCR監(jiān)測(cè)肝DHBV DNA來(lái)評(píng)價(jià)。

圖3A顯示在以下時(shí)間利用生理鹽水治療28天的鴨血清中DHBV DNA水平：A)治療前、B)當(dāng)治療完成一半時(shí)、C)治療結(jié)束時(shí)、D)治療后一個(gè)月和E)治療后兩個(gè)月。量化的下限(LLOQ)為3.1×10⁴VGE/ml。小于LLOQ的值設(shè)定在3×10³VGE/ml。VGE＝病毒基因組等效物。

圖3B顯示在以下時(shí)間利用富馬酸替諾福韋二吡呋酯(TDF)治療28天的鴨血清中DHBV DNA水平：A)治療前、B)當(dāng)治療完成一半時(shí)、C)治療結(jié)束時(shí)、D)治療后一個(gè)月和E)治療后兩個(gè)月。量化的下限(LLOQ)為3.1×10⁴VGE/ml。小于LLOQ的值設(shè)定在3×10³VGE/ml。VGE＝病毒基因組等效物。

圖3C顯示在以下時(shí)間利用REP 2139-Ca治療28天的鴨血清中DHBV DNA水平：A)治療前、B)當(dāng)治療完成一半時(shí)、C)治療結(jié)束時(shí)、D)治療后一個(gè)月和E)治療后兩個(gè)月。量化的下限(LLOQ)為3.1×10⁴VGE/ml。小于LLOQ的值設(shè)定在3×10³VGE/ml。VGE＝病毒基因組等效物。

圖3D顯示在以下時(shí)間利用REP 2139-Ca和TDF治療28天的鴨血清中DHBV DNA水平：A)治療前、B)當(dāng)治療完成一半時(shí)、C)治療結(jié)束時(shí)、D)治療后一個(gè)月和E)治療后兩個(gè)月。量化的下限(LLOQ)為3.1×10⁴VGE/ml。小于LLOQ的值設(shè)定在3×10³VGE/ml。VGE＝病毒基因組等效物。

圖3E顯示在以下時(shí)間利用REP 2139-Ca、TDF和恩替卡韋(ETV)治療28天的鴨血清中DHBV DNA水平：A)治療前、B)當(dāng)治療完成一半時(shí)、C)治療結(jié)束時(shí)、D)治療后一個(gè)月和E)治療后兩個(gè)月。量化的下限(LLOQ)為3.1×10⁴VGE/ml。小于LLOQ的值設(shè)定在3×10³VGE/ml。VGE＝病毒基因組等效物。

具體實(shí)施方式

本文提供抵抗HBV感染的組合治療，其由施用能夠從血液去除HBsAg的第一藥學(xué)上可接受的藥劑和抑制HBV聚合酶的第二藥學(xué)上可接受的藥劑組成。這樣的組合治療允許宿主免疫功能的恢復(fù)(通過(guò)去除血清HBsAg)，其繼而引起免疫介導(dǎo)的cccDNA的轉(zhuǎn)錄失活和或感染的肝細(xì)胞中cccDNA拷貝數(shù)的減少，同時(shí)經(jīng)由細(xì)胞核輸入含有成熟HBV基因組的衣殼或產(chǎn)生感染性病毒(通過(guò)抑制HBV聚合酶)阻斷cccDNA的補(bǔ)充。這兩種藥物的組合的協(xié)同效應(yīng)可加速對(duì)治療的抗病毒反應(yīng)和或消除感染細(xì)胞的cccDNA，從而縮短在停止治療后獲得感染的持續(xù)抑制所需的治療時(shí)間。重要的是，這些效果可以在不存在免疫治療時(shí)實(shí)現(xiàn)。這種組合治療將對(duì)HBV單純感染和HBV/HDV共感染有效。

HBsAg在HBV感染和HBV/HDV共感染中起著關(guān)鍵作用。除了HBsAg作為病毒體形成的必要結(jié)構(gòu)組分的作用以外，其也以亞病毒顆粒(SVP)的形式大量釋放至被感染的對(duì)象的血液中，這些顆粒缺乏病毒衣殼和基因組并且其似乎主要用于將HBsAg輸送至血液中。感染細(xì)胞以超過(guò)病毒分泌過(guò)量1,000-10,000倍分泌SVP，從而允許SVP有效隔絕HBsAg抗體(抗HB)，使得血液中的HBV或HDV病毒可因適應(yīng)性免疫而逃避識(shí)別。一些研究也已表明，HBsAg還可用來(lái)直接阻斷HBV感染的適應(yīng)性和先天免疫反應(yīng)的活化(Cheng等,2005,Journal of hepatology,43:4 65-471；Op den Brouw等,2009,Immunology,126:280-289；Vanlandschoot等,2002,The Journal of general virology,83:1281-1289；Wu等,2009,Hepatology,49:1132-1140；Xu等,2009,Molecular immunology,46:2640-2646)。該功能性在人類(lèi)HBV感染中的存在和其對(duì)免疫治療劑的活性的影響和這些抗病毒效果在HBV/HDV共感染中的額外適用性先前已經(jīng)描述在US 2014/0065102 A1中，其通過(guò)引用全部并入本文。雖然HBeAg和HBcAg也已顯示出具有免疫抑制性質(zhì)(Kanda等,2012,J.Inf.Dis.,206:415-420；Lang等,2011,J.Hepatol.,55:762-769；Gruffaz等,2013,J.Hepatol.,58(supp1),p s155,Abstract 378)，但是鑒于血液中與HBsAg相關(guān)的HBeAg和HBcAg占非常小的部分，這些可能具有最小影響。

HBV聚合酶(NRTI)的核苷/核苷酸類(lèi)似物抑制劑是公知類(lèi)型的抗病毒劑，其抵抗HBV感染的活性通過(guò)相同作用機(jī)制發(fā)生：這類(lèi)化合物通過(guò)在DNA鏈伸長(zhǎng)期間與天然核苷酸底物競(jìng)爭(zhēng)而充當(dāng)即時(shí)或延遲鏈終止劑(Menendez-Arias等,2015Curr.Op.Virol.8:1-9)。這類(lèi)化合物可以保留由含氮堿基和糖組成的基本核心核苷酸/核苷核心結(jié)構(gòu)，或可以是無(wú)環(huán)核苷酸，或者可以缺少糖或假糖環(huán)，或可以具有取代α-磷酸酯的膦酸酯基團(tuán)且可存在許多其他額外的修飾，如在Michailidis等,2012Int.J.Biochem.Cell.Biol.44:1060-1071和De Clercq等,2010Viruses 2:1279-1305所述。

鴨HBV病毒(DHBV)感染的鴨是公認(rèn)的HBV感染模型，并已用于評(píng)估目前用于治療人類(lèi)患者的若干HBV NRTI(Schultz等,2004,Adv Virus Res,63:1-70；Foster等,2005,J Virol,79:5819-5832；Nicoll等.1998,Antimicrob Agents Chemother.,42:3130-3135)。已顯示出硫代磷酸酯化的核酸聚合物(NAP)在DHBV感染的鴨中具有抗病毒活性(Noordeen等,2013Anti-Microb.Agents Chemother.57:5291-5298and 5299–5306)，這并非源于任何直接免疫刺激機(jī)制。此外，在以前建立的體內(nèi)DHBV感染中利用NAP REP 2055(SEQ ID NO:2)進(jìn)行治療介入，REP 2055可清除血清鴨HBsAg(DHBsAg)，這伴有cccDNA的轉(zhuǎn)錄失活和cccDNA拷貝數(shù)的減少(Noordeen等,2009,Abstract 88HEPDART meeting Dec 6–9,HI,USA)。cccDNA的這種失火和消除通過(guò)DHBsAg介導(dǎo)的宿主免疫功能抑制的去除引起，然后可以通過(guò)公認(rèn)的免疫介導(dǎo)的機(jī)制失活并清除感染細(xì)胞的cccDNA(Levrero等,2009,J.Hepatol.,51:581-592；Belloni等,2012,J.Clin.Inv.,122:529-537)。

從人類(lèi)患者的血液有效去除HBsAg的NAP，如US 2014/0065102中所述。在公認(rèn)的臨床前HBV感染模型(鴨HBV感染的北京鴨)中，NAP治療可消除血清鴨HBsAg(DHBsAg)，并且在血清DHBsAg的不存在下免疫功能的恢復(fù)能夠轉(zhuǎn)錄失活并消除感染的肝細(xì)胞的cccDNA(Noordeen等,2009,Abstract 88,HEPDART meeting Dec 6-10,HI,USA)。因此，預(yù)計(jì)從HBV感染的患者的血清去除HBsAg對(duì)原位感染的人肝細(xì)胞中的cccDNA失活具有相同的效果。

因此，本文描述用于較快速建立血清病毒血癥的控制或用于建立cccDNA活性的持久控制和或消除HBV感染的肝細(xì)胞的cccDNA的有效手段，該手段由如下新穎組合方法組成：其中通過(guò)使用藥學(xué)上可接受的硫代磷酸酯化NAP制劑從血液減少或去除HBsAg和通過(guò)抑制HBV聚合酶的第二藥學(xué)上可接受的核苷酸/核苷類(lèi)似物制劑阻斷cccDNA的補(bǔ)充和感染性病毒的產(chǎn)生。這種組合方法具有以下新穎和重要的優(yōu)點(diǎn)：

1)其結(jié)合以下能力：改善宿主免疫功能(由血清HBsAg的去除引起)以轉(zhuǎn)錄失活細(xì)胞內(nèi)的cccDNA和或減少細(xì)胞內(nèi)的cccDNA拷貝數(shù)，和阻斷cccDNA的補(bǔ)充(通過(guò)防止含有成熟基因組的衣殼進(jìn)入細(xì)胞核(通過(guò)抑制HBV聚合酶活性)或感染性病毒體的產(chǎn)生(通過(guò)防止前基因組RNA在HBV衣殼內(nèi)轉(zhuǎn)化為部分雙鏈DNA)；

2)其由于所述兩種藥學(xué)上可接受的藥劑的重疊效應(yīng)而對(duì)減少自肝中感染肝細(xì)胞的去除、消除或建立cccDNA的轉(zhuǎn)錄抑制或血清病毒血癥的控制所需的治療持續(xù)時(shí)間具有協(xié)同效應(yīng)；以及

3)其無(wú)需使用免疫治療(如經(jīng)教導(dǎo)在U.S.2014/0065102中具體所需)，以在治療后達(dá)到HBV感染的持續(xù)控制，鑒于免疫治療在許多患者中耐受性較差，這將是重要的治療改進(jìn)。

利用上述方法改進(jìn)的抗病毒效果在具有HBV單純感染和HBV/HDV共感染的患者中將具有相同的治療益處，因?yàn)樵谏鲜鯤DV感染不存在下，HDV感染不可存在。

因此，在可以在大比例的患者中消除或建立cccDNA活性的持久控制而無(wú)需使用免疫治療的任何當(dāng)前治療方案不存在下，本文第一次提供抵抗HBV感染和HBV/HDV共感染的有效組合治療，所述組合治療同時(shí)減少或清除血液的HBsAg且其在HBV感染的細(xì)胞的細(xì)胞核中阻斷cccDNA補(bǔ)充。這些效果可以通過(guò)使用與藥學(xué)上可接受的核苷/核苷酸類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑組合使用的藥學(xué)上可接受的硫代磷酸酯化NAP制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

該新穎組合方法在免疫治療不存在下是有效的，其具有改善的治療耐受性和減少利用免疫治療發(fā)生的已知的血液學(xué)和其它副作用的發(fā)生率的重要的優(yōu)點(diǎn)。

術(shù)語(yǔ)寡核苷酸(ON)是指核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的低聚物或聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括由修飾的核堿基(包括5'甲基胞嘧啶和4'硫尿嘧啶)、糖和共價(jià)核苷間(主鏈)鍵構(gòu)成的ON，以及具有非天然存在的部分的功能類(lèi)似的ON。這種修飾或取代的ON可以由于諸如以下的期望的性質(zhì)而優(yōu)于自然形式：例如，免疫反應(yīng)性降低、細(xì)胞攝取增強(qiáng)、對(duì)核酸靶標(biāo)的親和力增強(qiáng)(在反義ON、siRNA和shRNA的情況下)和/或?qū)怂崦附閷?dǎo)的降解的穩(wěn)定性提高。ON也可以是雙鏈的。ON也包括單鏈分子，諸如反義寡核苷酸、Speigelmers和適配體和miRNA，以及雙鏈分子，諸如小干擾RNA(siRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA)。

ON可以包括各種修飾，例如穩(wěn)定修飾，并且因此可以在磷酸二酯鍵中和/或在糖和/或堿基上包括至少一種修飾。例如，ON可包括但不限于，一種或多種修飾，或可完全經(jīng)修飾以便含有具有所述的修飾的所有鍵或糖或堿基。經(jīng)過(guò)修飾的鍵可以包括硫代磷酸酯鍵和二硫代磷酸酯鍵。當(dāng)經(jīng)過(guò)修飾的鍵有用時(shí)，ON可以包括磷酸二酯鍵。額外有用的修飾包括但不限于，在糖的2'位置的修飾，包括2'-O-烷基修飾，諸如2'-O-甲基修飾、2'O-甲氧基乙基(2'MOE)、2'-氨基修飾、2'-鹵素修飾，諸如2'-氟；無(wú)環(huán)核苷酸類(lèi)似物。其他2'修飾也是本領(lǐng)域中熟知的并且可加以使用，諸如鎖核酸。具體地，ON具有遍及各處的經(jīng)修飾的鍵或具有經(jīng)修飾的每個(gè)鍵，例如，硫代磷酸酯；具有3'-帽和/或5'-帽；包括末端3'-5'鍵；ON是或包括由兩個(gè)或多個(gè)由連接體結(jié)合在一起的ON序列組成的多聯(lián)體。堿基修飾可包括胞嘧啶堿基的5'甲基化(5'甲基胞嘧啶或在核苷酸的情況下5'甲基胞苷)和/或尿嘧啶堿基的4'硫基化(4'硫尿嘧啶或在核苷酸的情況下4'硫尿苷)。當(dāng)合成條件是化學(xué)相容的，則可組合不同的化學(xué)相容的修飾的鍵，例如具有帶有硫代磷酸酯鍵、2'核糖修飾(例如2'O-甲基化)和經(jīng)修飾的堿基(例如5'甲基胞嘧啶)的寡核苷酸?？衫盟羞@些不同的修飾(例如每個(gè)硫代磷酸酯化鍵、每個(gè)2'修飾的核糖和每個(gè)經(jīng)修飾的堿基)進(jìn)一步完全修飾ON。

如本文所涵蓋的，術(shù)語(yǔ)“核酸聚合物”或NAP是不含有與核酸靶標(biāo)雜交或采用引起與特定蛋白結(jié)合的序列特異性二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列特異性功能性的任一單鏈ON。NAP的生物化學(xué)活性并非取決于ON的Toll樣受體識(shí)別、與靶標(biāo)寡核苷酸的雜交或要求源于所存在的核苷酸的特定順序的特定二級(jí)/三級(jí)ON結(jié)構(gòu)的適配體相互作用。NAP可包括如上所述的堿基和或鍵或糖修飾。NAP需要硫代磷酸酯化以具有抗病毒活性。示例性抗病毒NAP化合物列于表1中：

表格1

可用于本公開(kāi)的抗病毒NAP的實(shí)例

dA＝脫氧腺苷，A＝腺苷，dC＝脫氧胞苷，C＝胞苷，dT＝脫氧胸苷，dG＝脫氧鳥(niǎo)苷，PS＝硫代磷酸酯，2'OMe＝2'O甲基，5'MeC＝5'甲基胞嘧啶修飾的胞苷，5'MedC＝5'甲基胞嘧啶修飾的脫氧胞苷

在本公開(kāi)中，術(shù)語(yǔ)“ON螯合復(fù)合物”是指兩個(gè)或更多個(gè)在分子間通過(guò)二價(jià)或多價(jià)金屬陽(yáng)離子連接且可在單鏈或雙鏈ON下發(fā)生的ON。ON螯合復(fù)合物中和ON的固有螯合性質(zhì)，這可有助于利用這些化合物的與施用相關(guān)的副作用。ON螯合復(fù)合物的施用是向?qū)ο笫┯肙N的方法，其中與未螯合ON(其是作為本領(lǐng)域中常用的鈉鹽來(lái)施用的ON)相關(guān)聯(lián)的施用相關(guān)的副作用有所減輕，如U.S.8,513,211和8,716,259中所述，其通過(guò)引用全部并入本文。這些副作用可包括在靜脈內(nèi)輸注或硬結(jié)下的寒戰(zhàn)、發(fā)熱和寒冷、在皮下施用下的注射部位的炎癥和疼痛。ON螯合復(fù)合物的施用在通常作為鈉鹽使用時(shí)并不干擾ON的生物化學(xué)活性。因此本文所述的任何NAP可以任選地被制備成ON螯合復(fù)合物而不影響其生物化學(xué)活性。

ON螯合復(fù)合物可以含有多種不同的多價(jià)金屬陽(yáng)離子，包括鈣、鎂、鈷、鐵、錳、鋇、鎳、銅、鋅、鎘、汞和鉛。進(jìn)一步表明，這些多價(jià)金屬陽(yáng)離子的螯合使得形成包含兩個(gè)或更多個(gè)經(jīng)由金屬陽(yáng)離子連接的ON的ON螯合復(fù)合物，且在長(zhǎng)度超過(guò)6個(gè)核苷酸的ON下和在具有磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵的ON存在下發(fā)生。ON可以任選地具有每個(gè)硫代磷酸酯化的鍵。螯合也在核糖處含有2'修飾(如2'O甲基)或含有修飾的堿基，如5'甲基胞嘧啶或4-硫尿嘧啶的ON下發(fā)生。這些2'修飾可以存在于一個(gè)或多個(gè)或所有核糖上，且修飾的堿基可以存在于一個(gè)或多個(gè)堿基上或普遍存在于每個(gè)堿基上(即，所有的胞嘧啶都作為5'甲基胞嘧啶存在)。此外，ON螯合復(fù)合物可包含含有多個(gè)修飾，如每個(gè)硫代磷酸酯化的鍵、每個(gè)2'修飾的核糖和每個(gè)修飾的堿基的ON。與ON螯合復(fù)合物形成相容的ON修飾在上文被進(jìn)一步定義。此外，金屬陽(yáng)離子的螯合并非取決于所存在的核苷酸的序列而是依賴(lài)于所有ON共同的理化特征。

雖然ON螯合復(fù)合物的形成可用任何二價(jià)金屬陽(yáng)離子實(shí)現(xiàn)，但是意欲用作醫(yī)藥的ON螯合復(fù)合物應(yīng)優(yōu)選只包含鈣和或鎂，但是也可以包含微量的鐵、錳、銅或鋅且不應(yīng)包括鈷、鋇、鎳、鎘、汞、鉛或本文未列出的任何其它二價(jià)金屬。

如U.S.2014/0065192中所述，通過(guò)硫代磷酸酯化NAP從感染患者的血液去除HBsAg使得部分恢復(fù)免疫應(yīng)答，從而從血液去除HBVe-抗原(HBeAg)，并且使得在治療期間血液中的病毒水平實(shí)質(zhì)上降低，但是這些抗病毒效果在治療停止后在大多數(shù)患者中未得到維持。盡管免疫應(yīng)答的這部分恢復(fù)(在HBsAg及其它病毒抗原不存在下)可使得在停止治療后在一小部分患者中建立HBV感染的持久免疫學(xué)控制，但期望在甚至更大部分患者中建立感染的持久免疫學(xué)控制。在治療后持久免疫學(xué)控制的患者的比例的改進(jìn)可以通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：與其它抗病毒藥劑組合使用硫代磷酸酯化NAP來(lái)改進(jìn)對(duì)治療的抗病毒反應(yīng)的速度和效力?？善谕苊馐褂弥T如基于干擾素的治療等免疫治療或其他免疫治療，因?yàn)檫@些治療通常與使患者更加難以耐受治療的副作用相關(guān)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“從血液去除HBsAg”是指相對(duì)于治療前血液中HBsAg的濃度HBsAg血液中HBsAg濃度的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低，如通過(guò)Abbott Architect^TM定量HBsAg分析或血清HBsAg的其他臨床認(rèn)可的定量測(cè)量測(cè)得。

針對(duì)硫代磷酸酯化NAP的示范性有效的給藥方案遵循如U.S.2014/0065102中所述的通常用于其他硫代磷酸酯化ON(如反義寡核苷酸)的那些；本領(lǐng)域中充分確立每周腸胃外施用100-500mg化合物的常規(guī)使用，以在肝中實(shí)現(xiàn)這些化合物的治療活性水平，如針對(duì)以下實(shí)施例Ⅰ中的NAP和針對(duì)引起肝特異性mRNA的降解的硫代磷酸酯化反義ON(對(duì)于載脂蛋白B100)所述，如Akdim等(2010,Journal of the American College of Cardiology,55:1611-1618)所述。

因此，根據(jù)本文中所呈現(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容，利用與藥學(xué)上可接受的核苷/核苷酸HBV聚合酶抑制劑組合的藥學(xué)上可接受的硫代磷酸酯化NAP制劑治療具有HBV感染或HBV/HDV共感染的對(duì)象是有用的。

在同一藥物組合物中施用兩種藥學(xué)上可接受的藥劑或在單獨(dú)的藥物組合物中同時(shí)或在不同時(shí)間施用兩種藥學(xué)上可接受的藥劑也是有用的。

通過(guò)相同或不同的施用途徑施用藥學(xué)上可接受的藥劑是有用的。

為了在對(duì)象中提供最可能的抗病毒反應(yīng)，可能有必要使用一種以上的HBV聚合酶抑制劑以最大限度地阻斷HBV聚合酶，且因此對(duì)阻斷cccDNA的補(bǔ)充具有最大效果。因此，一種或多種HBV聚合酶抑制劑可選自以下核苷類(lèi)似物：

拉米夫定；

阿德福韋酯；

恩替卡韋；

替比夫定；

富馬酸替諾福韋二吡呋酯；

恩曲他濱；

克來(lái)夫定；

貝斯福韋；

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺；

AGX-1009；

艾夫他濱；

拉昔洛韋瓦拉他特；

甲磺酸帕拉德福韋；

伐托他濱；和

抑制HBV聚合酶的任意核苷/核苷酸類(lèi)似物。

本文所述的組合物可通過(guò)任何合適的手段來(lái)施用，例如，經(jīng)口，如以片劑、膠囊、顆?；蚍勰┬问?；經(jīng)舌下；經(jīng)頰；腸胃外，如通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、注射或輸注技術(shù)(例如，以無(wú)菌可注射的水或非水溶液或懸浮液)；通過(guò)吸入；局部，例如以乳膏或軟膏的形式；或經(jīng)直腸，例如以栓劑或灌腸劑的形式；在含有無(wú)毒性的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的劑量單位制劑中。例如，可以適于立即釋放或延長(zhǎng)的釋放的形式施用本組合物。可通過(guò)使用合適的藥物組合物或者特別是在延長(zhǎng)的釋放的情況下通過(guò)使用諸如皮下植入物或滲透泵等裝置實(shí)現(xiàn)立即釋放或延長(zhǎng)的釋放。因此，上述組合物可適于通過(guò)以下途徑中的任一個(gè)來(lái)施用：經(jīng)口攝取、吸入、皮下注射、靜脈內(nèi)注射或輸注、或局部。

通過(guò)參考下面的例子將更容易地理解本公開(kāi)內(nèi)容。

實(shí)施例I

組合NAP/ETV治療對(duì)血清HBsAg的效果

通過(guò)每周一次IV輸注400mg將NAP REP 2055(SEQ ID NO：2)的藥學(xué)上可接受的制劑施用給具有慢性HBV感染的患者。使用合格的現(xiàn)場(chǎng)定性ELISA每周實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)該患者中的血清HBsAg反應(yīng)。該ELISA方法對(duì)HBsAg的低水平非常敏感，但不能準(zhǔn)確地定量血液中的任何顯著的HBsAg濃度。雖然在REP 2055單一治療(圖1，正方形)期間中使用此HBsAg分析未觀察到血清HBsAg的可檢測(cè)的降低，但是該患者經(jīng)歷了血清病毒血癥(血清HBV DNA)的非常溫和的(約1log)下降，這表明已經(jīng)出現(xiàn)某些抗病毒反應(yīng)。因此，在29周的REP 2055單一治療后，該患者除了由每天口服0.5mg恩替卡韋組成的現(xiàn)有REP 2055治療以外接受HBV聚合酶抑制治療。

在兩周的起始組合REP 2055/ETV治療內(nèi)通過(guò)定性分析檢測(cè)到血清HBsAg立即減少，且血清HBsAg在開(kāi)始組合治療后4周內(nèi)在定性ELISA中變得檢測(cè)不到(圖1，正方形)。經(jīng)過(guò)許多周的治療，利用組合的REP2055/ETV治療對(duì)這種血清HBsAg的協(xié)同控制得以維持。

為證實(shí)組合REP 2055/ETV治療對(duì)抑制HBsAg的協(xié)同活性，使用IMPACT平臺(tái)重新分析該患者的血清樣品以將血清HBsAg水平準(zhǔn)確定量，如de Neit等(2014,Antiviral Ther.,19:259-267)所述。這種定量分析顯示利用REP 2055單一治療發(fā)生的血清HBsAg的初始約2log減少(圖1圓形)，這通過(guò)定性ELISA是無(wú)法檢測(cè)的并且這可能是在上述REP 2055單一治療后所觀察到的病毒血癥下降約1log的原因。重要的是，該患者中的血清HBsAg減少達(dá)到平臺(tái)期，其中從10周的REP 2055治療開(kāi)始直到在29周治療時(shí)開(kāi)始組合REP 2055/ETV治療，顯著血清HBsAg是穩(wěn)定存在的。在開(kāi)始組合REP 2055/ETV治療下，血清HBsAg的定量分析表明血清HBsAg幾乎相同且快速的減少，如利用現(xiàn)場(chǎng)定性測(cè)試觀察到的，且這些額外的減少超過(guò)1.5log，這也可在開(kāi)始組合REP 2055/ETV治療后的4周內(nèi)實(shí)現(xiàn)。

在REP 2055單一治療存在下的血清HBsAg低水平的持續(xù)性顯示具有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA仍然存在于該患者的肝中。通過(guò)向現(xiàn)有REP 2055治療中添加ETV對(duì)血清HBsAg的非?？焖兕~外清除指示對(duì)cccDNA轉(zhuǎn)錄控制的協(xié)同效應(yīng)和或已發(fā)生消除。重要的是，此額外控制的cccDNA的發(fā)生的出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于在單一治療中所使用的HBV聚合酶抑制劑下所觀察到的，其只需要4周來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，這些觀察結(jié)果證明當(dāng)與HBV聚合酶抑制劑(在這種情況下恩替卡韋)組合時(shí)，對(duì)血清HBsAg減少具有新穎協(xié)同抗病毒效果(在這種情況下使用NAP REP 2055實(shí)現(xiàn))。

實(shí)施例Ⅱ

各種NAP在DHBV感染的北京鴨中的抗病毒效果

在DHBV感染的北京鴨中測(cè)試包含不同核酸修飾的各種NAP來(lái)建立其抗病毒活性。這些NAP是REP 2055(SEQ ID NO：2)、REP 2139(SEQ ID NO：10)、REP 2163(SEQ ID NO：11)和REP 2165(SEQ ID NO：13)。表2提供這些NAP的化學(xué)描述。

表2

用于實(shí)施例II中的NAP的描述

dA＝脫氧核糖腺苷

dC＝脫氧核糖胞苷

A＝核糖腺苷

5'MeC＝核糖-5'甲基胞苷

5'MedC＝脫氧核糖＝5'甲基胞苷

用2×10¹¹個(gè)病毒基因組等效物(VGE)/ml的DHBV感染三日齡的北京雛鴨。已經(jīng)確立在感染后11天后開(kāi)始NAP治療。經(jīng)由每周3次腹膜內(nèi)注射10mg/kg NAP(配制成鈣螯合復(fù)合物)達(dá)三周施用NAP，隨后在治療結(jié)束時(shí)分析抗病毒效果。利用生理鹽水經(jīng)由相同的施用途徑且利用相同的給藥方案處理對(duì)照組。通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)血清DHBsAg(圖2A)和通過(guò)定量PCR監(jiān)測(cè)肝DHBV DNA(圖2B)來(lái)評(píng)價(jià)抗病毒活性。

所有NAP皆導(dǎo)致血清DHBsAg和肝DHBV DNA的減少，這表明含多種不同的寡核苷酸修飾的不同NAP將具有相當(dāng)?shù)目共《拘?yīng)。這又表明使用特定的NAP和基于一種或多種核苷類(lèi)似物的HBV聚合酶抑制劑觀察到的協(xié)同抗病毒活性(如利用上述實(shí)施例I中的REP 2055和恩替卡韋觀察到的)將在任何其它硫代磷酸酯化NAP下出現(xiàn)并且也在配制成螯合復(fù)合物的任何所述硫代磷酸酯化的NAP下出現(xiàn)(如U.S.8,513,211和8,716,259中所述)。

實(shí)施例Ⅲ

NAP與TDF和ETV的組合在DHBV感染的北京鴨中的抗病毒效果

通過(guò)在治療期間和在治療后通過(guò)定量PCR評(píng)估血清和肝臟DHBV DNA的水平的變化，檢查REP 2139的鈣螯合復(fù)合物(REP 2139-Ca)和TDF或REP 2139-Ca和TDF與ETV的組合治療在DHBV感染的北京鴨中的抗病毒效果。如實(shí)施例II中所述實(shí)施鴨的感染，只是治療在感染后一個(gè)月開(kāi)始。治療方案如下：

1)生理鹽水，通過(guò)IP注射給予，每周3次，保持4周

2)TDF，通過(guò)經(jīng)口胃管灌食法給予15mg/天，保持28天

3)REP 2139-Ca，通過(guò)IP注射給予10mg/kg，每周3次，保持4周。

4)REP 2139-Ca和TDF(如上給藥)

5)REP 2139-Ca和TDF(如上給藥)，和ETV，通過(guò)經(jīng)口胃管灌食法給予1mg/天，保持28天。

在治療前(時(shí)間點(diǎn)A)、在治療的第14天(時(shí)間點(diǎn)B)、在治療結(jié)束時(shí)(時(shí)間點(diǎn)C)和在治療停止后的一個(gè)月和兩個(gè)月(隨訪，時(shí)間點(diǎn)D和E)評(píng)價(jià)血清DHBV DNA。

在生理鹽水治療組中，在治療期間沒(méi)有觀察到DHBV DNA的控制，但在隨訪期間在這組中的3只鴨中DHBV DNA變得自發(fā)地受控制(圖3A)。在TDF治療組中，血清DHBV DNA在所有鴨中皆有所減少，但直到治療結(jié)束才在所有鴨中實(shí)現(xiàn)控制。在隨訪期間該組中的所有鴨中的DHBV DNA皆反彈(圖3B)。在REP 2139-Ca治療組中，在整個(gè)研究期間在兩只鴨中沒(méi)有觀察到DHBV DNA變化，DHBV DNA在治療結(jié)束時(shí)僅在兩個(gè)鴨中得到控制并且在隨訪期間在兩只額外的鴨中變得自發(fā)地受控制(圖3C)。當(dāng)將REP 2139-Ca與TDF組合時(shí)，DHBV DNA的控制在治療進(jìn)行到一半時(shí)在除一只鴨以外的所有鴨中發(fā)生且通?？煊谠诶脝为?dú)REP 2139-Ca或TDF治療的組中達(dá)到的控制。當(dāng)將REP 2139-Ca與TDF和ETV組合時(shí)，可在治療進(jìn)行一半時(shí)在所有的鴨中控制DHBV(3E)。利用組合的REP 2139-Ca及TDF(或TDF及ETV)比利用單獨(dú)TDF或REP 2139-Ca在隨訪期間維持血清DHBV DNA的控制的鴨的比例大。

這些觀察教導(dǎo)，與利用單獨(dú)REP 2139-Ca或TDF實(shí)現(xiàn)的相比，HBV感染中的治療過(guò)程中的抗病毒反應(yīng)可通過(guò)結(jié)合REP 2139-Ca和TDF或TDF和ETV來(lái)協(xié)同地改進(jìn)并且可導(dǎo)致在停止治療后改進(jìn)持續(xù)的病毒學(xué)反應(yīng)。在上述實(shí)施例中觀察到的協(xié)同活性可以可靠地預(yù)計(jì)利用如本文所述的任何NAP抗HBV活性和利用如本文所述的基于任何核苷酸/核苷類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑而發(fā)生。此外，也可使用與一種以上的核苷/核苷酸HBV聚合酶抑制劑組合使用的NAP，其中具有類(lèi)似地產(chǎn)生性協(xié)同抗病毒效果。

組合的NAP/TDF/ETV治療的協(xié)同效應(yīng)可改進(jìn)抗病毒反應(yīng)的速度，這表明了縮短能夠在停止治療后實(shí)現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)反應(yīng)的治療方案的潛力。該潛力也可利用如本文所述的NAP和核苷酸/核苷類(lèi)似物HBV聚合酶抑制劑治療的任何組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。

因此，這些觀察結(jié)果教導(dǎo)，從血液中減少或移除HBsAg的任何藥學(xué)上可接受的硫代磷酸酯化NAP制劑(如U.S.2014/0065102和U.S.8,008,269、8,008,270和8,067,385中所述的)可以與如上述所列出的任何核苷/核苷酸HBV聚合酶抑制劑組合并且預(yù)計(jì)可對(duì)可控制血清病毒血癥的速度和或HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄失活和或消除實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。所觀察到的協(xié)同效應(yīng)也教導(dǎo)，可以組合較低劑量的所述藥學(xué)上可接受的藥劑，并且仍然實(shí)現(xiàn)協(xié)同活性以及有用的抗病毒效果。

鑒于利用與一種核苷/核苷酸HBV聚合酶抑制劑組合使用的一種硫代磷酸酯化NAP在上文觀察到的協(xié)同抗病毒效果，利用與如上文所述的一種或多種核苷/核苷酸HBV聚合酶抑制劑組合使用的一種或多種硫代磷酸酯化NAP也可實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的協(xié)同效應(yīng)。

上面的描述僅僅意欲為示例性的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可對(duì)所述實(shí)施例作出改變而不脫離由所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的綜述將了解落入如所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)的其它修改，而不脫離由所附的權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍。

序列表

<110> 里普利科股份有限公司

<120> 治療B型肝炎和D型肝炎感染的方法

<130> 05016051-40PCT

<150> 62/022,846

<151> 2014-07-10

<160> 20

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化

<400> 1

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2055, 完全硫代磷酸酯化

<400> 2

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2148, 完全硫代磷酸酯化, C = 5'

甲基胞苷

<400> 3

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化, C = 5' 甲基胞苷

<400> 4

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 5

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2153, 完全硫代磷酸酯化, 完全經(jīng)過(guò) 2' O 甲基核糖修飾

<400> 5

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 6

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化, 完全經(jīng)過(guò) 2' O 甲基核糖修飾

<400> 6

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2033, 完全硫代磷酸酯化

<400> 7

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化

<400> 8

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 40

<210> 9

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化, 完全經(jīng)過(guò) 2' O 甲基核糖修飾,

每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)5'甲基化

<400> 9

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 10

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2139, 完全硫代磷酸酯化,完全經(jīng)過(guò) 2' O

甲基核糖修飾, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)5'甲基化

<400> 10

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2163, 完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò) 5'甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,

37,39

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 11

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 12

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2164, 完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò) 5' 甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 1-12, 14-26, 28-40

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 12

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 13

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2165, 完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò) 5' 甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 1-10, 12-20, 22-30, 32-40

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 13

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 14

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2166, 完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)

5' 甲基化和 2'O 甲基核糖修飾

<400> 14

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> REP 2167,完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò) 5' 甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34

36,38,40

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 15

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化,每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)5'甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34

36,38,40

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 16

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 17

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)5'甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 1-13, 15-27, 29-40

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 17

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 18

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化,每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)5'甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 1-9, 11-29, 21-29, 31-40

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 18

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 19

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化, 每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)

5' 甲基化和 2'O 甲基核糖修飾

<400> 19

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全硫代磷酸酯化,每個(gè)胞嘧啶經(jīng)過(guò)5'甲基化

<220>

<221> misc_feature

<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,

37,39

<223> 2' O 甲基核糖修飾

<400> 20

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40