一種苯丙素類化合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種苯丙素類化合物的制備方法，具體涉及從大葉千斤拔的干燥根中分離得到的一種苯丙素類化合物，該苯丙素類化合物經(jīng)溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離純化制得，經(jīng)本發(fā)明方法得到的苯丙素類化合物為首次報道，純度高。實驗證明，得到的新苯丙素類化合物可以抑制細(xì)胞炎癥因子TNF?α，IL?1β，IL?6的表達(dá)作用，具有對羥基自由基(?OH)的抑制作用，進(jìn)而具有抗炎及抗氧化活性，有益于宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等各種炎癥性疾病的治療，可以將該化合物開發(fā)成新藥。本發(fā)明中所述的化合物結(jié)構(gòu)式為式(Ⅰ)所示的苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽。
【專利說明】
一種苯丙素類化合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種新苯丙素類化合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 從天然藥物中提取分離得到的成分結(jié)構(gòu)多樣、活性顯著，對其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu) 修飾、改造和全合成，一直是新藥研發(fā)的一個主要思路。
[0003] TNF-α:是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄 今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，然而其毒副作用也非常嚴(yán) 重。
[0004] IL-Ιβ:在局部低濃度時協(xié)同刺激APC和T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，進(jìn) 行免疫調(diào)節(jié)。大量產(chǎn)生時有內(nèi)分泌效應(yīng):誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成，引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。
[0005] IL-6:人類IL-6基因位于第7號染色體上；IL-6分子量在21~30KD之間。主要由單 核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗 體;刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化;刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng);促進(jìn)血細(xì)胞發(fā) 育。
[0006] IL-6可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核一巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、 上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等。IL-6作用的靶細(xì)胞很多，包括巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、靜止的T細(xì) 胞、活化的B細(xì)胞和漿細(xì)胞等;其生物效應(yīng)也十分復(fù)雜。
[0007] 0H為生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧物質(zhì)，能導(dǎo)致細(xì)胞及生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂 質(zhì)氧化損傷。
[0008] 因此，尋求一種新的制備方法，從天然植物中提取分離得到新的化合物，能抑制細(xì) 胞炎癥因子TNF-a，IL-liML-6的表達(dá)作用，抑制羥基自由基(-OH)的活性，應(yīng)用于炎癥性疾 病的治療，是非常有必要的。
[0009] 千斤拔藥材為豆科(Leguminosae)千斤拔屬(Flemingl .Roxb.或Moghania)植物大 葉千斤拔(]/[0811311丨31]^(31'(^117113(￥；[11(1.)0.1(111^26)的干燥根，在我國主要分布于東南部 地區(qū)。該植物在中國植物志（1995，41:313)、臺灣植物志（1977,3:258)、海南植物志（1965， 2:311)、《中國高等植物圖鑒》（1972,2:510)、中國主要植物圖說（1955，？?707)和廣州植物 志（1956，pp361)中均有收錄。千斤拔藥材為廣西地區(qū)的道地藥材，史載于《植物名實圖考》， 有著廣泛的民間用藥基礎(chǔ)。其性味甘，微澀，平，具有清熱除濕等功效，主要用于治療風(fēng)濕骨 痛、跌打損傷、慢性腎炎、痛經(jīng)和白帶多等婦科疾病。該藥材目前已收載入2005年版《中國藥 典》附錄。
[0010] 大葉千斤拔已報道的成分主要有黃酮類、留類、萜類、蒽醌類、揮發(fā)油類成分，均具 有一定的藥理活性。
[0011] 大葉千斤拔藥理活性多樣，報道較多的有神經(jīng)保護(hù)作用，抗炎、抗氧化作用，對病 原微生物的驅(qū)蟲作用、類激素作用、細(xì)胞毒作用，抗菌作用以及免疫增強(qiáng)作用、抗疲勞作用。
[0012] 千斤拔目前廣泛應(yīng)用于婦科、風(fēng)濕痹痛等類型的中成藥生產(chǎn)，如婦科千金片、婦科 千金膠囊、金雞沖劑、金雞膠囊等，此類中成藥主要用于婦科病(痛經(jīng)、子宮寒冷不孕、子宮 下垂、盆腔炎、乳腺炎、白帶多、產(chǎn)后血虛、關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后腰膝痛、缺乳和乳瘡等），虛弱貧血 (婦女貧血，氣血虛弱和病后氣虛等）。近年來，臨床報道較多的是婦科千金片在治療婦科炎 癥方面的作用。
[0013] 目前，在千斤拔的文獻(xiàn)中，報道苯丙素類化合物的文獻(xiàn)極少，尋找一種新的制備方 法，從天然植物中分離出有效的苯丙素類新化合物，對其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)修飾和合成， 開發(fā)新藥，應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種從大葉千斤拔的干燥根中分離得到的一種苯丙素類 化合物的制備方法，通過該制備方法提取分離得到的化合物可以抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-α， IL-li3，IL-6的表達(dá)作用，具有對羥基自由基的（-OH)的抑制作用，進(jìn)而具有抗炎及抗氧化活 性，有益于各種炎癥性疾病的治療，可以將該化合物開發(fā)成新藥。
[0015] 具體地，本發(fā)明所述苯丙素類化合物的制備方法包括如下步驟：
[0016] S1.取大葉千斤拔的根部為原料，干燥，切塊，經(jīng)乙醇溶液提取，將提取液合并，濃 縮至無醇味，得浸膏備用；
[0017] S2.將步驟S1中所得浸膏加水溶解，采用大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗脫，洗脫劑為 乙醇-水系統(tǒng)，收集前3個柱體積的洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0018] S3 .將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相材料0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲 醇-水系統(tǒng)，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序收集6個流分， 分別命名為麗-11，麗-12，麗-13，11-14，11-15，11-16，備用 ；
[0019] S4.將步驟S3中收集到的流分MM-13用制備液相分離，流動相為甲醇-水-乙酸系 統(tǒng)，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為麗-131，麗-13 2，MM-13 3，MM-134， 備用；
[0020] S5.將步驟S4中收集到的流分MM-133用制備液相純化，流動相為甲醇-水-乙酸系 統(tǒng)，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。所述苯丙素類化合物的純度為 99.66%。所述苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：
[0022] 優(yōu)選地，步驟S1中，乙醇溶液的濃度為50-80體積％，進(jìn)一步優(yōu)選為乙醇溶液濃度 為60體積％。
[0023]優(yōu)選地，步驟S1中，乙醇溶液的提取次數(shù)為2~4次，每次提取1~3小時，進(jìn)一步優(yōu) 選為乙醇溶液的提取次數(shù)為3次，每次2小時。
[0024]優(yōu)選地，步驟S2中，大孔吸附樹脂采用D101大孔吸附樹脂。
[0025] 優(yōu)選地，步驟S2中，乙醇與水的體積比為0:100~15:85。
[0026] 優(yōu)選地，步驟S3中，甲醇與水的體積比為20:80~30:70，進(jìn)一步優(yōu)選為25:75。
[0027] 優(yōu)選地，步驟S4中，甲醇-水-乙酸的體積比為10:90:0.01~35:65:0.01，進(jìn)一步 [0028]優(yōu)選為 15:85:0.01。
[0029] 優(yōu)選地，步驟S4中，制備液相色譜柱為YMC，20mm*250mm，流動相流速為5~10ml/ min，進(jìn)一步優(yōu)選為流速5ml/min。
[0030] 優(yōu)選地，步驟S5中，甲醇-水-乙酸的體積比為15:85:0.01。
[0031] 優(yōu)選地，步驟S5中，制備液相色譜柱為YMC，20mm*250mm，流動相流速為5mL/min。
[0032] 本發(fā)明提供所述制備方法制備得到的苯丙素類化合物。
[0033] 以及以所述苯丙素類化合物為原料經(jīng)化學(xué)合成方法制備得到的苯丙素類化合物 鹽。所述鹽的結(jié)構(gòu)如式（Π )或式(m)所示：
[0035]其中，R為無機(jī)酸，辦或此為磺酸根、堿金屬離子或銨根中的任意一種或任意兩種。
[0036] 優(yōu)選地，所述無機(jī)酸為鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸或乳 酸;所述磺酸根為具有芳基的磺酸根;所述堿金屬離子為鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子或 鋰離子。
[0037] 優(yōu)選地，所述具有芳基的磺酸根為苯磺酸根或?qū)妆交撬岣?br>[0038] 優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為銨鹽。
[0039]本發(fā)明的有益效果：
[0040]本發(fā)明為新的苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽提供了一種制備方法，首次 從大葉千斤拔的干燥根中分離得到的一種新苯丙素類化合物，制得的化合物可以抑制細(xì)胞 炎癥因子了即-€1，幾-1|3，幾-6的表達(dá)作用，具有對羥基自由基的（-〇!〇的抑制作用，進(jìn)而具有 抗炎及抗氧化活性，可以用作如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎 等炎癥性疾病的治療藥物。
[0041 ]本發(fā)明的目的是從傳統(tǒng)的中藥處方中，通過從婦科千金片及婦科千金膠囊的處方 中，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化制得一種新苯丙素類化合物，并通過實 驗證實，其可以應(yīng)用于炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān) 節(jié)炎等疾病的治療。
[0042] 具體地，發(fā)明人通過從婦科千金片、婦科千金膠囊的處方中，科學(xué)選取大葉千斤拔 的干燥根，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化，得到本發(fā)明所述苯丙素類化合 物，然后對該化合物進(jìn)行細(xì)胞試驗，測定其對細(xì)胞炎癥因子TNF-α，IL-Ιβ，IL-6的抑制程度， 實驗表明，該化合物在濃度（10.50-13.50yg/mL)范圍內(nèi)對LPS刺激引起的Raw 264.7細(xì)胞炎 癥因子TNF-α含量有明顯的抑制作用(p<0.05)，并且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系；在濃度 (4.5〇-13.5(^8/1^)范圍內(nèi)對炎癥因子11^-10含量有明顯的抑制作用(？<〇.〇5)，表現(xiàn)出明 顯的劑量依賴關(guān)系;在濃度(7.50-13.50yg/mL)范圍內(nèi)對炎癥因子IL-6含量有明顯的抑制 作用(p<0.05)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。
【附圖說明】
[0043] 圖1為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振氫譜圖。
[0044] 圖2為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振碳譜圖。
[0045] 圖3為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對細(xì)胞活性的影響圖。
[0046] 圖4為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對N0的抑制作用圖。
[0047] 圖5為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對TNF-a的抑制作用圖。
[0048]圖6為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對IL-1邱勺抑制作用圖。
[0049]圖7為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對IL-6的抑制作用圖。
[0050]圖8為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對0H的抑制作用圖。
【具體實施方式】
[0051] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，本實施例所用的原料和設(shè)備均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的原 料和設(shè)備。
[0052] 本發(fā)明的化合物是所述式（I)所示的苯丙素類化合物及式（Π )或式（ΙΠ )所示該化 合物藥學(xué)上可接受的鹽。該化合物可以采用本發(fā)明提供的以大葉千斤拔為原料提取的方法 制備得到，也可以根據(jù)本發(fā)明提供的結(jié)構(gòu)式結(jié)合采用本領(lǐng)域的化學(xué)合成等方法制備得到。 [0053]作為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的鹽，只要是藥學(xué)上可接受的鹽即可，可列舉為 與鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸等無機(jī)酸形成的無機(jī)酸鹽;與 磺酸形成的磺酸鹽;與鉀、鈉、鈣、鎂、鋰等堿金屬的氫氧化物形成的堿金屬鹽，與銨形成的 銨鹽等。
[0054]本發(fā)明苯丙素類化合物可用作如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/ 或關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的治療藥物。
[0055] 本發(fā)明化合物可以與藥學(xué)上允許的輔料和/或載體一起用作藥物組合物，也可以 在加入藥學(xué)上允許的輔料和/或載體的情況下與金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、 當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種中藥材或提取物的組合用作藥物組合物，本發(fā)明化合物還可以 與其他藥學(xué)上可接受的藥效成分一起用作藥物組合物。
[0056] 作為藥物組合物，可以是片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿 劑、注射劑、軟膏劑、栓劑、噴霧劑等。
[0057] 進(jìn)一步地，片劑可以是在添加藥學(xué)上允許的輔料和/或載體的情況下制成的糖衣 片、薄膜衣片、腸溶性包衣片或雙層片、多層片。
[0058]本發(fā)明的輔料和/或載體可以如下：
[0059 ]制成固體制劑，可以使用添加劑，例如蔗糖、乳糖、纖維素糖、麥芽糖醇、葡萄糖、淀 粉類、瓊脂、海藻酸鹽類、甲殼素、殼聚糖類、果膠類、阿拉伯樹膠類、明膠類、膠原類、酪蛋 白、白蛋白、磷酸鈣、山梨糖醇、甘氨酸、甘油、聚乙二醇、碳酸氫鈉、滑石等。
[0060] 制成半固體制劑，可以使用動植物性油脂(橄欖油、玉米油、蓖麻油等）、礦物性油 月旨(凡士林、白凡士林、固態(tài)石蠟等）、蠟類(霍霍巴油、巴西棕櫚蠟、蜂蠟等）、部分合成或全 合成的甘油脂肪酸酯（月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等)等。
[0061] 制成液體制劑，可使用添加劑，例如氯化鈉、葡萄糖、山梨糖醇、甘油、橄欖油、丙二 醇、乙醇等。尤其制成注射劑的情況下，可以使用無菌水溶液，例如生理鹽水、等滲液、油性 液，如麻油、大豆油。另外，還可以根據(jù)需要，并用適當(dāng)?shù)闹鷳覄玺燃谆w維素鈉，非離子 表面活性劑、助溶劑，如苯甲酸芐酯、苯甲醇等。
[0062]這些制劑的有效成分的量為制劑的0.01~80重量％，適宜為1~50重量％，給藥量 根據(jù)患者的癥狀、體重、年齡等不同而變化。
[0063]實施例1苯丙素類化合物的制備
[0064]本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0065] S1.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。經(jīng)8倍量60%的乙醇回流 提取3次，每次2小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0066] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于10L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為水，洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0067] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為25:75，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集 6 個流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0068] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-13用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml/min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為25:75: 0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為MM-131，麗-132，麗-133，MM-134，備用；
[0069] S5.將步驟S4中收集到的流分MM-133用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0070] 實施例2苯丙素類化合物的制備
[0071] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0072] SI.取大葉千斤拔40kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。經(jīng)6倍量50%的乙醇回流 提取2次，每次1小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0073] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于5L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為15:85,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用； [0074] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為20:80，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集 6 個流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0075] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-13用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 0mm* 2 5 0mm，流速：10m 1 /m i η，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為3 5: 65:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為麗-131，麗-132，11-133，麗-134，備用；
[0076] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-133用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0077]實施例3苯丙素類化合物的制備
[0078]本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0079] S1.取大葉千斤拔60kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。7倍量70%的乙醇回流提 取4次，每次3小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0080] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于8L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為10:90,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0081] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為30:70，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集 6 個流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0082] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-13用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 Omm* 2 5 Omm，流速：1 Om 1 /m i η，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為3 0: 70:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為MM-131，MM-13 2，MM-133，ΜΜ-134，備用；
[0083] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-133用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0084]實施例4苯丙素類化合物的制備
[0085]本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0086] S1.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。8倍量60%的乙醇回流提 取2次，每次1.5小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0087] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于6L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為5:95,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0088] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為25:75，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集 6 個流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0089] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-13用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 0mm* 2 5 0mm，流速：10m 1 /m i η，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為2 5: 75:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為麗-131，麗-132，11-133，11-134，備用；
[0090] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-133用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0091] 實施例5苯丙素類化合物的制備
[0092] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0093] S1.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。8倍量80%的乙醇回流提 取2次，每次1.5小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0094] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于6L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為10:90,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0095] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為28:72，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集 6 個流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0096] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-13用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 Omm* 2 5 Omm，流速：1 Om 1 /m i η，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為10: 90:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為MM-131，MM-13 2，MM-133，ΜΜ-134，備用；
[0097] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-133用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0098]將實施例1至實施例5制備得到的化合物進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜 的檢測，結(jié)果證明所得化合物為:3 羥基-4 '葡萄糖基-3-羥基丁酸甲酯。其結(jié)構(gòu)式如式（I) 所示：
[0100]其質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜的譜圖數(shù)據(jù)如下：
[0101] HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z 397.1267，結(jié)合核磁特征，可得分子式為C16H22〇1Q，不 飽和度為6。
[0102] 4-^1^(60010^,0)300):7.43((1(1,111)，7.12(dd，lH)，6.81(dd，lH)，4.84(d，lH)， 4.12(t，2H)，3.56(m，lH)，1.14(s，3H)。
[0103] 13C-匪R( 150MHz，CD30D): 179 · 3(C-1)，168 · 8(C-5，），150 · 1 (C-Γ )，144 · 7(C-3，）， 129.9(C-2'），116.4(C-4'），114.8(C-6'），103.6(C-1"），76.6-61.4(C2"-6"），42.9(C-2), 21.8(C-3),17.0(-CH 3)〇
[0104] 實施例6苯丙素類化合物鹽的制備
[0105] 苯丙素類化合物鹽酸鹽的制備：
[0106] 攪拌下將該苯丙素化合物甲醇溶液中滴加飽和鹽酸至pH值2-3,攪拌下滴加乙腈， 抽濾，干燥得到白色粉末固體，即為苯丙素化合物的鹽酸鹽。
[0107] 苯丙素類化合物磺酸鹽的制備：
[0108] 在含有該苯丙素類化合物、溶劑、磺酸、中性油和促進(jìn)劑的反應(yīng)體系中加入堿金屬 的氫氧化物，加入溶劑、低級醇和助促進(jìn)劑，通入二氧化碳，分離得到白色粉末固體，即為苯 丙素化合物的磺酸鹽。
[0109] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽的制備：
[0110] 將溶于乙醇中的Κ0Η或NaOH加入該苯丙素化合物中，攪拌下加熱回流反應(yīng)，冷制室 溫，攪拌下滴加乙腈，抽濾，干燥得白色固體，即為該苯丙素化合物的鉀鹽或鈉鹽。 苯丙素類化合物銨鹽的制備：
[0112]攪拌下將該苯丙素化合物甲醇溶液中滴加飽和氨水至pH值9-11，攪拌下滴加乙 腈，抽濾，干燥得到白色固體，即為苯丙素類化合物的銨鹽。
[0113] 上述化合物鹽的譜圖數(shù)據(jù)：
[0114] 苯丙素類化合物鹽酸鹽：ESIMS顯示m/z 410.62，核磁特征1!1-匪1?(60(^取， CD30D):7.40(dd，lH)，7.07(dd，lH)，6.77(dd，lH)，4.64(d，lH)，4.02(t，2H)，3·46(ι?，1H)， l.ll(s，3H)〇
[0115] 苯丙素類化合物磺酸鹽：ESIMS顯示為m/z 438.22，核磁特征咕-麗1?(6001〇^， CD30D):7.54(dd，lH)，7.13(dd，lH)，6.80(dd，lH)，4.83(d，lH)，4.10(t，2H)，3.54(m，lH)， 1.13(s，3H)〇
[0116] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽：
[0117] 鉀鹽：ESIMS顯示m/z 412 · 42，核磁特征1H-匪R(600MHz，CD30D): 7 · 55(dd，1H)， 7.11(dd，lH)，6.86(dd，lH)，4.83(d，lH)，4.11(t，2H)，3.56(m，lH)，1.14(s，3H)。
[0118] 鈉鹽：ES頂S顯示m/z 396.54,7.51(dd，lH)，7.10(dd，lH)，6.87(dd，lH)，4.85(d， lH)，4.12(t，2H)，3.57(m，lH)，1.14(s，3H)。
[0119] 苯丙素類化合物銨鹽:ESMS顯示m/z 389.26，核磁特征咕-匪1?(60010^，0)300): 7.46(dd,lH),7.17(dd,lH),6.80(dd,1H),4.84(d,1H),4.13(t,2H),3.51(m,1H),1.11(s, 3H)〇
[0120] 上述苯丙素化合物鹽的結(jié)構(gòu)式如式(IV)~式()所示。
[0122] (VI)。
[0123] 其中，式(IV)為制備得到的苯丙素類化合物鹽酸鹽，式（V )為制備得到的苯丙素 類化合物的其中一種磺酸鹽，式（VI)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鉀鹽，式 (νπ)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鈉鹽，式(VI)為制備得到的苯丙素類化合物 的其中一種銨鹽。
[0124] 實驗例7應(yīng)用試驗
[0125] 本發(fā)明所述化合物以及鹽對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎癥的影 響。（為了實驗過程中記錄方便，以下將本發(fā)明所述的苯丙素類化合物標(biāo)號為:藥物MM-133， 即本發(fā)明中所述的藥物MM-133即是指本發(fā)明式（I)所示苯丙素類化合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽。）
[0126] 1材料與方法
[0127] 1.1藥品及儀器
[0128] 脂多糖（11卩〇卩〇1}^&(^]1&1^(16，1^：)3)，]\11'1'購自3181]1&公司；小鼠巨卩策細(xì)胞1^￥ 264.7 購自湘雅細(xì)胞庫;PBS; DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素與鏈霉素;全自動酶標(biāo)儀;恒溫 C02培養(yǎng)箱。
[0129] 小鼠白介素 l-f3(IL-1-f3)ELISA檢測試劑盒，批號：2014/06(96T);小鼠白介素6 (IL-6)ELISA檢測試劑盒，批號：2014/06(96T);小鼠腫瘤壞死因子-a(TNF-a)ELISA檢測試 劑盒，批號：2014/06(96T);小鼠一氧化氮(NO)ELISA檢測試劑盒，批號：2014/10(96T);小鼠 羥基自由基(OH)ELISA檢測試劑盒，批號:2014/10(96T)。
[0130] 1.2藥物制備
[0131] 首先用少量DMS0溶解，然后用DMEM稀釋至一定的濃度，使終濃度中DMS0含量少于 1%0 〇
[0132] 1.3細(xì)胞培養(yǎng)
[0133] 小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7培養(yǎng)于含10%熱滅活（56°(：，3〇1^11)的胎牛血清卬83)、 10U/mL青霉素鈉、100yg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5 % C02恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長。
[0134] 1.4細(xì)胞活力測定
[0135] 細(xì)胞活力通過MTT法來測定。將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于96孔板(1 X 104個/孔)孵 育24h，再同步化24h，然后將不同濃度的藥物作用于細(xì)胞2h，然后再加入LPS(30yg/mL)刺激 24h，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100yL的MTT(0.5mg/mL)繼續(xù)孵育4h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入 150yL的DMS0，搖床振搖10min，在490nm處測定吸光度。
[0136] 1.5 N0含量測定
[0137] Raw 264.7細(xì)胞接種于96孔板24h，再同步化24h，然后將不同濃度的藥物作用于細(xì) 胞2h，然后再加入LPS( 30yg/mL)刺激24h，最后收集上清液，并于lOOOOrpm離心5min，分裝上 清并置于_80°C保存?zhèn)溆?。通過小鼠 N0試劑盒測定N0含量。
[0138] 1.6 炎癥因子TNF-a，IL-10，IL_6測量
[0139] 樣品取1.5制備好的樣品用于后續(xù)炎癥因子測定。細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a，IL-lf3，IL_6的 量通過小鼠 TNF-a，IL-Ιβ，IL-6試劑盒來測定。
[0140] 1.7 0H含量測定
[0141]樣品取1.5制備好的樣品用于0H因子測定。通過0H試劑盒測定含量。
[0142] 1.8統(tǒng)計分析
[0143] 采用SPSS17.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以（x±s表示;所得數(shù)據(jù)通過用單因素方差分析，方 差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett T3檢驗。
[0144] 2實驗結(jié)果
[0145] 2.1細(xì)胞活力
[0146] 藥物對細(xì)胞活力的影響通過ΜΤΤ法來評價。如圖3所示，藥物ΜΜ-133在1.50-13.50μ g/mL濃度范圍內(nèi)對Raw 264.7細(xì)胞活力沒有顯著影響；因此在此范圍濃度下的藥物濃度對 于后續(xù)實驗是合適的。
[0147] 2.2藥物抑制N0的產(chǎn)生
[0148] 如圖4所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，其產(chǎn)生N0(65.81 ±2.93IU/mL)含量與正 常組N0(33.61±2.19IU/mL)相比明顯升高(p<0.01)。藥物MM-133在該濃度下對LPS引起的 N0含量升高沒有明顯的抑制作用。
[0149] 2.3 藥物抑制TNF-a，IL-10，IL_6的產(chǎn)生
[0150] 如圖5至圖7所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，Raw 264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-a (132 · 16 ± 5 · 28pg/mL)，IL-10(358 · 80 ± 24 · 64pg/mL)，IL-6(198 · 39 ± 5 · 97pg/mL)含量與正 常組TNF-a (65 · 41 ±6 · 29pg/mL)，IL-10( 172 · 67 ± 10 · 06pg/mL)，IL-6( 103 · 34± 2 · 88pg/mL) 相比含量明顯升高(P<〇.01);說明LPS能夠刺激Raw 264.7細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子。
[0151] 藥物MM-133在濃度（10.50-13.50yg/mL)范圍內(nèi)對LPS刺激引起的Raw 264.7細(xì)胞 炎癥因子TNF-α含量有明顯的抑制作用(p <0.05 )，并且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系；在濃 度(4.5〇-13.5(^8/1^)范圍內(nèi)對炎癥因子11^-10含量有明顯的抑制作用(？<〇.〇5)，表現(xiàn)出 明顯的劑量依賴關(guān)系;在濃度(7.50-13.50yg/mL)范圍內(nèi)對炎癥因子IL-6含量有明顯的抑 制作用(P<〇.05)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。
[0152] 2.4藥物抑制0H的產(chǎn)生
[0153] 如圖8所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，其產(chǎn)生0H(113.58±6.03ng/mL)含量與 正常組0H(63 · 40± 1 · 19ng/mL)相比明顯升高（p<0 · 01)。
[0154] 藥物MM-133在(7.50-13.5(^8/1^)濃度范圍內(nèi)對1^引起的0!1含量變化有明顯的 抑制作用(P <〇. 05 )，并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。
[0155] 本實驗經(jīng)體外培養(yǎng)，研究了藥物MM-133對小鼠巨噬細(xì)胞N0，TNF-α，IL-Ιβ，IL-6，0H 生成的影響。
[0156] 藥物MM-133對因子N0無抑制活性，在較高濃度對細(xì)胞炎癥因子TNF-a有明顯的抑 制活性，對IL-liUL-6抑制活性較強(qiáng)，說明其通過抑制TNF-a的產(chǎn)生后，對E-1P，IL_6的含 量產(chǎn)生了影響，說明其抗炎活性較好，其在中高濃度時表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。
[0157] 實施例8
[0158] 片劑的制備:按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該化 合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或堿 金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽，按 該化合物或其任意一種鹽與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0159] 實施例9
[0160] 散劑的制備:按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該化 合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或堿 金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽，按 常規(guī)散劑制法制成散劑。
[0161] 實施例10
[0162] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以 及利用該化合物與無機(jī)酸（如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸） 或磺酸或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨 制成的鹽，按該化合物或其任意一種鹽與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制成膠 囊劑或顆粒劑。
[0163] 實施例11
[0164] 注射劑的制備：按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該 化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或 堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽， 按常規(guī)注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射劑。
[0165] 實施例12
[0166] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用 該化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸 或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的 鹽，以及金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參制成的粉末，和輔料。
[0167] 實施例13
[0168] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及金櫻 根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參制成的粉末，和輔料。
[0169] 實施例14
[0170] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及金櫻 根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參的提取物，和輔料。提取物是按專利公告號 CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、 CN1296073C的任意一件或幾件專利文件中提取方法制備得到。
[0171] 實施例15
[0172] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用 該化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸 或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的 鹽，以及金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參的提取物，和輔料。提取物是按 專利公告號 CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、 CN1296072C、CN1296073C的任意一件或幾件專利文件中提取方法制備得到。
[0173] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)勢。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這對本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā) 明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1. 一種苯丙素類化合物的制備方法，其特征在于，所述苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)式如式 (I)所示，所述制備方法包括如下步驟：51. 取大葉千斤拔的根部為原料，干燥，切塊，經(jīng)乙醇溶液提取，將提取液合并，濃縮至 無醇味，得浸膏備用；52. 將步驟Sl中所得浸膏加水溶解，采用大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗脫，洗脫劑為乙 醇-水系統(tǒng)，收集前3個柱體積的洗脫液，命名為MM-I，備用；53. 將步驟S2中收集到的流分MM-I用反相材料ODS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序收集6個流分，分別 命名為MM-II，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16，備用；54. 將步驟S3中收集到的流分MM-13用制備液相分離，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，按 出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為MM-131，MM-132，MM-133，MM-134,備用；55. 將步驟S4中收集到的流分MM-133用制備液相純化，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，收 集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟Sl中，乙醇溶液的濃度為50~80 體積％，優(yōu)選為乙醇溶液濃度為60體積％。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟Sl中，乙醇溶液的提取次數(shù)為2~ 4次，每次提取1-3小時，優(yōu)選為乙醇溶液的提取次數(shù)為3次，每次2小時。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟S2中，大孔吸附樹脂采用DlOl大 孔吸附樹脂。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟S2中，乙醇與水的體積比為0:100 ~15:85〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟S3中，洗脫劑甲醇與水的體積比 為 20:80 ~30:70,優(yōu)選為 25:75。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟S4中，甲醇-水-乙酸的體積比為 10:90:0.01 ~35:65:0.01，優(yōu)選為 15:85:0.01。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟S4中，制備液相的色譜柱為YMC， 20mm*250mm，流動相流速為5~10mL/min，優(yōu)選為流速5mL/min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S5中，甲醇-水-乙酸的體積比為 15:85:0.01〇
【文檔編號】C07H1/08GK105884841SQ201610153958
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月17日
【發(fā)明人】劉逆夫, 龔云, 夏博候, 李亞梅, 林麗美, 伍實花
【申請人】株洲千金藥業(yè)股份有限公司