碳氟連接的肽制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種適合用于制備可藥用碳氟連接的肽制劑的水性酸性制劑，所述水性酸性制劑包含第一碳氟連接的肽，其中：連接到所述碳氟的所述肽為長(zhǎng)度至少20個(gè)氨基酸殘基，包含至少50%的疏水性氨基酸殘基并具有大于或等于7的等電點(diǎn)；并且所述碳氟連接的肽以微團(tuán)存在。
【專利說明】碳氟連接的肽制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及包含碳氟連接的肽的可藥用制劑、用于制備這類可藥用制劑的制劑、制備這類制劑的方法以及這類制劑作為疫苗和免疫治療劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]將合成肽抗原用于疫苗以預(yù)防感染性疾病(例如病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲感染和真菌感染)受到關(guān)注。合成肽抗原在免疫治療劑領(lǐng)域——包括治療感染、刺激對(duì)癌細(xì)胞的免疫、下調(diào)多肽激素以及控制不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答例如過敏反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)一也受到關(guān)注。
[0003]實(shí)際使用基于肽的疫苗和免疫治療中的一個(gè)難點(diǎn)是確保通過有效地遞送肽抗原至抗原呈遞細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。如果沒有這種靶向作用，則可能需要難以實(shí)施的量的肽，這不僅在制造上是不經(jīng)濟(jì)的而且也會(huì)導(dǎo)致毒性問題。
[0004]肽遞 送的增強(qiáng)可通過專門的遞送載體來實(shí)現(xiàn)，例如能夠持續(xù)釋放的基于微粒的結(jié)構(gòu)。另外，已經(jīng)開發(fā)了包含共價(jià)連接到遞送增強(qiáng)劑的目的肽的肽衍生物或修飾肽，以改進(jìn)生物利用度及呈遞所述肽至特定靶細(xì)胞和受體。
[0005]通過將碳氟鏈共價(jià)連接至肽N末端或C末端，或兩者之間的任何位置以產(chǎn)生碳氟連接的肽(FCP)而構(gòu)建了被修飾以改善至抗原呈遞細(xì)胞的遞送的一類具體肽。碳氟連接的肽的實(shí)例在W02005/099752和W02009/027688中給出，其中提供了在增強(qiáng)對(duì)所述肽的免疫應(yīng)答中由碳氟連接賦予的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]疫苗設(shè)計(jì)者會(huì)理解，可能需要多于一種肽以提供更寬的預(yù)防或免疫治療效果。這類多組分產(chǎn)品是合乎需要的，因?yàn)樗鼈兒芸赡芨行У丶ぐl(fā)恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。
[0007]為了制造該性質(zhì)的藥劑，必須合成、純化、以恰當(dāng)?shù)谋壤旌纤鎏挤B接的肽，使其無菌并以適于給藥的同質(zhì)形式提供。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，碳氟連接的肽經(jīng)常難溶于水性介質(zhì)，例如水或磷酸鹽緩沖鹽水，即使當(dāng)未連接的肽可溶于水性介質(zhì)時(shí)也如此。他們還發(fā)現(xiàn)，碳氟連接的肽中肽組分的長(zhǎng)度和疏水性影響所述碳氟連接的肽的溶解性。尤其地，已發(fā)現(xiàn)連接到顯示出更好免疫遺傳性質(zhì)的更長(zhǎng)、疏水性更強(qiáng)的肽的碳氟載體是尤其不溶的。
[0009]碳氟連接的肽是雙親性的，并特征性地在極性(質(zhì)子和非質(zhì)子)溶劑和非極性溶劑中形成多分子微團(tuán)型結(jié)構(gòu)。天然未連接的肽通常不形成這類結(jié)構(gòu)。但是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，許多碳氟連接的肽，尤其是具有最佳免疫原性性質(zhì)的那些，在水性介質(zhì)和其他溶劑中傾向于形成大的可見聚集體。這類聚集體的形成在需要產(chǎn)生同質(zhì)的、可表征的制劑的藥物制造過程中是不可接受的。
[0010]已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了該問題，本發(fā)明人已經(jīng)將其解決并設(shè)計(jì)了一種制備碳氟連接的肽制劑的方法，其中維持了支持所述碳氟連接的肽的溶解性的超分子結(jié)構(gòu)。發(fā)明人開發(fā)的配制方法使得有可能制造包含以前被發(fā)現(xiàn)難以配制的免疫原性的碳氟連接的肽的穩(wěn)定產(chǎn)品，所述產(chǎn)品可用水性介質(zhì)容易地復(fù)原以獲得可藥用溶液。
[0011]具體地，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，使用酸性溶液可促進(jìn)微團(tuán)形成并避免不溶性聚集體的形成。所述溶解的碳氟連接的肽可通過過濾除菌，而不損失溶液中的碳氟連接的肽。在冷凍干燥之后，通常在冷凍保護(hù)劑的存在下，可將碳氟連接的肽以穩(wěn)定的形式儲(chǔ)存并溶解于水性介質(zhì)中以獲得用于給藥的可藥用溶液。
[0012]發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于寬范圍的碳氟連接的肽，乙酸是尤其適合的溶劑，盡管不同肽的電荷和疏水性具有高度的可變性。因此，乙酸也尤其適用于溶解碳氟連接的肽的混合物。
[0013]因此，本發(fā)明提供了一種適合用于制備可藥用碳氟連接的肽制劑中的水性酸性制齊U，所述制劑包含第一碳氟連接的肽，其中:
[0014](i)連接到所述碳氟的肽為長(zhǎng)度至少20個(gè)氨基酸殘基，包含至少50%的疏水性氨基酸殘基并且具有大于或等于7的等電點(diǎn)；并且
[0015](ii)所述碳氟連接的肽以直徑小于0.22 μ m的微團(tuán)存在。
[0016]優(yōu)選地，所述制劑包含乙酸。所述水性制劑可具有例如5或小于5的pH。
[0017]所述制劑可包含存以直徑小于0.22 μ m的微團(tuán)存在的一種或多種另外的碳氟連接的肽。優(yōu)選地，所述制劑中存在的至少80%的碳氟連接的肽微團(tuán)具有小于IOOnm的直徑。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑不包含這樣的碳氟連接的肽，即其中連接到所述碳氟的所述肽:(i)具有小于7的等電點(diǎn)；(ii)在所述碳氟遠(yuǎn)端的最后15個(gè)連續(xù)氨基酸中不包含帶正電的氨基酸；并且/或者( iii)包含含有多于80%的疏水性氨基酸殘基的20個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
[0019]連接到所述碳氟的所述肽通常是衍生自病原體、自體蛋白或腫瘤細(xì)胞的免疫原性肽。本發(fā)明的制劑還可包含可藥用載體或稀釋劑和/或佐劑。
[0020]本發(fā)明還提供了:
[0021]-一種獲得可藥用的碳氟連接的肽制劑的方法，所述方法包含:
[0022](i)將碳氟連接的肽溶解于乙酸；
[0023](ii)將所述溶解的碳氟連接的肽過濾除菌；和
[0024](iii)干燥所述過濾除菌的碳氟連接的肽。
[0025]-一種可通過本發(fā)明的方法獲得的碳氟連接的肽制劑；
[0026]-一種包含6種碳氟連接的肽的可藥用制劑，其中連接到所述碳氟的肽包含SEQID NO: 1-6中列出的序列，并且其中所述制劑不包含其他碳氟連接的肽；
[0027]-一種本發(fā)明的可藥用制劑，用于通過療法來治療人體或動(dòng)物體的方法中；
[0028]-一種本發(fā)明的可藥用制劑，用于治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法中；
[0029]-本發(fā)明的可藥用制劑在制造用于治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的藥劑中的用途；以及
[0030]-一種治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法，所述方法包含向需要其的個(gè)體給予有效量的本發(fā)明的可藥用制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】[0031]圖1示出了典型的碳氟連接的肽制造過程流程的實(shí)例。
[0032]圖2示出了備選的碳氟連接的肽制造過程流程。
[0033]圖3的表示出溶于多種溶劑的各個(gè)FCP的目視檢查結(jié)果。漩渦后目視檢查每種溶液的澄清度，對(duì)于澄清溶液指定“+++”的得分至對(duì)于高度渾濁的溶液指定的得分。還記錄了泡沫形成程度和微粒的存在情況，“+++”表示高水平，表示均不存在。“ * ”表示溶液變粘稠。
[0034]圖4的表示出用甘露醇溶液稀釋后溶于每種溶劑中的各個(gè)FCP的目視檢查的結(jié)果。目視檢查每種溶液的澄清度，對(duì)于澄清溶液指定“+++”的得分至對(duì)于高度渾濁的溶液指定的得分。還記錄了泡沫形成程度和微粒的存在情況，“+++”表示高水平，表示均不存在。
[0035]圖5示出了通過動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)評(píng)估的混合和稀釋后溶液中碳氟連接的肽的粒度。
[0036]圖6示出了通過透射電子顯微術(shù)(TEM)評(píng)估的混合和稀釋后溶液中碳氟連接的肽顆粒的大小和形狀。
[0037]圖7示出了通過DLS評(píng)估的在除菌級(jí)過濾之前㈧和之后⑶的碳氟連接的肽顆粒的以體積表示的大小分布。
[0038]圖8示出了通過DLS評(píng)估的在TrislOmM pH7.85 (A)和水(B)中復(fù)原的碳氟連接的肽顆粒的以體積表示的大小分布。
[0039]圖9示出了暴露于50% (v/v)乙酸中24小時(shí)的7種碳氟連接的肽的混合物的RP-HPLC分析的結(jié)果。
[0040]圖10示出了用 手搖動(dòng)后，碳氟連接的肽的經(jīng)配制混合物和未經(jīng)配制混合物的照片。瓶A:經(jīng)配制的+甘露醇/水；瓶8:經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸；瓶(::未經(jīng)配制的+甘露醇/水；瓶D:未經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸。
[0041]圖11示出了漩渦和超聲后的碳氟連接的肽的經(jīng)配制混合物和未經(jīng)配制混合物的照片。瓶A:配制的+甘露醇/水；瓶8:經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸；瓶(::未經(jīng)配制的+甘露醇/水；瓶D:未經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸。
[0042]圖12示出了包含6種碳氟連接的流感肽的制劑(FP-01.1)的透射電子顯微鏡照片。
[0043]圖13示出了過濾后的FR01.1在tQ (上圖)和24小時(shí)后(下圖)的HPLC譜。
[0044]圖14示出了在水中復(fù)原后FP01.1的HPLC譜。
[0045]圖15示出了在水中復(fù)原的經(jīng)配制的碳氟肽(FP01.1)和未經(jīng)配制的肽的比較。左照片在20分鐘靜置后拍攝，右照片在3分鐘超聲處理后拍攝。
[0046]圖16示出了在28mM L-組氨酸中復(fù)原的經(jīng)配制的碳氟肽(FP01.1)與未經(jīng)配制的肽的比較。左照片在20分鐘靜置后拍攝，右照片在3分鐘超聲處理后拍攝。
[0047]圖17示出了大鼠中的體積調(diào)整的劑量應(yīng)答。在測(cè)試的所有劑量水平下，F(xiàn)P-O1.1以劑量依賴的形式誘導(dǎo)了陽(yáng)性IFN-YT細(xì)胞應(yīng)答。
[0048]圖18示出了使用體外IFN-YELISpot測(cè)定觀察到的疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。用6種個(gè)體肽(對(duì)應(yīng)于所述疫苗中含有的肽)刺激PBMC18小時(shí)。陽(yáng)性測(cè)定響應(yīng)被定義為陰性對(duì)照孔中斑點(diǎn)數(shù)的平均值+所述平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算了 6種肽的每一個(gè)的斑點(diǎn)數(shù)以獲得“長(zhǎng)肽的總和”，并表示為每一百萬輸入的PBMC的斑點(diǎn)數(shù)。
[0049]序列說明
[0050]對(duì)應(yīng)于實(shí)施例中使用的肽的序列表如下表所示。
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種適合用于制備可藥用碳氟連接的肽制劑的水性酸性制劑，所述制劑包含第一碳氟連接的肽，其中: (i)連接到所述碳氟的所述肽為長(zhǎng)度至少20個(gè)氨基酸殘基，包含至少50%的疏水性氨基酸殘基并且具有大于或等于7的等電點(diǎn)；并且 (?)所述碳氟連接的肽以小于0.22 μ m的直徑的微團(tuán)存在。
2.權(quán)利要求1的制劑，其包含乙酸。
3.權(quán)利要求1或2的制劑，其具有5或小于5的pH。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的制劑，還包含以小于0.22 μ m的直徑的微團(tuán)存在的一種或多種另外的碳氟連接的肽。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的制劑，其中至少80%的所述碳氟連接的肽微團(tuán)具有小于IOOnm的直徑。
6.權(quán)利要求4或5的制劑，其中所述另外的碳氟連接的肽中的一種或多種包括這樣的肽: (i)長(zhǎng)度為至少20個(gè)氨基酸殘基； (?)包含至少50%的疏水性氨基酸殘基；并且/或者 (iii)具有大于或等于7的等電點(diǎn)；并且/或者 所述第一碳氟連接的肽和/或所 述另外的碳氟連接的肽中的一種或多種包括這樣的肽: (iv)在所述碳氟遠(yuǎn)端的最后15個(gè)連續(xù)氨基酸中包含帶正電的氨基酸；并且/或者 (v)不包含含有多于80%的疏水性氨基酸殘基的20個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的制劑，其中所述制劑不包含這樣的碳氟連接的肽，即其中連接到所述碳氟的肽: (i)具有小于7的等電點(diǎn)； (?)在所述碳氟遠(yuǎn)端的最后15個(gè)連續(xù)氨基酸中不包含帶正電的氨基酸；并且/或者 (iii)包含含有多于80%的疏水性氨基酸殘基的20個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的制劑，其中連接到所述碳氟的所述肽為衍生自病原體、自體蛋白或腫瘤細(xì)胞的免疫原性肽。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的制劑，包含6種碳氟連接的肽，其中連接到所述碳氟的所述肽具有SEQ ID NO: 1-6中列出的序列，并且其中所述制劑不包含其他的碳氟連接的肽。
10.一種獲得可藥用碳氟連接的肽制劑的方法，所述方法包括: (i)將碳氟連接的肽溶解于乙酸； (?)將所述溶解的碳氟連接的肽過濾除菌；和 (iii)干燥所述過濾除菌的碳氟連接的肽。
11.權(quán)利要求10的方法，其中連接到所述碳氟的所述肽為長(zhǎng)度至少20個(gè)氨基酸殘基，并且包含至少50%的疏水性氨基酸殘基并且具有大于或等于7的等電點(diǎn)。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中: (i)將所述碳氟連接的肽與一種或多種另外的碳氟連接的肽的混合物溶解于乙酸；并且/或者 (?)所述方法還包括將所述溶解的碳氟連接的肽與一種或多種另外的溶解的碳氟連接的肽混合。
13.權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的方法，其中所述乙酸為5-80%(v/v)乙酸水溶液。
14.權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中所述溶解的碳氟連接的肽通過冷凍干燥進(jìn)行干燥。
15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，還包括將所述經(jīng)干燥的碳氟連接的肽在水相中復(fù)原。
16.權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(ii)之前加入可藥用載體、稀釋劑和/或佐劑。
17.權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)的方法，還包括將所述經(jīng)干燥或復(fù)原的碳氟連接的肽保存在無菌容器中。
18.權(quán)利要求10-17任一項(xiàng)的方法，其中連接到所述碳氟的所述肽為衍生自病原體、自體蛋白或腫瘤細(xì)胞的免疫原性肽。
19.一種可通過權(quán)利要求10-18任一項(xiàng)的方法獲得的制劑。
20.一種包含6種碳氟連接的肽的可藥用制劑，其中連接到所述碳氟的所述肽具有SEQID NO: 1-6中列出的序列，并且其中所述制劑不包含其他的碳氟連接的肽。
21.權(quán)利要求20的制劑，還包含可藥用載體或稀釋劑和/或佐劑。
22.權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的制劑，用于通過療法治療人體或動(dòng)物體的方法中。
23.權(quán)利要求19的制劑，用于治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法中。
24.權(quán)利要求20或21的制劑用于治療或預(yù)防流行性感冒的方法中。
25.用于權(quán)利要求24的用途的制劑，其中所述方法包括與季節(jié)性流感疫苗相結(jié)合給予所述制劑。
26.權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的制劑在制造用在治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法中的藥劑中的用途。
27.一種治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的制劑。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103429259SQ201180067838
【公開日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月31日
【發(fā)明者】C·B·布朗, B·V·G·喬治斯, J·F·施博萊特 申請(qǐng)人:免疫目標(biāo)指定系統(tǒng)(Its)有限公司