一株吡啶降解菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物及生物降解技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一株吡啶降解菌及其應(yīng)用，尤其是在焦化、煤化工、石油化工廢水處理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]吡啶及其衍生物是典型的多環(huán)芳香含氮雜環(huán)化合物，廣泛存在于骨焦油、煤焦油、煤氣、頁(yè)巖油、石油中。吡啶有強(qiáng)烈刺激性，能麻醉中樞神經(jīng)系統(tǒng)。對(duì)眼及上呼吸道有刺激作用。高濃度吸入后，輕者有欣快或窒息感，繼之出現(xiàn)抑郁、肌無(wú)力、嘔吐，重者意識(shí)喪失、大小便失禁、強(qiáng)直性痙攣、血壓下降。吡啶難于生物降解，易通過(guò)焦化、煤化工、石油化工廢水的外排污染生態(tài)環(huán)境，對(duì)人類(lèi)健康具有巨大的潛在危害。
[0003]在廢水處理過(guò)程中，生物處理法比物化法具有諸多優(yōu)勢(shì)，如處理成本較低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等。然而，傳統(tǒng)的生物處理技術(shù)在一些難處理的工業(yè)廢水中很難達(dá)到環(huán)保要求，常規(guī)的活性污泥對(duì)廢水中的難降解物質(zhì)如吡啶、喹啉、萘等無(wú)計(jì)可施。近年來(lái)，生物強(qiáng)化技術(shù)通過(guò)在活性污泥中加入特定功能微生物，提高原有活性污泥對(duì)目標(biāo)污染物的去除效能，大大提高了污水處理能力，因而越來(lái)越引起人們的重視。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)外已有部分學(xué)者篩選出對(duì)吡啶具有高效降解性能的菌株，如假單胞菌(Pseudomonas sp.)、產(chǎn)硫酸桿菌(1'11；[0&&0；[11118)、副球菌屬(Paracoccus sp.)等，這些研究大多僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。到目前為止，國(guó)內(nèi)外有部分學(xué)者研究表明紅球菌屬(Rhodococcus sp.)可以降解苯甲酸鈉、鄰苯二酸、間苯二酸、對(duì)苯二酸和多氯聯(lián)苯等多種芳香化合物，但未見(jiàn)其降解吡啶的報(bào)道。焦化廢水、煤化工廢水和石油化工廢水中含有一定濃度的吡啶，而吡啶屬于難生化降解有機(jī)物，因此僅靠生物處理環(huán)節(jié)中的普通活性污泥很難實(shí)現(xiàn)對(duì)吡啶的有效降解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一株吡啶降解菌，實(shí)現(xiàn)其對(duì)焦化廢水、煤化工廢水和石油化工廢水的生物強(qiáng)化處理。
[0006]本發(fā)明所提供的吡啶降解菌TJKYBD-01源于焦化廢水處理站周邊的土壤。以吡啶作為唯一碳源、氮源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，在吡啶無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)土壤中的菌群進(jìn)行馴化培養(yǎng)，并通過(guò)平板劃線(xiàn)分離純化得到。
[0007]本發(fā)明所提供的吡啶降解菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落為粉紅色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤(rùn)，中心凸起。經(jīng)16S rRNA鑒定為紅球菌屬(Rhodococcus sp.)，命名TJKYBD-01。該菌株于2014年12月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10175，分類(lèi)名為紅球菌(Rhodococcus sp.)。
[0008]本發(fā)明所提供的吡啶降解菌TJKYBD-01的培養(yǎng)條件為，將其接種于培養(yǎng)基中，溫度為25-35°(3，初始口11為7-9，接種量為2%-5%，搖床轉(zhuǎn)速為100-150 rpm。
[0009]所述培養(yǎng)基的配方為，Na2HP04.12H20 4.26g,KH2P042.65g,MgS04.7H20 0.20g,CaCl20.006g,FeS04.7H20 0.02g，2mL微量元素儲(chǔ)備液，補(bǔ)足蒸餾水至lOOOmL;所述微量元素儲(chǔ)備液組分為 MnS04.H2O 0.1g，ZnS〇4.7H20 0.12g,H3B030.07g ,Na2Mo04.H200.04g，CuS04.5H20 0.02g，CoCl20.04g，補(bǔ)足蒸餾水至lOOOmL。
[0010]本發(fā)明的吡啶降解菌TJKYBD-01能夠耐受濃度高達(dá)1500 mg/L的吡啶。
[0011]含有本發(fā)明所述吡啶降解菌TJKYBD-01的菌劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]本發(fā)明提供了吡啶降解菌TJKYBD-01或含有其的菌劑在凈化工業(yè)廢水中的應(yīng)用。
[0013]所述的工業(yè)廢水為焦化廢水、煤化工廢水和石油化工廢水中的一種。
[0014]本發(fā)明的吡啶降解菌TJKYBD-01能利用吡啶作為唯一碳源、氮源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，在48 h內(nèi)將1000 mg/L的吡啶降解完全。
[0015]發(fā)明的吡啶降解菌TJKYBD-01能利用吡啶作為唯一碳源、氮源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，在48h內(nèi)將< 1000mg/L的吡啶降解完全。吡啶降解菌TJKYBD-01能耐受濃度高達(dá)1500mg/L的吡啶，對(duì)較高濃度吡啶工業(yè)廢水具有優(yōu)良的降解效果，該菌可應(yīng)用于焦化廢水、煤化工廢水和石油化工廢水的生物強(qiáng)化處理，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為吡啶降解菌TJKYBD-01的生長(zhǎng)與吡啶降解效果關(guān)系圖。
[0017]圖2為吡啶初始濃度對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01降解吡啶的影響圖。
[0018]圖3為培養(yǎng)溫度對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01降解吡啶的影響。
[0019]圖4為初始pH值對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01降解吡啶的影響圖。
[0020]圖5為接種量對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01降解吡啶的影響圖。
[0021 ]圖6為搖床轉(zhuǎn)速對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01降解吡啶的影響圖。
[0022]圖7為吡啶降解菌TJKYBD-01對(duì)添加較高濃度吡啶的焦化廢水的強(qiáng)化處理效果圖。
[0023]圖8為吡啶降解菌TJKYBD-01對(duì)添加較高濃度吡啶的煤化工廢水的強(qiáng)化處理效果圖。
[0024]圖9為吡啶降解菌TJKYBD-01對(duì)添加較高濃度吡啶的石油化工廢水的強(qiáng)化處理效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026]若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027]實(shí)施例1吡啶降解菌TJKYBD-01的分離、鑒定及其對(duì)吡啶的降解性能
[0028]1、菌株的分離、純化
[0029](1)菌種來(lái)源
[0030]菌源采自焦化廢水處理站周邊的土壤，呈黑褐色，采集距表層4-8cm的土壤樣品6份。
[0031](2)菌株的分離純化
[0032]將采集的土樣加入無(wú)菌蒸餾水空曝48h，靜置后取lOmL上清液接種于90mL含300mg/L吡啶的LB培養(yǎng)基(蛋白胨1 %，氯化鈉1 %，酵母抽提物0.5 % )中，在30°C和150 r/min活化培養(yǎng)24h。取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至含吡啶300mg//L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，同樣條件馴化培養(yǎng)2-3d，然后取5mL培養(yǎng)液移接至新鮮吡啶無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，如此反復(fù)3次，其中吡啶濃度分別為300、500、100011^/1;將含吡啶100011^/1的馴化液按不同比例稀釋?zhuān)謩e涂布于含吡啶500mg/L的吡啶無(wú)機(jī)鹽平板上，30°C培養(yǎng)3d。挑選邊緣清晰的菌落，經(jīng)LB平板劃線(xiàn)純化至獲得單菌落，分別進(jìn)行吡啶降解試驗(yàn)。確定各菌株降解吡啶能力后，以含吡啶500mg/L的LB斜面保藏降解性能優(yōu)良的菌株。
[0033]2、菌株的鑒定
[0034](1)吡啶降解菌TJKYBD-01的菌落形態(tài)特征及生理生化特性
[0035]吡啶降解菌TJKYBD-01菌落為粉紅色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤(rùn)，中心凸起。
[0036](2)吡啶降解菌TJKYBD-01 的 16S rRNA鑒定
[0037]對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01的16S rRNA基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，然后在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果顯示，與其序列相似性達(dá)到99%的均為紅球菌屬(Rhodococcus sp.)，其16S rDNA序列如序列表所示。結(jié)合菌株的生理生化特性，將其歸屬于紅球菌屬(Rhodococcus sp.)，編號(hào)為T(mén)JKYBD-01。
[0038]該菌株于2014年12月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10175，分類(lèi)名為紅球菌(Rhodococcus sp.)。
[0039]3、菌懸液的制備
[0040]挑取一環(huán)細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基，30°C、150rpm培養(yǎng)24h，取5mL培養(yǎng)物接于新鮮LB培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)7-8h(細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，5000rpm、lOmin離心收集菌體，并用卩比啶無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(PH7.5)洗滌3次，重懸于吡啶無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至0D600 = 1，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041 ] 4、對(duì)吡啶降解菌TJKYBD-01的生長(zhǎng)與其對(duì)吡啶的降解效果的關(guān)系
[0042]將吡啶降解菌TJKYBD-01接種于含500mg/L吡啶的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C，150r/min搖床培養(yǎng)，連續(xù)測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)及吡啶的殘留濃度如圖1所示，測(cè)定結(jié)果表明:吡啶降解菌TJKYBD-01的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)吡啶的降解過(guò)程基本同步，該菌能利用吡啶作為唯一碳、氮和能源物質(zhì)促進(jìn)自身生長(zhǎng)，并對(duì)吡啶有良好的降解效果。
[0043 ] 5、培養(yǎng)條件對(duì)吡啶降解菌T JKYBD-01的生長(zhǎng)及其降解吡啶的能力的影響
[0044](1)吡啶初始濃度的影響:考察不同的吡啶初始濃度(100、300、500、800、1000、1500m