專利名稱：一種重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體來說是一種生物制藥方法，涉及的是重組人促紅素工業(yè)化生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
促紅素(Erythropoietin, ΕΡ0)是一種促進紅系造血前體細胞分化、繁殖的細胞因子，是一種高度糖基化的糖蛋白。人類EPO基因位于7號染色體長22區(qū)。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重組技術(shù)開始生產(chǎn)重組人促紅素(recombinant humanErythropoietin, rhEPO)，在臨床上用于治療慢性腎衰竭合并貧血癥，慢性腎功能衰竭(CRF)貧血，骨髓增生異常綜合癥貧血(MDS)，AIDS病人的伴生貧血等貧血癥的治療。rhEPO是以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的紅細胞生成素，目前主流生產(chǎn)方法是將人促紅素的基因構(gòu)建連接到表達載體上，常用表達載體為中國倉鼠卵巢CHO細胞，經(jīng)過細胞擴增培養(yǎng)，從細胞培養(yǎng)上清液中經(jīng)分享純化得到促紅細胞生成素。目前，在培養(yǎng)基應用方面，重組人促紅素生產(chǎn)細胞株主要是在含有8-10%牛血清的培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)。但是血清培養(yǎng)基培養(yǎng)具有很多不足，主要表現(xiàn)在:1、血清的成份復雜，有幾百種之多，含有許多仍然未知的成份，給后續(xù)的分離純化帶來困難。2、血清中可能帶入的支原體、病毒或其他未知成份，對細胞產(chǎn)生潛在影響，因此具有一定風險性。3、血清取自于動物，受個體影響大，因此`不同動物個體、不同批次產(chǎn)品之間差異大，不能保證一致性。因此，無血清培養(yǎng)技術(shù)開始引起人們重視。深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司在CN102268402A公開的“無血清培養(yǎng)基及CHO細胞中高效表達促紅細胞的培養(yǎng)方法”，是在培養(yǎng)基中添加正丁酸鈉、D-半乳酸、D-甘露糖、D-葡萄糖、N-乙?；咸烟侵械囊环N或多種，培養(yǎng)基是由DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基按一定比例配成。朱綠松等“重組人促紅素生產(chǎn)工藝研究”(《藥物研究》2001年第10卷第4期)中，也采用無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II進行生產(chǎn)研究，獲得了成功。但是，目前全球所有的無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)重組人紅細胞生成素技術(shù)，均與上述文獻一樣并不是全程無血清培養(yǎng)，均是僅在維持階段再轉(zhuǎn)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，而在細胞復蘇活化后的擴增培養(yǎng)階段仍然要用含有5%或10%胎牛血清的培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)。還未有在擴增階段采用無血清培養(yǎng)的研究和嘗試。所以目前現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)技術(shù)，雖然在生產(chǎn)維持階段采用無血清培養(yǎng)基有利于后續(xù)純化，使得純化過程最低可減少到三次層析，但因為在擴增階段都還是利用有血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，還不是真正意義上的無血清生產(chǎn)技術(shù)，前述第2、3項不足仍然存在。目前全球?qū)τ贓PO成品的下游處理一般進行三步以上的層析，例如CN102040695Ar “一種重組人促紅素分離純化方法”中，要經(jīng)過藍膠層析、超濾濃縮后進行離子交換層析1、C4反相層析、離子交換層析I1、S-200分子篩層析共5次層析，純化得到的 rHEPO達到99%以上，回收率只有15%。而基于維持階段無血清培養(yǎng)技術(shù)的三步層析技術(shù)， 是目前層析次數(shù)最少的分離純化工藝，例如而朱綠松等“重組人促紅素生產(chǎn)工藝研究”中分離純化則包括Blue Sepharose6F.F層析、Q Sepharose6F.F層析和Superdex75層析共三步層析，獲得半成品純度為99.14%，總回收率為45%。李琳等在“無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)重組人紅細胞生成素的純化”(生物化學與生物物理進展，1997，24 (2))—文中則是采用了 Rl反相層析、DEAE離子交換層析和S印hacryl S-200分子篩層析，獲得純度98%以上，總回收率 38.5%。
在工業(yè)化生產(chǎn)中，層析次數(shù)多，意味著生產(chǎn)周期長，成本高，原材料的浪費。因此， 如果能夠減少層析次數(shù)，不僅將對企業(yè)產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益，同時符合節(jié)約、環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展要求，同時具有很好的社會效益。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種全程無血清培養(yǎng)的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括擴增培養(yǎng)，其特征在于:擴增培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基是在DMEM中加入2-4% (wt%) Ultroser G和250_300mg/L正丁酸鈉以及2-3mg/L核黃素形成的培養(yǎng)基。
申請人經(jīng)過大量研究和試驗出人意料地發(fā)現(xiàn),2-4%Ultroser G加250_300mg/L正丁酸鈉、2-3mg/L核黃素，不僅能夠代替胎牛血清，而且細胞生長活力比5%血清要高的多。
更進一步地，本發(fā)明的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法中，分離純化采用二步層析法，即第一步采用反相層析去除沒有疏水性蛋白，第二步采用離子層析。
首先通過反相層析，去除沒有疏水性蛋白；利用EPO蛋白的疏水性進行分離，本發(fā)明利用反相層析在離子層析前一步，避免了去離子的麻煩，而且反相層析填料使用次數(shù)高， 回收率也較高。本發(fā)明反相層析是利用Best chrom公司的Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料，柱規(guī)格10cm*13cm。用30% (v%)乙醇-1.5mol/L脲40ml/min洗脫2個柱體積，60% (v%)乙醇-3.0mol/L脲40ml/min洗脫目的蛋白。這種反相層析能夠進行規(guī)模化生產(chǎn)，柱規(guī)格較大處理量也大。EPO回收率達到88%以上。
離子層析，利用EPO蛋 白電荷的特性進行分離，利用低pH處理，得到高質(zhì)量的蛋白。離子層析是利用Best chrom公司的DEAE Bestarose FF填料,柱規(guī)格5cm*8cm。用 pH4.2的6mol/L脲-lmmol/L甘氨酸-醋酸6ml/min洗脫3個柱體積，用20mmol/L朽1 檬酸鈉-0.3mmol/L檸檬酸溶液平衡到pH7.0 ;用20mmol/L檸檬酸鈉-0.3mmol/L檸檬酸-lOOmmol/L氯化鈉溶液洗脫目的蛋白，得到的目的蛋白為EPO原液?；厥章蔬_到60%以上。
本發(fā)明的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，在細胞培養(yǎng)時全程采用無血清培養(yǎng)， 避免了血清培養(yǎng)帶來的不足，同時使得收獲期增長，收獲量增大，提高了產(chǎn)量。二步層析純化方法，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，減輕了工作量和成本，增加了產(chǎn)率，使得EPO生產(chǎn)總回收率達到50%以上。而且蛋白產(chǎn)品質(zhì)量有了明顯提高，藥效更穩(wěn)定，目前市場EPO原液等電點在3.3-4.5，而該發(fā)明獲得的EPO電點達到3.3-4.15，并能確保所生產(chǎn)的EPO蛋白純度彡99%，離子洗脫液均采用人體可接受的緩沖液，所得產(chǎn)品可以直接用于成品藥物的生產(chǎn)。得到的產(chǎn)品的其他指標體內(nèi)外比活、純度(SDS-PAGE )、純度(HPLC-SEC )、分子量、紫外光譜、等電點、殘余外源DNA、內(nèi)毒素含量、唾液酸含量、CHO蛋白慘留、小牛血清殘留量、酶切胎圖譜、N-末端氨基酸序列分析都符合標準。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。下面實施例中Ultroser G在培養(yǎng)基中的百分含量均為質(zhì)量百分含量，乙醇含量為體積百分含量。實施例1培養(yǎng)基名稱:Ultroser G血清替代品；代號:15950_017 ;生產(chǎn)商:PALL。生產(chǎn)用rhRPO種子細胞:四環(huán)生物制藥構(gòu)建。rhEPO種子細胞復蘇后在3%Ultroser G+250mg/L正丁酸鈉+2mg/L核黃素+DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，2-3天傳代一次，細胞接種上罐后，葡萄糖糖值控制在lg/L，開始罐流，溫度37-38°C。罐內(nèi)細胞增殖培養(yǎng)6-8天后(增殖培養(yǎng)基:DMEM+2%:Ultroser G+300mg/L正丁酸鈉+2.5mg/L核黃素)，更換成無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II培養(yǎng)，收獲上清。收獲上清達到1200L,收獲期在30天，平均收獲上清40L/天，平均活性在12000IU/ml。實施例2rhEPO種子細胞復蘇后在2%Ultroser G+275mg/L正丁酸鈉+2.5mg/L核黃素+DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，2-3天傳代一次，細胞接種上罐后，葡萄糖糖值控制在lg/L，開始罐流，溫度37-38°C。罐內(nèi)細胞增殖培養(yǎng)6-8天后(增殖培養(yǎng)基:DMEM+4% =Ultroser G+250mg/L正丁酸鈉+2.5mg/L核黃素)，更換成無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II培養(yǎng)，收獲上清。收獲上清達到1250L,收獲期在30天，平均收獲 上清42L/天，平均活性在12000IU/ml。實施例3rhEPO種子細胞復蘇后在4%Ultroser G+300mg/L正丁酸鈉+3mg/L核黃素DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，2-3天傳代一次，細胞接種上罐后，葡萄糖糖值控制在lg/L，開始罐流，溫度37-38°C。罐內(nèi)細胞增殖培養(yǎng)6-8天后(增殖培養(yǎng)基:DMEM+4% =Ultroser G+300mg/L正丁酸鈉+3mg/L核黃素)，更換成無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II培養(yǎng)，收獲上清。采用UltroserG增殖細胞數(shù)量收獲上清達到1300L，收獲期在31天，平均收獲上清42L/天，平均活性在12000IU/mL.
對比例IrhEPO種子細胞復蘇后在5%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基，進行擴增培養(yǎng)，2-3天傳代一次，細胞接種上罐后，葡萄糖糖值控制在lg/L，開始罐流，溫度37-38°C。罐內(nèi)細胞增殖培養(yǎng)
6-8天后(增殖培養(yǎng)基:DMEM+5%胎牛血清)，更換成無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II培養(yǎng)，收獲上清?？墒斋@上清液300L，收獲期在20天，平均收獲上清15L/天，平均活性在12000IU/ml。與實施例1-3對比可以看出，實施例1-3中內(nèi)進行無血清擴增培養(yǎng)生產(chǎn)重組人促紅素，與傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)相比，收獲延長了 50%，每日收獲量提高了 2.7倍，總收獲量提供了 4倍。對比例2
rhEPO種子細胞復蘇后在3%Ultroser G+DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，2-3天傳代一次，細胞接種上罐后，葡萄糖糖值控制在lg/L，開始罐流，溫度37-38°C。罐內(nèi)細胞增殖培養(yǎng)6-8天后 (增殖培養(yǎng)基:DMEM+3%Ultroser G)，更換成無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II培養(yǎng)，收獲上清。收獲上清達到330L，收獲期在16天，平均收獲上清21L/天，平均活性在11000IU/ml。與有血清培養(yǎng)方式相當，收獲量和收獲期均低于實施例1-3。
實施例4
將實施例1獲得的上清液進行純化，過程為:
(I)反相層析
經(jīng)過過濾去除細胞碎片，上Butyl-S Bestarose6Fast Flow填料柱，柱規(guī)格 10cm*13cm。先用30%乙醇一1.5mol/L脲以40ml/min的流速洗脫2個柱體積,再用60%乙醇一3.0mol/L脲以40ml/min的流速洗脫目的蛋白，并收拾目的蛋白洗脫液。經(jīng)過檢測和計算，回收率為91%。
(2)離子交換層析
將收集到的目的蛋白洗脫液用20mmol/L檸檬酸鈉一0.3mmol/L檸檬酸溶液稀釋6倍，上 Best chrom 公司的 DEAE Bestarose FF 填料柱，柱規(guī)格 5cm*8cm。用 6mol/L 服一 lmmol/L甘氨酸-醋酸(pH4.2)以6ml/min的流速洗脫3個柱體積,再用20mmol/L朽1檬酸鈉一0.3mmol/L檸檬酸溶液平衡到pH7.0 ;最后用20mmol/L檸檬酸鈉一0.3mmol/L檸檬酸一lOOmmol/L氯化鈉溶液洗脫目的蛋白，得到的目的蛋白為EPO原液，該步驟回收率61%。 全程總回收率55.51%。
根據(jù)藥典標準進行檢測，等電點達到3.3-4.15，所生產(chǎn)的EPO蛋白純度>99%。得到的產(chǎn)品的其他指標體內(nèi)外比活、純度(SDS-PAGE )、純度(HPLC-SEC )、分子量、紫外光譜、 等電點、殘余外源DNA、內(nèi)毒素含量、唾液酸含量、CHO蛋白殘留、小牛血清殘留量、 酶切胎圖譜、N-末端氨基酸序列分析都符合標準。
權(quán)利要求
1.一種重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括擴增培養(yǎng)和分離純化，其特征在于: 擴增培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基為在DMEM中添加有2-4%Ultroser G和 250-300mg/L正丁酸鈉以及2_3mg/L核黃素形成的培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于:所述擴增培養(yǎng)是在所述無血清培養(yǎng)基內(nèi)，2-3天傳代一次，細胞接種上罐后用再所述無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖糖值控制在lg/L，開始罐流；罐內(nèi)細胞增殖培養(yǎng)6-8天后，更換成無血清培養(yǎng)基 CHO-S-SFM II培養(yǎng)，上獲收清液。
3.如權(quán)利要求2所述的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于所述分離純化采用二步層析法，其第一步層析為反相層析，第二步層析為離子層析。
4.如權(quán)利要求3所述的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述反相層析是利用 Best chrom 公司的 Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料,用 30% 乙醇-1.5mol/L 月尿 40ml/min洗脫2個柱體積,60%乙醇-3.0mol/L脲40ml/min洗脫目的蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料裝柱的柱規(guī)格為 10cm*13cm。
6.如權(quán)利要求4或5所述的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述離子層析是利用 Best chrom 公司的 DEAE Bestarose FF 填料，用 pH4.2 的 6mol/L 月尿-1mmoI /I, 甘氨酸-醋酸6ml/min洗脫3個柱體積，用20mmol/L檸檬酸鈉-0.3mmol/L檸檬酸溶液平衡到pH7.0 ;用20mmol/L朽1檬酸鈉-0.3mmol/L朽1檬酸-100mmol/L氯化鈉溶液洗脫目的蛋白，得到的目的蛋白為EPO原液。
7.如權(quán)利要 求6所述的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述DEAE Bestarose FF填料裝柱的柱規(guī)格5cm*8cm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括擴增培養(yǎng)和分離純化，其特征在于擴增培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基為在DMEM中添加有2-4%Ultroser G和250-300mg/L正丁酸鈉以及2-3mg/L核黃素形成的培養(yǎng)基。分離純化采用二步層析，其第一步層析為反相層析，第二步層析為離子層析。本發(fā)明的重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，在細胞培養(yǎng)時全程采用無血清培養(yǎng)，避免了血清培養(yǎng)帶來的不足，同時使得收獲期增長，收獲量增大，提高了產(chǎn)量。二步層析純化方法，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，減輕了工作量和成本，增加了產(chǎn)率，使得EPO生產(chǎn)總回收率達到50%以上。
文檔編號C07K1/20GK103205478SQ20131011645
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者程度勝, 韓明娣, 龍應國, 桑建彬, 張文學 申請人:北京四環(huán)生物制藥有限公司