鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及禽用生物制品領(lǐng)域，特別涉及鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒（DHV)引起雛鴨的一種高度致死性、傳播迅速的病 毒性疾病，以肝炎為其主要特征。如果防治不當(dāng)，死亡率很高，對養(yǎng)鴨場會(huì)造成很大的經(jīng)濟(jì) 損失。
[0003] 鴨病毒性肝炎于1958年始發(fā)于我國上海地區(qū)，迄今為止，該病已在我國流行50多 年。根據(jù)大量的文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，表明目前在我國大量流行的鴨病毒性肝炎的 發(fā)生主要由DHAV-I型和DHAV-3型感染所致，其中單個(gè)血清型的流行占據(jù)70%以上，兩種 血清型的混合感染占據(jù)小于30%的比例，但是目前臨床現(xiàn)有的鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體 主要以二價(jià)抗體為主，并未針對地方所流行血清型來選擇特異性抗體。DHAV-I型和DHAV-3 型之間幾乎沒有交叉保護(hù)，這樣無疑造成了非特異性抗體的浪費(fèi)。為了適應(yīng)市場需求，降低 非特異性鴨肝抗體的浪費(fèi)，研宄一種鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體的新型制備方法，根據(jù)地 方流行鴨肝炎病毒血清型來選擇相應(yīng)的血清型抗體預(yù)防和治療，迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明旨在通過分離目前臨床最流行的鴨肝炎病毒的血清型毒株，提 出鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體的制備方法，以制備出高效價(jià)、高特異性、高純度、無任何外 源微生物污染的鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體。
[0005] 本發(fā)明提出了一種鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體的制備方法，包括以下步驟：分離 鴨病毒性肝炎毒株和制備滅活疫苗；所述滅活疫苗免疫健康產(chǎn)蛋雞群得到高免蛋，分離蛋 黃后經(jīng)酸化處理、辛酸處理、離心、板框過濾、滅活、超濾、配液、過濾除菌后得到鴨病毒性肝 炎精制蛋黃抗體。
[0006] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0007] 1)將鴨病毒性肝炎1型和鴨病毒性肝炎3型毒株單獨(dú)做苗，分開免疫健康產(chǎn)蛋雞 群，避免了兩種抗原在同一機(jī)體中的免疫應(yīng)答競爭影響的因素，每種血清型的抗體效價(jià)單 獨(dú)控制，避免因一種血清型抗體效價(jià)不高時(shí)，再次免疫二聯(lián)疫苗對另一種血清型抗原造成 免疫耐受的后果。
[0008] 2)通過辛酸處理、離心、板框過濾、滅活等環(huán)節(jié)處理，該技術(shù)非常適合大規(guī)模生產(chǎn)， 得到了無類脂物質(zhì)、無任何外源微生物污染的高效價(jià)精制蛋黃抗體。
[0009] 3)中和效價(jià)均高于1:350,中和效價(jià)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的鴨病毒性肝炎二價(jià)精制蛋黃抗 體。
[0010] 4)鴨病毒性肝炎1型和鴨病毒性肝炎3型疫苗分開免疫雞群，單獨(dú)生產(chǎn)制備抗體， 可以針對特定鴨病毒性肝炎血清型的流行區(qū)域制備同種血清型的抗體，避免了非特異性抗 體的浪費(fèi)，降低了養(yǎng)殖戶的抗體使用成本。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例的鴨肝炎病毒1型引物擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0012] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例的鴨肝炎病毒3型引物擴(kuò)增結(jié)果示意圖。
[0013] 圖1中，M :MarkerDL2000 ;1 :已知1型鴨肝炎病毒；2 :待檢鴨肝炎肝臟病料；3 :已 知3型鴨肝炎肝臟病料；4 :鴨瘟病毒；5 :番鴨細(xì)小病毒；
[0014] 圖2中，M :MarkerDL2000 ;1 :已知3型鴨肝炎病毒；2 :待檢鴨肝炎肝臟病料；3 :已 知1型鴨肝炎肝臟病料；4 :鴨瘟病毒；5 :番鴨細(xì)小病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下優(yōu)選實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵺`它們。
[0016] 下面對本發(fā)明做詳細(xì)描述。
[0017] 鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體的制備方法，包括以下步驟：分離鴨病毒性肝炎毒株 和制備滅活疫苗；所述滅活疫苗免疫健康產(chǎn)蛋雞群得到高免蛋，分離蛋黃后經(jīng)酸化處理、辛 酸處理、離心、板框過濾、滅活、超濾、配液、過濾除菌后得到鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體。
[0018] 其中，以下菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心：
[0019] 名稱鴨肝炎病毒 SD-1 株 Duck hepatitis virus ;
[0020] 保藏編號(hào) CCTCC V201440 ;
[0021] 保藏日期2014年11月2日；
[0022] 簡稱為鴨肝炎病毒SD-I株；
[0023] 保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)。
[0024] 名稱鴨肝炎病毒 SD-3 株 Duck hepatitis virus ;
[0025] 保藏編號(hào) CCTCC V201441 ;
[0026] 保藏日期2014年11月2日；
[0027] 簡稱為鴨肝炎病毒SD-3株；
[0028] 保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)。
[0029] 本發(fā)明所述鴨病毒性肝炎毒株為鴨病毒性肝炎1型（DHAV-I)和鴨病毒性肝炎3 型（DHAV-3)毒株中的一種或兩種；所述鴨病毒性肝炎1型的所述免疫原性較好的血清型病 毒為鴨肝炎病毒SD-I株CCTCC V201440 ;所述鴨病毒性肝炎3型的所述免疫原性較好的血 清型病毒為鴨肝炎病毒SD-3株CCTCC V201441。
[0030] 所述步驟具體為：
[0031] 一、免疫抗原（疫苗）的制備
[0032] I. 1分離鴨病毒性肝炎毒株和制備滅活疫苗：選取鴨病毒性肝炎毒株接種鴨胚， 分離篩選到免疫原性較好的血清型的病毒，將獲得的免疫原性較好的血清型的病毒用滅菌 生理鹽水做1:1000倍稀釋后，絨毛尿囊腔接種11日齡非免疫鴨胚，每胚0. 2ml，置37? 38°C繼續(xù)孵育。24h內(nèi)死亡的鴨胚棄去，鴨胚死亡時(shí)間穩(wěn)定在72?120小時(shí)，死亡胚胎眼觀 病變?yōu)槿砥つw和皮下充血、出血，胚肝呈紅黃色，腫大并有針頭大小出血點(diǎn)和壞死灶，死 亡時(shí)間較長的胚胎絨尿液顯淺綠色。死亡的鴨胚置于4°C冰箱冷藏過夜，無菌收取尿囊液和 胚體，胚體用組織勻漿機(jī)處理后，反復(fù)凍融3次，4°C，5000r/min離心取上清液與尿囊液混 合，病毒液4倍濃縮，濃縮后取出部分待檢驗(yàn)及測定毒價(jià)，剩余的-20°C保存待用做制備疫 苗。
[0033] 其中，所述鴨病毒性肝炎毒株為鴨病毒性肝炎1型和鴨病毒性肝炎3型毒株中的 一種或兩種；所述鴨病毒性肝炎1型的所述免疫原性較好的血清型病毒為鴨肝炎病毒SD-I 株CCTCC V201440 ;所述鴨病毒性肝炎3型的所述免疫原性較好的血清型病毒為鴨肝炎病 毒 SD-3 株 CCTCC V201441。
[0034] 1. 2免疫原性較好的血清型病毒液純凈性檢驗(yàn)
[0035] 將濃縮后的病毒液按照現(xiàn)行《中國獸藥典》三部附錄進(jìn)行無菌、支原體、外源病毒 檢驗(yàn)，均為陰性，證明所得的病毒液均無菌、無支原體、無外源病毒污染。
[0036] 1. 3免疫原性較好的血清型病毒液病毒含量測定
[0037] 將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取KT4?KT8 5個(gè)稀釋度， 絨毛尿囊腔接種11日齡非免疫鴨胚5個(gè)，每胚0. lml。置37?38°C繼續(xù)孵育，觀察24? 96小時(shí)，24小時(shí)內(nèi)死亡鴨胚棄去，記錄24?96小時(shí)死亡雞胚數(shù)量，計(jì)算ELD 5tl含量至少為 IO6.86ELD50Ail。
[0038] 1. 4免疫原性較好的血清型病毒液滅活
[0039] 將病毒液中加入甲醛溶液，使其終濃度為0. 1 %，密閉后充分振搖混勻，置37°C溫 箱滅活48小時(shí)，期間每6小時(shí)振搖一次。
[0040] 1. 5滅活檢驗(yàn)
[0041] 對滅活液抽樣并接種11日齡非免疫鴨胚，抗原接種5枚，連續(xù)觀察7天，鴨胚全部 健活。
[0042] 1. 6疫苗乳化
[0043] ①油相制備：10號(hào)白油94份，司本-806份，硬脂酸鋁2%。硬酯酸鋁與少量白油 混合加熱熔化后，補(bǔ)足白油，加入司本-80,充分?jǐn)嚢?，分裝。116°C，30分鐘滅菌，10°C冷藏 備用。
[0044] ②水相制備：按抗原96份，吐溫-804份配制。吐溫-80加入帶玻璃珠的瓶中滅 菌。吐溫-80先與少量抗原混和，然后與大量抗原混合，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。
[0045] ③乳化：按油相3份，水相1份配制。取油相加入高速乳化機(jī)缸內(nèi)，慢速攪拌，徐 徐加入水相，加畢高速乳化2?5分鐘。取少量乳化液低于冷清水中，不擴(kuò)散為乳化完成。
[0046] L 7疫苗檢驗(yàn)
[0047] ①物理性狀：油乳佐劑抗原應(yīng)為乳白色帶粘滯性的均勻乳狀液，經(jīng)3500r/min離 心30分鐘，無分層現(xiàn)象。
[0048] ②無菌檢驗(yàn)：按現(xiàn)行《中國獸藥典》三部進(jìn)行，無菌生長。
[0049] ③安全檢驗(yàn)：每批油乳劑抗原接種20-30日齡健康雞10只，每雞頸背皮下注射 3ml，設(shè)對照組5只，隔離飼養(yǎng)，觀察15天后剖殺，兩組雞均無肉眼可見異常病理變化。
[0050] 二、免疫無病產(chǎn)蛋雞群獲得高免蛋
[0051] 2.1雞群的選擇
[0052] 選擇有正規(guī)及成熟的免疫程序的雞場，適時(shí)接種新城疫、禽流感、馬立克氏病、傳 染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊病、傳染性鼻炎、減蛋綜合征（EDS 76)、大腸桿菌等疫苗，并現(xiàn) 行《中國獸藥典》三部附錄檢測無禽白血病污染，按中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫 總局發(fā)布的《雞白痢抗體檢測方法-全血平板凝集試驗(yàn)》和《雞敗血支原體感染抗體檢測方 法-快速血清凝集試驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)對雞白痢和雞支原體病進(jìn)行檢測，陽性率均不高于0. 1%。
[0053] 2. 2免疫程序
[0054] 免疫前適當(dāng)給雞群添加抗應(yīng)激及抗菌藥物。
[0055] 第一次免疫