本發(fā)明屬于檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種雙酚a的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題嚴(yán)重危害人類健康，已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。由于表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(sers)具有低檢測(cè)限、窄光譜帶寬等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，特別是納米材料學(xué)的發(fā)展，使得sers在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用逐年增多。同傳統(tǒng)紅外光譜法相比，sers技術(shù)不僅能提供被檢測(cè)物詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)由于水分子的拉曼散射截面小，從而可以忽視背景從水相體系中直接有效地獲得生物分子的振動(dòng)信息進(jìn)而檢測(cè)生物分子，甚至其檢測(cè)限可達(dá)單分子水平。由于sers具有低檢測(cè)限、窄光譜帶寬、熒光猝滅能力和無(wú)光學(xué)標(biāo)簽使用限制等諸多優(yōu)點(diǎn)，使得sers廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、dna/rna分析及檢測(cè)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)、醫(yī)療診斷和化學(xué)試劑檢測(cè)等。在上述的研究背景下，本發(fā)明將引用基于高增強(qiáng)因子金/銀納米材料的sers技術(shù)在食品安全檢測(cè)方法方面開(kāi)展工作，以目前常見(jiàn)的導(dǎo)致食品安全問(wèn)題的物質(zhì)雙酚a(bpa)為研究對(duì)象，建立具有高靈敏度和高特異性的檢測(cè)新方法，拓寬拉曼光譜技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，建立新型簡(jiǎn)單、快速靈敏的檢測(cè)方法來(lái)滿足食品安全檢測(cè)領(lǐng)域日益增長(zhǎng)的檢測(cè)需求。

分子的拉曼散射是一種非彈性的散射過(guò)程，其散射截面約為10-29cm²/分子。同其他光學(xué)過(guò)程如熒光(10-19cm²/分子)的橫截面相比，拉曼散射是一種很弱的現(xiàn)象，這導(dǎo)致常規(guī)拉曼散射在測(cè)量低濃度分子時(shí)一般都存在嚴(yán)重的缺陷(尤其是背景熒光比較突出的時(shí)候)。雖然已有許多科研者對(duì)sers技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，但同其他檢測(cè)技術(shù)(如常規(guī)光譜檢測(cè)技術(shù)、色譜檢測(cè)技術(shù)和生物檢測(cè)技術(shù)等)一樣，sers技術(shù)的應(yīng)用仍有很大的局限性。比如大部分sers基底增強(qiáng)效應(yīng)偏低、sers檢測(cè)模式不夠多樣化等缺陷，這些因素導(dǎo)致sers技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中于定性分析，在定量方面尚未成為人們依賴的檢測(cè)手段。因此建立應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的基于sers的新型定量方法仍十分迫切。

酶引導(dǎo)晶體成長(zhǎng)策略是以酶作為一種高效的催化劑催化底物產(chǎn)生還原劑，可通過(guò)還原劑還原金屬離子(主要是au³⁺/ag⁺)并沉積在納米粒子表面。因此，通過(guò)酶來(lái)引導(dǎo)控制晶體生長(zhǎng)過(guò)程，協(xié)調(diào)其物理化學(xué)性質(zhì)，并決定晶體納米結(jié)構(gòu)的形狀和大小?；诮Y(jié)合酶的高效催化特性和金屬沉積物的高靈敏spr-響應(yīng)，因此對(duì)于酶-引導(dǎo)銀沉積的研究更為廣泛。雖然酶-引導(dǎo)銀沉積已被應(yīng)用于多種方法中，但目前還沒(méi)有人將其應(yīng)用于sers傳感器設(shè)計(jì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)本領(lǐng)域存在的不足之處，本發(fā)明提出一種酶引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)增強(qiáng)拉曼光譜表面效應(yīng)檢測(cè)雙酚a的方法，利用適配體互補(bǔ)鏈(dna2)與信標(biāo)4-硝基苯硫酚(4-ntp)功能化的auns為sers探針，建立一種基于葡萄糖氧化酶酶-引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)策略的超靈敏檢測(cè)目標(biāo)物雙酚a的sers方法，拓寬sers的檢測(cè)模式及范圍。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為：

一種酶引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)增強(qiáng)拉曼光譜表面效應(yīng)檢測(cè)雙酚a的方法，包括步驟：

(1)適配體(aptamer；apt)與葡萄糖氧化酶(gox)偶聯(lián)物的制備：適配體溶液和葡萄糖氧化酶、偶聯(lián)劑的溶液混合，制備適配體與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)物(apt-gox)溶液；所述偶聯(lián)劑為4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽；

(2)auns的制備：通過(guò)向haucl4溶液中加入檸檬酸三鈉，獲得au種的溶液；將au種的溶液加入到haucl4溶液中，同時(shí)迅速加入抗壞血酸(aa)和agno3溶液，室溫孵化直至溶液由淺紅變?yōu)槟G色。

(3)功能化auns的制備：向步驟(2)制備的auns溶液中加入與所述巰基化的適配體互補(bǔ)的dna2溶液，再加入4-硝基苯硫酚(4-ntp)乙醇溶液，常溫振蕩孵化10～15h，通過(guò)固液分離除去多余的dna2和4-硝基苯硫酚，沉積物復(fù)溶于超純水中。

(4)auns-gox探針的制備：向步驟(3)得到的功能化auns溶液中加入適配體與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)物(apt-gox)溶液，再加入不同濃度的雙酚a標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。常溫孵化后，固液分離，固體物復(fù)溶于2-(n-嗎啉)-乙磺酸(mes)緩沖液中。我們將這種混合物命名為auns-gox探針溶液。

(5)auns的ag殼生長(zhǎng)；

向步驟(4)得到的auns-gox探針溶液中加入葡萄糖溶液，孵化1h后加入agno3，常溫孵化2h后測(cè)定表面增強(qiáng)拉曼散射sers信號(hào)。

其中，步驟(1)中，取0.1～0.3m巰基化的適配體溶液和(0.5～2)×10^-5m葡萄糖氧化酶溶液、(1～10)×10^-4m偶聯(lián)劑的溶液混合，適配體溶液、葡萄糖氧化酶溶液、偶聯(lián)劑溶液的體積比為1:100:(20～40)。

本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案之一為，步驟(1)中，所述巰基化的寡核苷酸溶液通過(guò)以下方法得到：巰基化的寡核苷酸溶解于ph為7.5～8.5的緩沖液中，配成100μm的溶液，再加入20～40倍體積的15mm三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液(tcep)在20～30℃下孵化1～3h，4℃保藏。所述緩沖液為tris、hcl、edta、吐溫、磷酸鹽中的一種或多種配制而成。

其中，步驟(1)中，所述葡萄糖氧化酶、偶聯(lián)劑溶液是：濃度為1×10^-5m的葡萄糖氧化酶，濃度為5×10^-4msulfo-smcc偶聯(lián)劑在ph7.4的pb緩沖液中配制，然后孵化30～50min。

其中，步驟(2)中，au種的溶液濃度為10～20nm，haucl4溶液濃度為0.1～0.5mm，au種加入到haucl4溶液后，迅速加入濃度為0.1m抗壞血酸(aa)和1mm的agno3溶液，au種溶液、haucl4溶液抗壞血酸、agno3溶液體積比為0.1～0.3：20：0.05～0.2：0.05～0.2。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，先向auns溶液中加入濃度為50～200μm的dna2溶液，常溫振蕩孵化3h，再加入1mm的4-ntp乙醇溶液，auns溶液、dna2溶液，4-ntp乙醇溶液的體積比為1000：0.5～3：1～10。

其中，步驟(4)中，向功能化auns溶液中加入10^-13g/ml適配體與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)物(apt-gox)，再加入濃度為0、10^-18g/ml～10^-12g/ml系列濃度的雙酚a標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。

固體物復(fù)溶于的2-(n-嗎啉)-乙磺酸(mes)緩沖液可以為10mm，ph5.9的緩沖液。步驟(4)常溫孵化的時(shí)間可以是7～10h。

其中，步驟(5)具體為：向auns-gox探針溶液中加入100mm葡萄糖溶液，孵化1h后加入0.1mm的agno3和40mm氨水溶液，常溫孵化測(cè)定表面增強(qiáng)拉曼散射sers信號(hào)，

其中，拉曼檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為50～820nm，測(cè)定1300～14001339cm^-1處的sers峰為4-ntp的特征峰。具體可以是激發(fā)波長(zhǎng)為785nm，1339cm^-1處的sers峰為4-ntp的特征峰。

更進(jìn)一步地，所述方法還包括操作：構(gòu)建表面增強(qiáng)拉曼散射sers信號(hào)和雙酚a標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液濃度的數(shù)學(xué)關(guān)系；對(duì)未知雙酚a含量的樣品進(jìn)行同樣檢測(cè)，求得樣品中雙酚a含量。

本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明成功制備了一種基于auns檢測(cè)雙酚a的超靈敏sers傳感器。首次將酶-引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)策略應(yīng)用于構(gòu)建sers生物傳感器。建立了目標(biāo)物濃度與sers特征峰信號(hào)強(qiáng)度之間的線性關(guān)系，檢測(cè)限低至10-16g/ml，低于目前報(bào)道的多數(shù)方法，可實(shí)現(xiàn)食品安全中雙酚a的超靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明的關(guān)鍵在于使用銀原子沉積于金納米星表面作為拉曼-活性基底，相比于常規(guī)的aunps和agnps，靈敏度更高；與其他的基于酶-引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)策略方法相比，如：比色法(紫外-可見(jiàn)光譜法)相比(檢測(cè)限4.9×10^-11g/ml)，本方法使用的sers具有更高的靈敏度。

本發(fā)明結(jié)合葡萄糖氧化酶催化反應(yīng)和auns-沉積銀殼的放大效果，進(jìn)一步提高了本傳感器的靈敏度。

附圖說(shuō)明

圖1為auns在晶體生長(zhǎng)前(圖1之a(chǎn))和晶體生長(zhǎng)后(圖1之b)的透射電鏡圖；

圖2為auns在不同狀態(tài)時(shí)的動(dòng)態(tài)光散射(dls)分布圖，

圖3為4-ntp在不同狀態(tài)時(shí)的sers光譜，

圖4之a(chǎn)為添加不同濃度bpa時(shí)4-ntp的sers光譜；圖4之b為bpa檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，

圖5為基于酶-引導(dǎo)銀沉積的sers傳感器超靈敏檢測(cè)bpa原理示意圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段，為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段。

本發(fā)明涉及的巰基化的適配體dna1、dna2為

適配體apt(dna1):5-sh-(t)10-ccggtgggtggtcaggtgggatagcgttccgcgtatggcccagcgcatcacgggttcgcacca-3′

互補(bǔ)鏈dna(dna2):5-sh-(t)10-cccacctgaccacccaccgg-3′。

實(shí)施例1

(1)適配體與葡萄糖氧化酶(apt-gox)偶聯(lián)物的制備

巰基化的寡核苷酸首先溶解于te緩沖液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)中，配成1μl100μmdna溶液，再加入30μl15mmtcep溶液，25℃下孵化2h，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

之后，1ml1×10^-5mgox和300μl5×10^-4msulfo-smcc偶聯(lián)劑加入到磷酸鹽緩沖液(pbs，12mm，ph7.4)中孵化45min，多余的sulfo-smcc偶聯(lián)劑通過(guò)離心過(guò)濾管(ultracel-30k薄膜，密理博)離心過(guò)濾除去再加入10μl5×10^-5m的適配體溶液，25℃下孵化2h，多余的適配體通過(guò)離心過(guò)濾管(ultracel-100k薄膜，密理博)離心過(guò)濾除去。apt-gox溶液(濃度約為1×10^-5m)制備完成。

(2)金納米粒子(auns)的制備

auns采用兩步種子-介導(dǎo)生長(zhǎng)法合成，包括12nmau種的制備和auns的形成。

12nmau種是通過(guò)在不斷攪拌的條件下向100ml沸騰的haucl4溶液(1mm)中加入15ml1％檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌15min，冷卻至室溫，4℃保藏。

auns的形成是在輕微攪拌的條件下將200μl12nmau種加入到20ml0.25mmhaucl4(含20μl1mhcl，ph3.0)溶液中，同時(shí)迅速加入100μl0.1m的aa和200μl1mm的agno3溶液。室溫孵化30s，直至溶液由淺紅變?yōu)槟G色。在3000rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，棄去上清液，底物復(fù)溶于超純水中來(lái)阻止還原反應(yīng)的進(jìn)行。auns溶液在4℃的冰箱中短期保藏。

(3)功能化金納米粒子的制備

功能化金納米粒子探針是通過(guò)au-s鍵法制備的。先向1ml新鮮的auns溶液中加入1μl100μm的dna2溶液，常溫振蕩孵化3h。隨后，再加入5μl1mm4-ntp乙醇溶液，繼續(xù)常溫振蕩孵化12h。以3000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心兩次，每次10min以除去多余的dna2和4-ntp，沉積物復(fù)溶于超純水中。

(4)檢測(cè)體系的構(gòu)建

向上述功能化auns探針中加入一定量的apt-gox溶液(6.7×10^-16m)，常溫震蕩孵化5min，得auns-gox探針溶液；

向上述auns-gox探針溶液中加入500μl葡萄糖溶液(100mm)，孵化1h后加入100μlagno3(0.1mm)和100μl氨水(40mm)，常溫孵化2h后測(cè)sers信號(hào)。圖2中標(biāo)記為ag@auns。

auns-gox探針溶液分別加入不同濃度的bpa標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液(0，10^-18g/ml～10^-12g/ml，參見(jiàn)圖4)。常溫孵化8h后，在2500rmp/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，棄去上清液，底物復(fù)溶于2-(n-嗎啉)-乙磺酸(mes)緩沖液(10mm，ph5.9)中。再加入葡萄糖溶液(100mm)，孵化1h后加入agno3(0.1mm)和氨水溶液(40mm)，常溫孵化2h后測(cè)sers信號(hào)。

激發(fā)波長(zhǎng)為785nm，測(cè)定1339cm^-1處的sers峰為4-ntp的特征峰。

圖1示出auns在晶體生長(zhǎng)前(圖1之a(chǎn)適配體功能化的納米星)和加入apt-gox溶液晶體生長(zhǎng)后(圖1之b組裝后生長(zhǎng)晶體的納米星)的透射電鏡圖，可觀察到銀沉積在auns表面，sers基底的粒徑與生長(zhǎng)前相比星形變得不明顯，星狀分枝不突出，且粒徑增加。

圖2示出了金納米粒子(auns)、auns-dna探針(第(2)步所制)、auns-gox探針(步驟(4)制)、ag@auns的動(dòng)態(tài)光散射(dls)分布圖，由圖可知.auns在不同狀態(tài)時(shí)的dls分布基本都呈正態(tài)分布，新合成的auns的平均水和粒徑約為43.46nm；auns修飾了互補(bǔ)鏈dna2和4-ntp形成的auns探針(auns-dna探針)的平均水和粒徑約為48.63nm，dna2與apt-gox偶聯(lián)物雜交后形成的auns-gox探針的平均水和粒徑約為77.29nm，通過(guò)這三組的比較可以證明auns探針和auns-gox探針的產(chǎn)生。更重要的是，晶體生長(zhǎng)后形成的auns-ag核-殼納米結(jié)構(gòu)(ag@auns)的平均水和粒徑約為83.05nm，進(jìn)一步說(shuō)明生成的金屬銀可沉積在auns表面。

圖3為4-ntp在不同狀態(tài)時(shí)的sers光譜，由圖可知，晶體生長(zhǎng)前4-ntp的特征峰值較弱(2000以下)，而晶體生長(zhǎng)后4-ntp的特征峰值很強(qiáng)。以加入10-16g/mlbpa為例，此時(shí)4-ntp的特征峰值強(qiáng)度約為晶體生長(zhǎng)前峰值的9倍；而當(dāng)加入的bpa濃度為10-13g/ml時(shí)，4-ntp的特征峰值強(qiáng)度約為晶體生長(zhǎng)前峰值的3倍。

圖4之a(chǎn)為添加不同濃度bpa時(shí)4-ntp的sers光譜；圖4之b為bpa檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r²為0.9901，說(shuō)明檢測(cè)準(zhǔn)確、檢測(cè)限低至10^-16g/ml。

本方法結(jié)合sers的高靈敏性和酶-引導(dǎo)晶體成長(zhǎng)策略的高效性，設(shè)計(jì)了一種新的基于酶-引導(dǎo)銀沉積的sers傳感器用于bpa分子的超靈敏檢測(cè)，首次證明了酶-引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)策略在構(gòu)建高靈敏基于納米材料的sers傳感器方面的前景。

參見(jiàn)圖5的原理圖，該傳感器的核心機(jī)理是利用葡萄糖氧化酶(gox)催化葡萄糖產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而過(guò)氧化氫可將硝酸銀還原為金屬銀并使之沉積在納米金星(auns)表面，此過(guò)程可顯著增強(qiáng)拉曼信號(hào)。當(dāng)體系中不存在bpa時(shí)，apt-gox偶聯(lián)物能與auns探針上的互補(bǔ)dna2鏈雜交，從而致使auns探針上含大量gox，此時(shí)體系中存在auns-gox探針，因此通過(guò)gox催化反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫并將硝酸銀還原為金屬銀沉積在auns表面，auns表面“熱點(diǎn)”越多，sers信號(hào)越強(qiáng)。當(dāng)體系中存在bpa時(shí)，apt-gox偶聯(lián)物與bpa結(jié)合，不能與互補(bǔ)dna2鏈雜交，體系中不存在auns-gox探針，因此不能產(chǎn)生金屬銀沉積在auns表面，此時(shí)sers信號(hào)較弱。也就是說(shuō)，隨著bpa加入量的增大，體系中存在auns-gox探針的量越少，gox催化反應(yīng)的強(qiáng)度減弱，還原產(chǎn)生的金屬銀會(huì)減少，因此沉積在auns表面的銀殼會(huì)變薄，此時(shí)sers信號(hào)會(huì)隨之變?nèi)?。結(jié)合這種酶-引導(dǎo)銀沉積的高靈敏性和適配體的高特異性，本方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)bpa高靈敏和特異性檢測(cè)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>長(zhǎng)沙理工大學(xué)

<120>酶引導(dǎo)晶體生長(zhǎng)增強(qiáng)拉曼光譜表面效應(yīng)檢測(cè)雙酚a的方法

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