一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其應(yīng)用以及重組人促紅素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體講，涉及一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其應(yīng)用以及重組人促紅素的制備方法。培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑中含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3和大豆蛋白水解液；還含有正丁酸鈉、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺。本發(fā)明提高了CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)階段表達(dá)量、提高了提高CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)階段表達(dá)高活性EPO的比例、延長了細(xì)胞在無血清狀態(tài)下存活的時(shí)間，提高了EPO的產(chǎn)量。
【專利說明】一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其應(yīng)用以及重組人促紅素的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體講，涉及一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其應(yīng)用以及重組人促紅素的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]促紅細(xì)胞生成素(簡稱促紅素Erythropoietin, ΕΡ0)是由腎臟和肝臟分泌的一種糖蛋白激素類內(nèi)源性生理物質(zhì)，能夠促進(jìn)自身紅細(xì)胞的生成。1989年6月，美國FDA正式批準(zhǔn)由安進(jìn)公司研制的重組人促紅素(r-HuEPO)上市，r-HuEPO由165個(gè)氨基酸組成，通過DNA重組技術(shù)獲得。重組人促紅素與人體內(nèi)源性EPO具有相同的生理活性。重組人促紅素，主要適應(yīng)癥為治療因慢性腎衰所引起的貧血癥、外科圍手術(shù)期的紅細(xì)胞動(dòng)員，目前也有報(bào)道應(yīng)用于治療癌癥病人接受化學(xué)藥物治療(簡稱化療)引起的貧血、糾正多發(fā)性骨髓瘤(MM)相關(guān)的貧血、早產(chǎn)兒貧血和孕婦妊娠期及產(chǎn)后貧血、艾滋病患者治療引起的貧血，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡及嚴(yán)重的寄生蟲病患者的慢性貧血、骨髓增生異常綜合性貧血、血紅蛋白病的鐮狀紅細(xì)胞貧血及地中海貧血、炎癥性腸疾患相關(guān)性貧血。還可應(yīng)用于增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力，減少高原反應(yīng)和需輸血的心絞痛患者。
[0003]重組人促紅素是由基因重組的CHO細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)后，無血清培養(yǎng)液經(jīng)過過濾、超濾、多步層析純化后制得。
[0004]重組人促紅素由165個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽和肽鏈上連接的糖基組成。分子量約為30，400道爾頓，其中肽鏈骨架約為18KD，肽鏈上有兩個(gè)二硫鍵位于Cys7和Cysl61，Cys29和Cys33之間；三個(gè)N-和一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)位于Asn24、Asn38、Asn83和Serl26。肽鏈通過四個(gè)糖基化位點(diǎn)與四個(gè)富含唾液酸的糖鏈相連?；蛑亟MCHO細(xì)胞的制備方法是，將EPOcDNA轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞后，經(jīng)克隆篩選(ELISA法)，初選表達(dá)陽性的克隆細(xì)胞系，再M(fèi)TX加壓篩選，獲得B4、C3、F1(1、G7、4個(gè)高表達(dá)EPO細(xì)胞系。對(duì)上述4系細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步檢測，證實(shí)Fltl細(xì)胞系無支原體污染。且表達(dá)量為四株中最高。對(duì)其進(jìn)行亞克隆純化，獲得分泌量最高的Fich6亞克隆株。對(duì)Fich6細(xì)胞株做進(jìn)一步亞克隆鑒定，共獲得15個(gè)亞克隆系，分別測定表達(dá)EPO水平，結(jié)果15個(gè)亞克隆系表達(dá)EPO水平相差不大，說明Fich6細(xì)胞株純度可
O
[0005]完全或部分失去唾液酸的重組人促紅素，進(jìn)入體液循環(huán)后，被肝臟中的半乳糖受體結(jié)合并迅速降解，從而影響其在體內(nèi)的半衰期；二、四分枝糖鏈形式的rHuEPO其體內(nèi)外活性有很大的區(qū)別，二分枝糖鏈的EPO的體內(nèi)活性只有標(biāo)準(zhǔn)EPO的1/7，而體外活性卻有其3倍。
[0006]為了進(jìn)一步提高重組人促紅素的活性，已公開一些現(xiàn)有技術(shù):
[0007]專利申請201110265828.6公開了一種重組人促紅素-CTP融合蛋白的生產(chǎn)工藝方法，其特點(diǎn)是重組工程細(xì)胞株的培養(yǎng)方式采用微載體懸浮灌注培養(yǎng)技術(shù)或無血清懸浮流加培養(yǎng)技術(shù)。
[0008]專利201110192509.7公開了一種用于CHO細(xì)胞表達(dá)促紅素的無血清培養(yǎng)基以及CHO細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法。無血清培養(yǎng)基中含有添加劑D-葡萄糖和正丁酸鈉，還含有添加劑D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一種或多種。
[0009]專利ZL201310116456.X公開了一種重組人促紅素的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括擴(kuò)增培養(yǎng)和分離純化，擴(kuò)增培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基為在DMEM中添加有2-4%Ultroser G和250_300mg/L正丁酸鈉以及2_3mg/L核黃素形成的培養(yǎng)基。該發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)全程采用無血清培養(yǎng)。上述兩種方法均采用罐培養(yǎng)技術(shù)，所需儀器復(fù)雜，投入成本高。
[0010]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，進(jìn)一步提高重組人促紅素的產(chǎn)量和活性，特提出本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種重組人促紅素高表達(dá)高活性的無血清培養(yǎng)基。
[0012]本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出了該重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出了一種重組人促紅素的制備方法。
[0014]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為:
[0015]一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑中含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3和大豆蛋白水解液。
[0016]本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為:所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為2.0~3.0g/L, NaHCO3的濃度為0.08~0.16g/L，大豆蛋白水解液的添加量為100~400ml/L ;優(yōu)選為:4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為2.3~2.7g/L,NaHCO3的濃度為0.10~0.13g/L，大豆蛋白水解液的添加量為200~400ml/L。
[0017]本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為:添加劑中還含有正丁酸鈉、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺。
[0018]本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為:正丁酸鈉的濃度為0.03g/L~0.2g/L，優(yōu)選
0.08~0.12g/L ；D-葡萄糖的濃度為1.0g/L~5.0g/L,優(yōu)選1.5~3.5g/L ；D-甘露糖的濃度為0.4g/L~2.5g/L，優(yōu)選0.5~1.5g/L ；D-半乳糖的濃度為0.4g/L~2.5g/L，優(yōu)選
0.5~1.5g/L ；N-乙酰葡萄糖胺的濃度為0.4g/L~2.5g/L,優(yōu)選0.5~1.5g/L。
[0019]本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為:基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自CHO SFM培養(yǎng)基，濃度為10~20g/L，優(yōu)選 13 ~15g/L。
[0020]本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為:所述培養(yǎng)基的pH為6.9~7.3,優(yōu)選6.9~7.2,滲透壓摩爾濃度為300~380m0smol.kg'優(yōu)選320~360m0smol.kg4。
[0021]本發(fā)明的第六優(yōu)選技術(shù)方案為:大豆蛋白水解液的制備方法為:取大豆蛋白粉10gJn 80~85°C熱水800mL，保持恒溫20~30分鐘，調(diào)節(jié)PH為5.0~7.0，加入2%的木瓜蛋白酶100ml，升溫至90~93°C保持20~30分鐘，用5 μ m的濾器過濾，加水至含氮量為 1.0wt % ο
[0022]本發(fā)明還涉及該無血清培養(yǎng)基在表達(dá)促紅細(xì)胞素中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明還涉及一種重組人促紅素的制備方法，將CHO細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇、傳代、采用含血清的培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)后，除去有血清培養(yǎng)液，接種于裝有本發(fā)明的培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行無血清培養(yǎng)，收獲上清液經(jīng)純化即得。培養(yǎng)的流程圖如圖2所示。
[0024]下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說明。
[0025]本發(fā)明通過研究得到了一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，添加劑中含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3、大豆蛋白水解液、正丁酸鈉、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。其中，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為2.0~3.0g/L、NaHCO3的濃度為0.08~0.16g/L、大豆蛋白水解液的添加量為100~400ml/L、正丁酸鈉的濃度為0.03g/L~0.2g/L、D-葡萄糖的濃度為1.0g/L~5.0g/L、D-甘露糖的濃度為0.4g/L~2.5g/L、D-半乳糖的濃度為0.4g/L~2.5g/L、N-乙酰葡萄糖胺的濃度為
0.4g/L~2.5g/L。優(yōu)選為:4_羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為2.3~2.7g/L, NaHCO3的濃度為
0.10~0.13g/L，大豆蛋白水解液的添加量為200~400ml/L、正丁酸鈉的濃度為0.08~
0.12g/L、D-葡萄糖的濃度為1.5~3.5g/L、D-甘露糖的濃度為0.5~1.5g/L、D-半乳糖的濃度為0.5~1.5g/L、N-乙酰葡萄糖胺的濃度為0.5~1.5g/L。其中，基本培養(yǎng)基采用GIBCO公司生產(chǎn)的302CH0 SFM培養(yǎng)基。
[0026]本發(fā)明中大豆蛋白水解液的制備方法為:所述大豆蛋白水解液的制備方法為:取大?蛋白粉(蛋白質(zhì)> 50%水份< 7%脂肪< 1%灰分< 4%纖維總量< 4% ) 10g,加80~85°C熱水800mL，保持恒溫20~30分鐘，調(diào)節(jié)PH為5.0~7.0,加入2wt%的木瓜蛋白酶100ml，升溫至90~93°C保持20~30分鐘，用5 μ m的濾器過濾，加水至含氮量為
1.0wt 優(yōu)選為取大豆蛋白粉100g，加85°C熱水800mL，保持恒溫30分鐘，調(diào)節(jié)PH為5.0~7.0，加入2wt%木瓜蛋白酶100ml，升溫至90°C保持30分鐘。
[0027] 本發(fā)明的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基的制備方法為:稱取CHO SFM培養(yǎng)基，按比例加入碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、正丁酸鈉、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺，加一定量水溶解后，加一定量的上述方法制備的大豆蛋白水解液并定容。將配制的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22 μ m濾膜過濾，即得。培養(yǎng)基的滲透壓摩爾濃度為300~38OmOsmoI.kg \ pH 為 6.9 ~7.3。
[0028]本發(fā)明在無血清培養(yǎng)基中加入一定比例的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、D_葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和大豆蛋白水解物，可控制CHO細(xì)胞的表達(dá)水平和表達(dá)產(chǎn)物的糖基化，同時(shí)有利于延長細(xì)胞在無血清狀態(tài)下存活的時(shí)間，從而可以保持細(xì)胞一次培養(yǎng)的不脫落時(shí)間由96小時(shí)延長至168小時(shí)。加入葡萄糖的作用是提供細(xì)胞代謝的能量和糖基生物合成的原料；加入甘露醇、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺的作用是提供細(xì)胞糖基和唾液酸合成的原料；加入大豆蛋白水解物的作用是提供細(xì)胞代謝和生物合成所必須的氨基酸、多糖和生胞生長及生物合成的各種細(xì)胞因子。加入4-羥乙基哌嗪乙磺酸，提高碳酸氫鈉的緩沖能力，保持細(xì)胞生長的適宜PH值范圍。
[0029]重組人促紅素為不同異構(gòu)體的混合物，通過等電聚焦和免疫印跡的方法可以分離出CHO細(xì)胞無血清上清培養(yǎng)液中的各種異構(gòu)體。研究表明，不同異構(gòu)體的等電點(diǎn)越低，即表明糖基化程和唾液酸含量越高，相應(yīng)的異構(gòu)體的體內(nèi)活性越高。EPO的糖基化程度決定了EPO在體內(nèi)的生物學(xué)活性和療效，不同的宿主細(xì)胞培養(yǎng)、純化過程和培養(yǎng)基成分，其糖基形式存在著明顯差異，它對(duì)糖蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能等方面起著較大影響，體現(xiàn)在蛋白的穩(wěn)定性、溶解性、免疫原性、體內(nèi)外生物活性、藥物動(dòng)力學(xué)和生物分配等。EPO糖基化的形成主要在無血清培養(yǎng)中的表達(dá)階段，控制無血清培養(yǎng)條件，可改善和提高CHO表達(dá)分泌EPO的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過等電聚焦和免疫印跡的方法可以從無血清上清培養(yǎng)液中分離出11種異構(gòu)體，而可利用的相對(duì)活性較高的異構(gòu)體為8個(gè)(即等電點(diǎn)在4.3以下的異構(gòu)體)，其中酸性條帶的異構(gòu)體所占的比例越高，體內(nèi)活性越高。體內(nèi)活性低的異構(gòu)體在后續(xù)的純化階段會(huì)被去除。通過調(diào)整CHO細(xì)胞在無血清階段的培養(yǎng)條件可改善CHO細(xì)胞產(chǎn)出的EPO的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加有效的EPO的產(chǎn)量，提高純化收率。
[0030]在重組人促紅素的無血清培養(yǎng)階段，為細(xì)胞的維持培養(yǎng)，不含促進(jìn)細(xì)胞增殖的血清成分。細(xì)胞在維持培養(yǎng)階段需要大量的能量及有效代謝產(chǎn)物(重組人促紅素)所需的各種糖、氨基酸及調(diào)控因子。通過調(diào)整培養(yǎng)液的成份，可延長細(xì)胞在維持培養(yǎng)階段的存活率和存活時(shí)間。
[0031]蛋白水解物是蛋白質(zhì)經(jīng)過酶、酸或者堿水解之后得到的產(chǎn)品，其主要成分為肽類。此外，還包括含少量氨基酸、糖、脂類、礦物質(zhì)和維生素等物質(zhì)。蛋白水解物可優(yōu)化動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成，并且其中所含部分肽段可作為外部分子信號(hào)對(duì)細(xì)胞代謝、生物合成、生長、凋亡及產(chǎn)物表達(dá)等生命活動(dòng)產(chǎn)生特殊的調(diào)控作用，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。在無血清培養(yǎng)基中加入某些蛋白水解物，可從根本上改善細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的整體性能，進(jìn)而影響細(xì)胞代謝、增殖、生物合成及蛋白表達(dá)。
[0032]本發(fā)明的有益效果為:
[0033]1.本發(fā)明提高了 CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)階段表達(dá)量，表達(dá)量可由原來的10000IU/ml提高至18000IU/ml以上。
[0034]2.本發(fā)明提高了 CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)階段表達(dá)高活性EPO的比例，使用高活性的EPO比例由30%提高至50%，使純化的收率提高至少60%。
[0035]3.本發(fā)明延長了細(xì)胞在無血清狀態(tài)下存活的時(shí)間，從而可以保持細(xì)胞總的不脫落時(shí)間由8天延長至21~22天。細(xì)胞培養(yǎng)液收獲次數(shù)由2次延長至3次，提高了單位CHO細(xì)胞的EPO表達(dá)量。
[0036]4.本發(fā)明采用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)工藝，無需特殊設(shè)備，投入成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。并且采用本發(fā)明的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)，收獲得到的細(xì)胞培養(yǎng)液中EPO的濃度高，獲得單位EPO所需的培養(yǎng)液用量低，可為企業(yè)節(jié)約成本，提高收益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明的上清收獲液等電聚焦/免疫印跡圖譜。
[0038]圖2為本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)流程。
[0039]圖3為一個(gè)培養(yǎng)周期中表達(dá)量與培養(yǎng)時(shí)間關(guān)系圖。
[0040]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】僅限于進(jìn)一步解釋和說明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。

【具體實(shí)施方式】
[0041]實(shí)施例1~7:
[0042]無血清培養(yǎng)基的制備方法為:按表1所示稱取CHO SFM培養(yǎng)基，按比例加入碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、正丁酸鈉、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺，加一定量水溶解后，加一定量的上述方法制備的大豆蛋白水解液并定容至1L。將配制的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22 μ m濾膜過濾，即得,培養(yǎng)基的滲透壓摩爾濃度為320~360m0smol.kg-1, pH為 6.9 ~7.2。
[0043]其中:原型培養(yǎng)基采用GIBCO公司生產(chǎn)的302CH0 SFM培養(yǎng)基。大豆蛋白水解液的制備方法為:取大?蛋白粉10g(蛋白質(zhì)> 50%水份< 7%脂肪< I %灰分< 4%纖維總量≤4% )，加85°C熱水800mL，保持恒溫30分鐘，調(diào)節(jié)PH為5.0~7.0，加入木瓜蛋白酶(2% ) 100ml，升溫至90°C保持30分鐘，用0.5um的濾膜過濾，加水至含氮量為1.0%。
[0044]表1

【權(quán)利要求】
1.一種重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑中含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3和大豆蛋白水解液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為2.0~3.0g/L, NaHCO3的濃度為0.08~0.16g/L，大豆蛋白水解液的添加量為100~400ml/L ;優(yōu)選為:4_羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為2.3~2.7g/L, NaHCO3的濃度為0.10~0.13g/L，大豆蛋白水解液的添加量為200~400ml/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加劑中還含有正丁酸鈉、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的正丁酸鈉的濃度為0.03g/L~0.2g/L,優(yōu)選0.08~0.12g/L ;D_葡萄糖的濃度為1.0g/L~5.0g/L，優(yōu)選1.5~3.5g/L ；D-甘露糖的濃度為0.4g/L~2.5g/L，優(yōu)選0.5~1.5g/L ；D-半乳糖的濃度為0.4g/L~2.5g/L，優(yōu)選0.5~1.5g/L ；N-乙酰葡萄糖胺的濃度為0.4g/L~2.5g/L，優(yōu)選 0.5 ~1.5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自CHOSFM培養(yǎng)基，濃度為10~20g/L，優(yōu)選13~15g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的PH為6.9~7.3，優(yōu)選為6.9~7.2，滲透壓摩爾濃度為300~380m0smol.kg'優(yōu)選為320 ~360m0smol.kg 1O
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述大豆蛋白水解液的制備方法為:取大豆蛋白粉10gJp 80~85°C熱水800mL，保持恒溫20~30分鐘，調(diào)節(jié)PH為5.0~7.0，加入2wt%的木瓜蛋白酶100ml，升溫至90~93°C保持20~30分鐘,用5μπι的濾器過濾，加水至含氮量為1.0wt%。
8.一種如權(quán)利要求1~7任一權(quán)利要求所述的重組人促紅素的無血清培養(yǎng)基在表達(dá)重組人促紅素中的應(yīng)用。
9.一種重組人促紅素的制備方法，其特征在于，將CHO細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇、預(yù)培養(yǎng)、采用含血清的培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)后，除去有血清培養(yǎng)液，接種于權(quán)利要求1~7任一權(quán)利要求所述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶進(jìn)行無血清 培養(yǎng)，收獲上清液經(jīng)純化即得。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104130971SQ201410393381
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】閆亞梅, 韓飛宇 申請人:山西威奇達(dá)光明制藥有限公司