Gii型諾如病毒病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含有諾如病毒GII型基因的病毒樣顆粒的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]諾如病毒，又稱諾瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人類杯狀病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中諾如病毒(Norovirus，NV)屬的原型代表株。它是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾如病毒最早是從1968年在美國諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉患者糞便中分離的病原。2002年8月第八屆國際病毒命名委員會(huì)批準(zhǔn)名稱為諾如病毒，它與在日本發(fā)現(xiàn)的札幌樣病毒，合稱為人類杯狀病毒。諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內(nèi)均有流行，全年均可發(fā)生感染，感染對(duì)象主要是成人和學(xué)齡兒童，寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高發(fā)。美國每年在所有的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發(fā)達(dá)國家也都有類似結(jié)果。在中國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%左右，血清抗體水平調(diào)查表明中國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。
[0003]目前，食品中諾如病毒GII型檢測(cè)的常用方法有RT-PCR技術(shù)和熒光定量RT-PCR技術(shù)，為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)立陽性對(duì)照或質(zhì)控品。通常使用病毒培養(yǎng)物或是由RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA做標(biāo)準(zhǔn)品，但是前者存在生物安全的隱患且易被核糖核酸酶降解，后者不能體現(xiàn)核酸提取過程和反轉(zhuǎn)錄對(duì)試驗(yàn)的影響。本發(fā)明采用Armored RNA技術(shù)，構(gòu)建包裹甲肝病毒基因的假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品，此假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠避免核糖核酸酶對(duì)RNA的降解，作為質(zhì)控品可以對(duì)從核酸提取至RT-PCR檢測(cè)的全過程進(jìn)行有效的監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:構(gòu)建包裹NV-GII基因的病毒樣顆粒假病毒和標(biāo)準(zhǔn)樣品，此假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠避免核糖核酸酶對(duì)RNA的降解，作為質(zhì)控品可以對(duì)從核酸提取至RT-PCR檢測(cè)的全過程進(jìn)行有效的監(jiān)控。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，將編碼組氨酸標(biāo)簽序列插入MS2噬菌體編碼外殼蛋白的β發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)序列中，構(gòu)建含有重組組氨酸標(biāo)簽的MS2噬菌體外殼蛋白和表達(dá)成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重組質(zhì)粒。并通過RT-RCR技術(shù)擴(kuò)增NV-GII基因，將其克隆于ρΝΗ-MS2his中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pNH-MS2his-NV-GII。并將其轉(zhuǎn)化于表達(dá)大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白能夠自主裝配形成VLPs，而且其中含有NV-GII的基因RNA序列，并且該RNA序列具有良好的穩(wěn)定性，可以作為RNA病毒檢測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品用于臨床及海關(guān)樣品檢測(cè)。
[0006]
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
首先，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一組擴(kuò)增NV-GII基因引物，序列如下:
NV-GIlfl:ATACCACAATGATACCACACTCCCANV-GIIrl:AAGAGGACACTGTGAACTCTCCAC 引物5‘端分別加上Hind II和Not I酶切位點(diǎn)。
[0007]5‘端和3’端分別加上Hind III和Not頂每切位點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明提供一種pNH_MS2his重組質(zhì)粒，pNH_MS2his重組質(zhì)粒中插入的NV-GII基因片段序列如下:
ACAATGATACCACACTCCCAAAGACCCATACAACTAATGTCTTTGCTGGGCGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATTAGCAAGCTAGTCATTGCAGAACTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCo[0009 ]本發(fā)明還提供一種制備含有NV-G II基因的病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法包括以下步驟:
(1)含有組氨酸標(biāo)簽的VLPs重組質(zhì)粒pET-NH-MS2his的構(gòu)建
將pET32a質(zhì)粒使用Xba I和Nco I消化，去除其中的Xba I和Nco I兩個(gè)酶切位點(diǎn)間的序列，將人工合成的5 ’ -P04-CTAGATTACAAGGC-3 ’ 和5 ’ -P04-CATGGCCTTGTAAT-3 ’ 兩條互補(bǔ)的寡核苷酸復(fù)性后插入其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-NH，測(cè)序鑒定。
[0010]采用一步法擴(kuò)增試劑盒以MS2Pfl和MS2Prl為引物，以MS2 RNA為模板擴(kuò)增MS2目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒(TaKaRa)回收目的片段，用50yL ddH20洗脫，標(biāo)記為MS2 DNA。
[0011]采用OneStep RT-PCR，以得到的MS2 DNA為模板，分別用引物MS2Pfl和ms2hispr和ms2hispf和MS2Prl擴(kuò)增MS2上和MS2下2個(gè)DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用膠回收試劑盒回收后，存于4°C備用。再以2個(gè)片段的混合物為模板，以MS2Pfl和MS2Prl為引物做PCR，得到引入了編碼組氨酸標(biāo)簽序列的MS2 DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收后的PCR產(chǎn)物命名為MS2his。
[0012]分別將制備的pET-NH載體和回收的MS2his片段用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hind ΙΠ進(jìn)行酶切消化。將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用膠回收試劑盒回收后與PET-NH載體用Solut1nI連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落作進(jìn)行酶切鑒定。從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5 ml的含有Amp抗生素的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。以提取的質(zhì)粒為模板，以MS2Pf和MS2Pr為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。若可見載體與1 700 bp左右的MS2目的片段即為陽性。
[0013](2)構(gòu)建原核表達(dá)載體 pNH-MS2his-NV_GII
按RNA提取試劑盒說明書的方法提取NV總RNA作為模版，以NV-GIIfl和NV-GIIrl為引物，擴(kuò)增NV-GII蛋白基因，RT-PCR體系為:5XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix lyL,EnzymeMix lyL，引物NF和NR各lyL，RNA模板5yL，ddH20補(bǔ)足25 yL，反應(yīng)條件為，50°C反轉(zhuǎn)錄30min，95°C滅火變性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 10min o擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見430bp的條帶，寶生物凝膠回收試劑盒回收NV-GI I蛋白片段。
[0014]Hindm和Notl雙酶切pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，膠回收試劑盒回收酶切的pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，回收產(chǎn)物16°C連接過夜。連接體系為載體pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段分別為2 yL和6 yL，T4 DNA連接酶1 yL，10 XT4連接酶buffer 1 yL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將涂板后獲得的重組克隆進(jìn)行PCR鑒定。將陽性克隆菌種送測(cè)序，鑒定為陽性的重組載體命名為pNH-MS2h is-NV-G 11。
[0015](3)誘導(dǎo)及純化重組pNH-MS2his-NV_GII質(zhì)粒
將測(cè)序正確的pNH-MS2his-NV-GII質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL2UDE3)，將陽性克隆菌株接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h。離心收集菌體。菌體中加入裂解緩沖液重懸，于冰上放置30min，離心去除菌體碎片，將上清加入預(yù)裝有N1-NTA的純化柱中，使液體自然流出，加入3倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌2次，然后加入洗脫緩沖液將病毒樣顆粒洗脫，命名為NV-GI1-VLPs。
[0016](4)為了檢測(cè)NV-GII，本發(fā)明還設(shè)計(jì)一種鑒定引物和探針，序列如下:
正向引物 NVG2-F: 5 ’ -ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3 ’
反向引物 NVG2-R: 5，-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3，
探針 NVG2-P: 5 ’ -FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3