背景技術(shù)：

1、二尖瓣疾病是一種退行性病狀，隨著時(shí)間的推移會(huì)導(dǎo)致二尖瓣功能障礙。二尖瓣通常充當(dāng)左心房和左心室之間的密封件，以致當(dāng)心室收縮時(shí)，二尖瓣閉合并防止血液滲漏回心房，這種現(xiàn)象稱為反流。如果不進(jìn)行治療，隨著左心房變得更大以容納來(lái)自反流的額外血液，心房中的壓力增加，最終由于肺部的流體積聚而導(dǎo)致充血性心力衰竭。

2、在犬類中，大約10％接受初級(jí)保健獸醫(yī)實(shí)踐的犬類患有心臟病，其中粘液瘤性mvd(mmvd)是世界上許多地方犬類最常見(jiàn)的心臟病。mmvd占北美犬類心臟病病例的大約75％。mmvd最常影響二尖瓣，但是在至少30％的病例中，也累及三尖瓣。mmvd的分期系統(tǒng)描述了心臟病和心力衰竭的四個(gè)基本分期：a期鑒別處于發(fā)展心臟病的高風(fēng)險(xiǎn)中但目前沒(méi)有可鑒別的心臟結(jié)構(gòu)紊亂的犬類；b期鑒別患有結(jié)構(gòu)性心臟病但從未發(fā)展出由心力衰竭引起的臨床體征的犬類，b1期是指沒(méi)有至具有輕度的響應(yīng)于mmvd的心臟重塑的射線照相或超聲心動(dòng)圖證據(jù)的無(wú)癥狀犬類，b2期是指具有更嚴(yán)重的二尖瓣反流的無(wú)癥狀犬類，該反流在血液動(dòng)力學(xué)上是嚴(yán)重的并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，足以導(dǎo)致左心房和左心室增大的射線照相和超聲心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)；c期鑒別具有由mmvd引起的當(dāng)前或過(guò)去臨床體征的犬類；以及d期鑒別患有末期mmvd的犬類，其中心力衰竭的臨床體征是標(biāo)準(zhǔn)治療難治的。匹莫苯丹(pimobendan)被完全批準(zhǔn)用于管理犬類中由mmvd引起的輕度、中度或重度充血性心力衰竭的體征，并且最近被批準(zhǔn)用于治療處于mmvd臨床前分期的具有心臟雜音和心臟增大但尚未處于充血性心力衰竭的犬類。然而，沒(méi)有治愈由mmvd引起的充血性心力衰竭的方法。

3、因此，在本領(lǐng)域中需要用于治療二尖瓣疾病的改進(jìn)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開(kāi)提供了治療受試者的二尖瓣疾病的方法。所述方法通常包括向所述受試者施用基因療法，所述基因療法包含編碼可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(stgfβr2)的第一核酸和編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)的第二核酸。在某些實(shí)施方案中，基因療法與有效量的匹莫苯丹組合施用，或者施用于目前正在接受匹莫苯丹治療的受試者。

2、因此，在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種治療受試者的二尖瓣疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用基因療法，所述基因療法包含編碼可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(stgfβr2)的第一核酸和編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)的第二核酸，其中所述受試者的左心房與主動(dòng)脈根比值(la/ao)為約1.6至約2.1。在一些實(shí)施方案中，受試者的la/ao為約1.6。在一些實(shí)施方案中，受試者的la/ao為約1.8。在一些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物。

3、在某些實(shí)施方案中，受試者是犬科動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，受試者是選自以下的犬科品種：騎士查理王獵犬、迷你貴賓犬、西施犬、馬爾濟(jì)斯犬、吉娃娃犬、可卡犬、迷你雪納瑞犬、臘腸犬、惠比特犬、博美犬及其組合。在某些實(shí)施方案中，受試者是騎士查理王獵犬。

4、在某些實(shí)施方案中，二尖瓣疾病包括選自以下的一種或多種疾病或病狀：粘液瘤性二尖瓣疾病、二尖瓣狹窄、二尖瓣脫垂和二尖瓣反流。

5、在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括在施用所述基因療法之前確定所述受試者的la/ao，并且在施用所述基因療法之后的持續(xù)時(shí)間內(nèi)確定所述受試者的la/ao。在某些實(shí)施方案中，與施用所述基因療法之前所述受試者的la/ao相比，施用所述基因療法之后所述受試者的la/ao降低。

6、在某些實(shí)施方案中，受試者已施用有效量的匹莫苯丹。

7、在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述受試者施用有效量的匹莫苯丹。

8、在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種治療受試者的二尖瓣疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用基因療法和/或有效量的匹莫苯丹，所述基因療法包含編碼可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(stgfβr2)的第一核酸和編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)的第二核酸。

9、在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種在已經(jīng)接受有效量的匹莫苯丹的受試者中治療二尖瓣疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用基因療法，所述基因療法包含編碼可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(stgfβr2)的第一核酸和編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)的第二核酸。

10、在某些實(shí)施方案中，匹莫苯丹的有效量為0.25mg/kg。在一些實(shí)施方案中，基因療法和匹莫苯丹同時(shí)施用。在某些實(shí)施方案中，匹莫苯丹經(jīng)口服施用。在某些實(shí)施方案中，匹莫苯丹每天施用兩次。在某些實(shí)施方案中，匹莫苯丹的有效量為0.25mg/kg，每天兩次。

11、在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種確定用包含編碼stgfβr2的第一核酸和編碼fgf21的第二核酸的基因療法成功治療患有二尖瓣疾病的受試者的可能性的方法，所述方法包括確定受試者的la/ao，其中l(wèi)a/ao大于2.1指示用所述基因療法成功治療的可能性降低并且la/ao為約1.6至約2.1指示用所述基因療法成功治療的可能性增加。在某些實(shí)施方案中，二尖瓣疾病的成功治療包括所述受試者的la/ao與基因療法前的所述la/ao相比降低。

12、在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種鑒別患有適于用基因療法治療的二尖瓣疾病的受試者的方法，所述基因療法包含編碼stgfβr2的第一核酸和編碼fgf21的第二核酸，所述方法包括確定受試者的所述la/ao，其中如果所述受試者的la/ao為約1.6至約2.1，則所述受試者適于用所述基因療法治療。

13、在某些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，受試者是犬科動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，犬科動(dòng)物是選自以下的品種：騎士查理王獵犬、迷你貴賓犬、西施犬、馬爾濟(jì)斯犬、吉娃娃犬、可卡犬、迷你雪納瑞犬、臘腸犬、惠比特犬、博美犬及其組合。在一些實(shí)施方案中，受試者是騎士查理王獵犬。

14、在某些實(shí)施方案中，二尖瓣疾病包括選自以下的一種或多種疾病或病狀：粘液瘤性二尖瓣疾病、二尖瓣狹窄、二尖瓣脫垂和二尖瓣反流。

15、在某些實(shí)施方案中，基因療法經(jīng)靜脈內(nèi)施用。

16、在某些實(shí)施方案中，第一核酸包含可操作地連接到stgfβr2編碼序列的第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在一些實(shí)施方案中，stgfβr2編碼序列包含與seq?id?no:1、2、3或24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，stgfβr2編碼序列還包含異源或先天分泌信號(hào)序列，其中所述信號(hào)序列由與seq?id?no:4、5或6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列編碼。在某些實(shí)施方案中，stgfβr2編碼序列包含與seq?id?no:9、10、11、12或25具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，stgfβr2編碼序列編碼與seqid?no:13、14、15或26具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，stgfβr2編碼序列還編碼與seq?id?no:7或8具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的分泌信號(hào)序列。在某些實(shí)施方案中，stgfβr2編碼序列編碼與seq?id?no:16、17、18、19或27具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

17、在某些實(shí)施方案中，第二核酸包含可操作地連接到fgf21編碼序列的第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在某些實(shí)施方案中，fgf21編碼序列包含與seq?id?no:28、29、30或31具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，fgf21編碼序列編碼與seq?id?no:32、33或34具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

18、在某些實(shí)施方案中，第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件各自包含一個(gè)或多個(gè)apoe結(jié)合位點(diǎn)和/或haat啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件各自包含與seq?id?no:38、39、40和/或48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

19、在某些實(shí)施方案中，第一核酸和第二核酸各自還包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件包含多聚腺苷酸化信號(hào)和/或wpre序列。在某些實(shí)施方案中，多聚腺苷酸化信號(hào)是sv40多聚腺苷酸化信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，wpre序列是wpre3序列。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件包含與seq?id?no:50、51或70具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

20、在某些實(shí)施方案中，第一核酸包含在第一載體內(nèi)，并且第二核酸包含在第二載體內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，第一載體和/或第二載體各自為病毒載體，任選地其中各自獨(dú)立地選自腺相關(guān)病毒(aav)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、小核糖核酸病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒和甲病毒。在某些實(shí)施方案中，第一載體是包含在第一重組aav(raav)內(nèi)的aav載體，其中第一raav包含：包含aav衣殼蛋白的aav衣殼；和第一raav基因組；和/或第二載體是包含在第二raav內(nèi)的aav載體，其中第二raav包含：包含aav衣殼蛋白的aav衣殼；和第二raav基因組。

21、在某些實(shí)施方案中，所述基因療法包含：第一重組aav(raav)，其包含：包含aav衣殼蛋白的aav衣殼；和第一raav基因組，其包含編碼seq?id?no:26中所示的氨基酸序列的核酸；以及第二raav，其包含：包含aav衣殼蛋白的aav衣殼；和第二raav基因組，其包含編碼seq?id?no:33中所示的氨基酸序列的核酸。

22、在某些實(shí)施方案中，第一raav基因組包含與seq?id?no:66具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

23、在某些實(shí)施方案中，第一raav基因組還包含5’反向末端重復(fù)(5'itr)核苷酸序列和3’反向末端重復(fù)(3'itr)核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，5'itr核苷酸序列與seq?idno:58或59具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，和/或3'itr核苷酸序列與seq?id?no:60或61具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，第一raav基因組包含與seq?id?no:67具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

24、在某些實(shí)施方案中，第二raav基因組包含與seq?id?no:68具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

25、在某些實(shí)施方案中，第二raav基因組還包含5’反向末端重復(fù)(5'itr)核苷酸序列和3’反向末端重復(fù)(3'itr)核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，5'itr核苷酸序列與seq?idno:58或59具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，和/或3'itr核苷酸序列與seq?id?no:60或61具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，第二raav基因組包含與seq?id?no:69具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

26、在某些實(shí)施方案中，aav衣殼蛋白源自進(jìn)化枝a、進(jìn)化枝b、進(jìn)化枝c、進(jìn)化枝d、進(jìn)化枝e、進(jìn)化枝f、進(jìn)化枝g、進(jìn)化枝h、進(jìn)化枝i、aavgo.1、aav3、aav4、aav10、aav11、aav12、rh.32、rh32.33、rh.33、rh.34、baav或aav5衣殼蛋白或其工程化變體。在某些實(shí)施方案中，aav衣殼蛋白包含與seq?id?no:63、64和/或65具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

27、在某些實(shí)施方案中，第一核酸和第二核酸包含在載體內(nèi)，任選地其中第一核酸和第二核酸被多順?lè)醋釉珠_(kāi)。在某些實(shí)施方案中，載體包含：第一核酸，其包含編碼seqid?no:26中所示的氨基酸序列的核酸；第二核酸，其包含編碼seq?id?no:33中所示的氨基酸序列的核酸。在某些實(shí)施方案中，第一核酸和第二核酸被多順?lè)醋釉珠_(kāi)。在某些實(shí)施方案中，多順?lè)醋釉莍res或2a序列。在某些實(shí)施方案中，多順?lè)醋釉cseq?idno:55、56或57具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

28、在某些實(shí)施方案中，載體是包含在重組aav(raav)內(nèi)的aav載體，其中所述raav包含：包含aav衣殼蛋白的aav衣殼；和raav基因組。在某些實(shí)施方案中，aav衣殼蛋白源自進(jìn)化枝a、進(jìn)化枝b、進(jìn)化枝c、進(jìn)化枝d、進(jìn)化枝e、進(jìn)化枝f、進(jìn)化枝g、進(jìn)化枝h、進(jìn)化枝i、aavgo.1、aav3、aav4、aav10、aav11、aav12、rh.32、rh32.33、rh.33、rh.34、baav或aav5衣殼蛋白或其工程化變體。在某些實(shí)施方案中，aav衣殼蛋白包含與seq?id?no:63、64和/或65具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。