本發(fā)明屬于海產(chǎn)品深加工領(lǐng)域，具體涉及一種海鱸魚副產(chǎn)物的酶解方法及其在乳劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)是魚類養(yǎng)殖和捕撈大國(guó)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)(趙占西等，2001)。2012年鱸魚的出塘量為968.49噸，2013年則為785.96噸。

魚類的加工過程會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，如魚頭、魚骨和魚皮等，廢棄的這一部分加工副產(chǎn)物約占原材料總重的40％～50％(龔鋼明等，2003)，這些廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)，如魚鱗中蛋白質(zhì)含量在60％左右(申鋒，2009)。大量加工副產(chǎn)物未得到有效的利用，容易腐爛變質(zhì)，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了一定的污染。為了更好的利用這些蛋白質(zhì)，同時(shí)為了保證其食用品質(zhì)和生產(chǎn)安全，有必要對(duì)這些魚類加工副產(chǎn)物進(jìn)行深加工。

海鱸魚是廣東省產(chǎn)量最高的海洋經(jīng)濟(jì)魚，在其加工過程中產(chǎn)生大量魚皮、魚頭、魚骨等副產(chǎn)物，這些廢棄物總重量可以占到原料魚的40％～55％，里面不但含有大量的蛋白質(zhì)，脂類等，有的還具有一些特殊的活性物質(zhì)。所以對(duì)鱸魚副產(chǎn)物進(jìn)行深加工具有重要意義。

目前對(duì)加工副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的利用主要有兩種方式，堿法提取和酶法提取。酶法水解蛋白質(zhì)，生成許多小分子肽或氨基酸，易于吸收利用，且其溶解性、保水性、乳化性、起泡性等均可獲得一定程度的改善，以滿足實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的需求。不同的酶具有不同的酶切位點(diǎn)，根據(jù)實(shí)際需求，可以選擇不同的酶。單酶酶解存在酶切位點(diǎn)單一，水解能力有限等不足；而添加多種酶進(jìn)行同步酶解中，由于每個(gè)酶的最適反應(yīng)條件不同，偏離最適條件會(huì)讓酶活力降低進(jìn)而影響酶解效果。分步復(fù)合酶解是一種組合利用不同酶特性的酶解方式，通過分步酶解可以使酶解產(chǎn)物的組成更加豐富。例如，胃蛋白酶作為位點(diǎn)少，僅作用于肽鏈兩端的芳香族氨基酸，酶解需在酸性條件下進(jìn)行；而堿性蛋白酶作用位點(diǎn)多，適宜于在堿性條件下進(jìn)行，兩種酶解物的加工性能也有所差異，因此如何根據(jù)需求選擇不同酶切位點(diǎn)的酶搭配是難點(diǎn)。

此外，酶的選擇和水解條件在一定程度上也會(huì)影響魚蛋白肽的功能性質(zhì)，(Croaker et al，2007)。例如，胃蛋白酶酶制備的膠原蛋白肽具有良好的功能性質(zhì)，起泡性、乳化性等，但是產(chǎn)物粘度較高，溶解性較差，這與胃蛋白酶的酶切位點(diǎn)有很大關(guān)系，其僅作用于肽鏈兩端是芳香族的氨基酸，所得多肽片段較大。而木瓜蛋白酶制備的產(chǎn)物溶解性較好，但其他的功能特性如乳化性、起泡性較差，粘度降低。適度的酶解能夠改善蛋白質(zhì)的功能特性，但是水解度較大時(shí)，肽鏈較短，影響產(chǎn)物的凝膠型乳化性等(Yin et al，2008)。

蛋白質(zhì)常用的功能特性主要有溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、持水性、吸油性等(劉東兒等，2010)。受其本身結(jié)構(gòu)的限制，其部分功能特性往往不能良好的適應(yīng)食品加工需求，為了更好的利用蛋白質(zhì)的功能特性，酶法改性是常用的手段。但是如上所述，酶解的工藝以及條件選擇對(duì)于水解產(chǎn)物的功能關(guān)系重大，而且過度酶解會(huì)使某些功能特性大幅降低甚至喪失(kazunobu T，2009；popineau Y，2002；Gaurav G，2010)，進(jìn)而影響這些水解產(chǎn)物在工業(yè)中的應(yīng)用。

目前來說鱸魚副產(chǎn)物的酶解產(chǎn)物多用于生產(chǎn)魚粉或調(diào)味品等低附加值產(chǎn)品，甚至部分作為廢料直接丟棄，沒有完全發(fā)揮其的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成資源與環(huán)境浪費(fèi)。此外，其在臨床營(yíng)養(yǎng)品中的應(yīng)用也未見報(bào)道。

現(xiàn)在市面上常見的臨床營(yíng)養(yǎng)品為整蛋白型，但是對(duì)于一部分腸胃存在消化吸收功能障礙病人來說，短肽型的預(yù)消化營(yíng)養(yǎng)品利用率高，無需經(jīng)過消化吸收，則可直接被腸道吸收，這種特性使其是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。但是短肽型營(yíng)養(yǎng)品尤其是全營(yíng)養(yǎng)的復(fù)雜體系乳劑產(chǎn)品存在穩(wěn)定性不佳的問題，而添加過多的穩(wěn)定劑會(huì)使體系粘度增大，流動(dòng)性變差，不利于臨床使用。

因此，如何選擇不同酶切位點(diǎn)的酶搭配進(jìn)行復(fù)合酶解，研發(fā)附加值高的水解產(chǎn)物，并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，或進(jìn)一步用于臨床營(yíng)養(yǎng)品的應(yīng)用，具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的海鱸魚下腳料難以有效綜合利用的問題，提供了一種一種鱸魚副產(chǎn)物的酶解方法及其在乳劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種海鱸魚副產(chǎn)物的酶解方法，包括以下步驟：

(1)預(yù)處理：將海鱸魚副產(chǎn)品，進(jìn)行脫脂，干燥，得到脫脂海鱸魚加工副產(chǎn)物；

(2)酶解：取脫脂海鱸魚加工副產(chǎn)物，調(diào)節(jié)料水比，調(diào)節(jié)溫度為45-60℃，pH為8-10，加入堿性蛋白酶，充分酶解；不滅酶，繼續(xù)調(diào)節(jié)溫度為40-55℃，pH為6-8，加入風(fēng)味蛋白酶，充分酶解；

(3)酶解產(chǎn)物制備：終止酶解反應(yīng)，滅酶，冷凍干燥備用。

優(yōu)選的，步驟(1)中海鱸魚副產(chǎn)物，包括海鱸魚魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗等。

優(yōu)選的，步驟(1)中，脫脂前需要進(jìn)行預(yù)處理包括：沖洗去血絲，瀝干水分，經(jīng)過充分絞碎。

優(yōu)選的，步驟(1)脫脂用的有機(jī)溶劑包括石油醚、乙醚、氯仿。

優(yōu)選的，步驟(1)脫脂用的有機(jī)溶劑為石油醚。

優(yōu)選的，步驟(1)脫脂時(shí)，用石油醚與海鱸魚副產(chǎn)物按照質(zhì)量比(2-4):1混合，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，攪拌時(shí)間為0.5-2h，并重復(fù)數(shù)次，進(jìn)行脫脂。

優(yōu)選的，步驟(1)中干燥可采用自然風(fēng)干的方式。

優(yōu)選的，步驟(2)取脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物，調(diào)節(jié)料水的質(zhì)量體積比為1:(3-5)。

優(yōu)選的，步驟(2)調(diào)節(jié)pH用食用酸或食用堿。

優(yōu)選的，步驟(2)中，堿性蛋白酶的添加量為2000-6000U/g，酶解時(shí)間為1h-6h。

優(yōu)選的，步驟(2)調(diào)節(jié)料水比后，調(diào)節(jié)溫度為50℃～55℃，pH為9～9.5，加入堿性蛋白酶，添加量為3500-4500U/g，酶解時(shí)間為1.0-3h。

優(yōu)選的，步驟(2)中，風(fēng)味蛋白酶的添加量為2000-6000U/g，酶解時(shí)間為1h-6h。

優(yōu)選的，步驟(2)中，不滅酶，繼續(xù)調(diào)節(jié)溫度為45℃～50℃，pH為6.5-7.5，加入堿性蛋白酶，添加量為3500-4500U/g，酶解時(shí)間為1.0-3h。

優(yōu)選的，步驟(2)中堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解時(shí)間均為1.5h，總共3h。

優(yōu)選的，步驟(3)中，在總的酶解時(shí)間為3h的整個(gè)酶解過程中，選定酶解4-10min、25-35min、105-115min和175-185min四個(gè)時(shí)間終止酶解反應(yīng)，滅酶，離心，取上清液蒸發(fā)濃縮，并進(jìn)行透析，真空冷凍干燥，制備得到四個(gè)不同水解度的產(chǎn)物A、B、C、D。

優(yōu)選的，步驟(3)中，在總的酶解時(shí)間為3h的整個(gè)酶解過程中，選定酶解5min、30min、110min和180min四個(gè)時(shí)間終止酶解反應(yīng)，沸水浴10min滅酶，離心，蒸發(fā)濃縮，并進(jìn)行透析，真空冷凍干燥，制備得到四個(gè)不同水解度的產(chǎn)物A、B、C、D。其中，產(chǎn)物A和B僅為堿性蛋白酶酶解后的產(chǎn)物，產(chǎn)物C和D為堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步復(fù)合酶解后的產(chǎn)物。

優(yōu)選的，步驟(3)透析時(shí)，截留分子量為70-120，透析時(shí)間為20-30h。

本發(fā)明以海鱸魚加工副產(chǎn)物為原料，其中存在大量魚骨，在酶解過程中，蛋白質(zhì)被剝離下來，一部分鹽也隨之進(jìn)入酶解液，透析脫鹽可以去除大部分酶解液中的鹽分。

上述酶解方法制備得到的酶解產(chǎn)物。

上述酶解產(chǎn)物在乳劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，酶解產(chǎn)物以20％的質(zhì)量比替代乳劑產(chǎn)品中的酪元酸鈉。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明首次采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步復(fù)合酶解處理海鱸魚下腳料。堿性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，作用時(shí)要求在水解處的羥基測(cè)具有芳香族氨基酸(如酪氨酸，苯丙氨酸)或疏水性氨基酸(如亮氨酸，苯丙氨酸)所構(gòu)成的肽鍵，具有水解酯鍵，酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯、轉(zhuǎn)肽功能，其具有較強(qiáng)的蛋白水解能力。風(fēng)味蛋白酶則是一種以端肽酶為主的復(fù)合型蛋白酶，在水解蛋白質(zhì)時(shí)，主要發(fā)揮端肽酶的作用，從多肽鏈的末端水解多肽。本發(fā)明充分利用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶切位點(diǎn)的不同，兩種蛋白酶相互作用，互相促進(jìn)，一種蛋白酶切斷肽鏈后，為另外一種蛋白酶提供了更多的酶切位點(diǎn)，從而高效地水解蛋白質(zhì)；分步酶解，可使酶在各自最適反應(yīng)條件下酶解，避免了同步酶解時(shí)由于每個(gè)酶的最適反應(yīng)條件不同，而影響酶解效果。本發(fā)明分步復(fù)合酶解3h的水解度為13.96％，大于同步酶解水解度13.18％，大于單酶酶解。

本發(fā)明所利用的原料為低值海鱸魚下腳料，達(dá)到變廢為寶，降低環(huán)境污染，提高效益的效果。本發(fā)明優(yōu)化了堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解條件，分步復(fù)合酶解3h的水解度為13.96％，大于同步酶解水解度13.18％，大于單酶酶解。通過控制酶解時(shí)間獲得四個(gè)酶解產(chǎn)物A、B、C、D，水解度分別為3.6％、7.45％、9.59％和13.68％，此時(shí)氮收率分別為24.20％、33.44％、50.54％、57.15％。

本發(fā)明所獲得的酶解產(chǎn)物凍干蛋白粉A、B、C和D含有豐富的多肽和氨基酸組成，16種氨基酸組成中，含有8種必須氨基酸，其中組氨酸為嬰兒必須氨基酸。根據(jù)FAO/WHO評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，必須氨基酸含量占非必須氨基酸含量的60％，必須氨基酸含量占總氨基酸含量的40％左右為優(yōu)質(zhì)蛋白。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，酶解所得的產(chǎn)物A、B、C和D符合上述標(biāo)準(zhǔn)，均為優(yōu)質(zhì)蛋白，氨基酸含量豐富平衡效果較好，這為其在臨床營(yíng)養(yǎng)品中的應(yīng)用提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

四個(gè)酶解產(chǎn)物性質(zhì)的研究表明，四個(gè)酶解產(chǎn)物的分子量分布從大到小，隨著酶解程度的加深，酶解產(chǎn)物A、B、C、D的分子量分布逐漸向低分子量段遷移。加入風(fēng)味蛋白酶后，酶解產(chǎn)物分布趨于集中，峰強(qiáng)度增加、峰數(shù)量減少。酶解產(chǎn)物氨基酸總量和疏水性氨基酸含量均增加，呈現(xiàn)正相關(guān)。四個(gè)酶解產(chǎn)物的溶解性均良好，四個(gè)酶解產(chǎn)物的表面疏水性和乳化性良好，粘度值良好。符合臨床乳劑產(chǎn)品的加工要求。

四個(gè)酶解產(chǎn)物在臨床營(yíng)養(yǎng)品加工中的應(yīng)用研究表明，酶解產(chǎn)物A、B、C、D具有營(yíng)養(yǎng)和優(yōu)良乳化性能的雙重優(yōu)點(diǎn)，可以部分替代全營(yíng)養(yǎng)品中的酪元酸鈉，所得到的配方符合臨床乳劑產(chǎn)品的要求，同時(shí)能夠提供更為豐富的多肽和氨基酸。

附圖說明

圖1為飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；

圖2為飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；

圖3為飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；

圖4為飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；

圖5為飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；

圖6為飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；

圖7為四個(gè)酶解產(chǎn)物氮溶解指數(shù)NSI的比較；

圖8為四個(gè)酶解產(chǎn)物乳化性活力指數(shù)EAI的對(duì)比；

圖9為四個(gè)酶解產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性ESI的比較；

圖10為四個(gè)酶解產(chǎn)物剪切速率-粘度變化曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1

將新鮮海鱸魚魚頭、魚骨、魚皮沖洗去血絲，瀝干水分，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，將所得魚糜混勻后，再經(jīng)絞肉機(jī)絞碎一次，分裝備用。

取適量下腳料，以1:3的質(zhì)量比加入石油醚脫脂，攪拌1h，重復(fù)3次，自然風(fēng)干12h，得到脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物。

取一定量的脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物，調(diào)節(jié)料水的質(zhì)量體積比為1:4，設(shè)定磁力攪拌器溫度為50℃，預(yù)熱半小時(shí)，利用堿調(diào)節(jié)pH為9，加入堿性蛋白酶，酶添加量4000U/g，酶解溫度為50℃，酶解1.5h；不滅酶，利用酸調(diào)節(jié)pH值為7，加入風(fēng)味蛋白酶4000U/g，酶解溫度為50℃，繼續(xù)酶解1.5h。酶解期間選定酶解5min、30min、110min和180min四個(gè)時(shí)間終止酶解反應(yīng)，獲得四個(gè)酶解產(chǎn)物A、B、C、D。

沸水浴10分鐘滅酶終止反應(yīng)后，4000r/min離心15min。離心后的上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將所得的酶解液進(jìn)行濃縮，濃縮條件：冷凝溫度為5℃，加熱溫度為50～65℃，真空度為5pa，旋轉(zhuǎn)速度為110r/min。酶解液濃縮到一定體積，使用截留分子量100的透析袋透析24h，白天每3h換一次雙蒸水，其中夜間間隔8h，透析完成后再次濃縮到一定濃度，將濃縮后的水解液放入真空冷凍干燥器中，控制溫度為-82℃，壓力為3pa進(jìn)行冷凍干燥，制成粉狀物，得到蛋白水解物。

經(jīng)測(cè)定所得產(chǎn)物A、B、C、D的水解度分別為3.6％、7.45％、9.59％和13.68％，氮收率分別為24.20％、33.44％、50.54％、57.15％，氨基酸組成如表1。

表1四個(gè)酶解產(chǎn)物氨基酸組成及含量分析結(jié)果(g/100g)

由表1可得知：四種產(chǎn)物均為優(yōu)質(zhì)蛋白。氨基酸的組成和含量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，表1中列出了酶解產(chǎn)物A、B、C和D凍干蛋白粉的16種氨基酸組成，含有8種必須氨基酸，其中組氨酸為嬰兒必須氨基酸。根據(jù)FAO/WHO評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，必須氨基酸含量占非必須氨基酸含量的60％，必須氨基酸含量占總氨基酸含量的40％左右為優(yōu)質(zhì)蛋白。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，酶解所得的產(chǎn)物A、B、C和D符合上述標(biāo)準(zhǔn)，均為優(yōu)質(zhì)蛋白，氨基酸含量豐富平衡效果較好，這為其在臨床營(yíng)養(yǎng)品中的應(yīng)用提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

實(shí)施例2

將新鮮海鱸魚魚頭、魚骨、魚皮沖洗去血絲，瀝干水分，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，將所得魚糜混勻后，再經(jīng)絞肉機(jī)絞碎一次，分裝備用。

取適量下腳料，以1:3的質(zhì)量比加入石油醚脫脂，攪拌2h，重復(fù)2次，自然風(fēng)干12h，得到脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物。

取一定量的脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物，按1:4的質(zhì)量體積比與水混合，設(shè)定磁力攪拌器溫度為55℃，預(yù)熱半小時(shí)，調(diào)節(jié)pH為9.5，加入堿性蛋白酶，酶添加量5000U/g，酶解2h；不滅酶；繼續(xù)調(diào)節(jié)溫度為45℃，調(diào)節(jié)pH值為7，加入風(fēng)味蛋白酶5000U/g，酶解2h。

沸水浴10分鐘滅酶終止反應(yīng)后，4000r/min離心15min。離心后的上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，濃縮條件：冷凝溫度為5℃，加熱溫度為50～65℃，真空度為5pa，旋轉(zhuǎn)速度為110r/min。酶解液濃縮到一定體積，使用截留分子量100的透析袋透析24h，白天每3h換一次雙蒸水，其中夜間間隔8h，透析完成后再次濃縮到一定濃度，將濃縮后的水解液放入真空冷凍干燥器中，控制溫度為-82℃，壓力為3pa進(jìn)行冷凍干燥，制成粉狀物，得到蛋白水解物。

實(shí)施例3

將新鮮海鱸魚魚頭、魚骨、魚皮沖洗去血絲，瀝干水分，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，將所得魚糜混勻后，再經(jīng)絞肉機(jī)絞碎一次，分裝備用。

取適量下腳料，以1:4的質(zhì)量比加入石油醚脫脂，攪拌0.5h，重復(fù)3次，自然風(fēng)干12h，得到脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物。

取一定量的脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物，按1:4的質(zhì)量體積比與水混合，設(shè)定磁力攪拌器溫度為50℃，預(yù)熱半小時(shí)，調(diào)節(jié)pH為9.2，加入堿性蛋白酶，酶添加量4500U/g，酶解溫度為50℃，酶解2.5h；不滅酶；調(diào)節(jié)pH值為6.8，加入風(fēng)味蛋白酶4500U/g，酶解溫度為50℃，繼續(xù)酶解2.5h。

沸水浴10分鐘滅酶終止反應(yīng)后，4000r/min離心15min。離心后的上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，濃縮條件：冷凝溫度為5℃，加熱溫度為50～65℃，真空度為5pa，旋轉(zhuǎn)速度為110r/min。酶解液濃縮到一定體積，使用截留分子量100的透析袋透析24h，白天每3h換一次雙蒸水，其中夜間間隔8h，透析完成后再次濃縮到一定濃度，將濃縮后的水解液放入真空冷凍干燥器中，控制溫度為-82℃，壓力為3pa進(jìn)行冷凍干燥，制成粉狀物，得到蛋白水解物。

實(shí)施例4

將新鮮海鱸魚魚頭、魚骨、魚皮沖洗去血絲，瀝干水分，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，將所得魚糜混勻后，再經(jīng)絞肉機(jī)絞碎一次，分裝備用。

取適量下腳料，以1:3的質(zhì)量比加入石油醚脫脂，攪拌1h，重復(fù)3次，自然風(fēng)干12h，得到脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物。

取一定量的脫脂鱸魚加工副產(chǎn)物，按1:4的質(zhì)量體積比與水混合，設(shè)定磁力攪拌器溫度為50℃，預(yù)熱半小時(shí)，調(diào)節(jié)pH為9，加入堿性蛋白酶，酶添加量4000U/g，酶解溫度為50℃，酶解3h(180min)，不滅酶，調(diào)節(jié)pH值為7，加入風(fēng)味蛋白酶4000U/g，酶解溫度為50℃，繼續(xù)酶解3h(180min)。

沸水浴10分鐘滅酶終止反應(yīng)后，4000r/min離心15min。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將所得的酶解液進(jìn)行濃縮，濃縮條件：冷凝溫度為5℃，加熱溫度為50～65℃，真空度為5pa，旋轉(zhuǎn)速度為110r/min。酶解液濃縮到一定體積，使用截留分子量100的透析袋透析24h，白天每3h換一次雙蒸水，其中夜間間隔8h，透析完成后再次濃縮到一定濃度，將濃縮后的水解液放入真空冷凍干燥器中，控制溫度為-82℃，壓力為3pa進(jìn)行冷凍干燥，制成粉狀物，得到蛋白水解物。

對(duì)比例1

其他同實(shí)施例4。

不同之處在于：

堿性蛋白酶組：僅利用堿性蛋白酶酶解6h(180+180min)；酶解條件同實(shí)施例4；

風(fēng)味蛋白酶組：僅利用風(fēng)味蛋白酶酶解6h(180+180min)；酶解條件同實(shí)施例4；

分步復(fù)合酶解：同實(shí)施例4；

同步酶解組：酶解溫度為50℃，pH為8，同時(shí)加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶各4000U/g，酶解時(shí)間3h。

上述各組的酶解產(chǎn)物均進(jìn)行滅酶，離心，蒸發(fā)濃縮，并進(jìn)行透析，真空冷凍干燥備用。結(jié)果分析見表2。

表2不同酶解方式酶解不同時(shí)間的水解度對(duì)比

(根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑑H檢測(cè)一些關(guān)鍵點(diǎn)的酶解數(shù)據(jù)，-處表示沒有進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)定)

如表2所示，雙酶酶解的水解能力明顯優(yōu)于單酶酶解，當(dāng)反應(yīng)6h時(shí)，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解反應(yīng)水解度分別為12.40％和14.82％，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度提升緩慢。反應(yīng)3h時(shí)，分步復(fù)合酶解與同步酶解的水解度均大于堿性蛋白酶的酶解6h時(shí)的水解度，且分步復(fù)合酶解的水解度大于同步酶解的水解度，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，分步復(fù)合酶解可以達(dá)到更高的水解度，但是從工業(yè)應(yīng)用角度來看，延長(zhǎng)時(shí)間會(huì)加大經(jīng)濟(jì)成本，水解度的提升有限。同步酶解時(shí)，綜合兩種酶的最適pH，選定反應(yīng)pH為8，pH對(duì)酶活的影響較大，造成水解度不如分步復(fù)合酶解，總酶添加量的增加使得水解度優(yōu)于單酶酶解。

本發(fā)明采取了兩種酶分步酶解的方式，與傳統(tǒng)的單酶水解或者雙酶同步復(fù)合酶解均有所不同。單酶酶解存在酶切位點(diǎn)單一，水解能力有限等不足。同步酶解中，由于每個(gè)酶的最適反應(yīng)條件不同，偏離最適條件會(huì)讓酶活力降低進(jìn)而影響酶解效果。本發(fā)明充分在堿性蛋白酶充分酶解的情況下，加入風(fēng)味蛋白酶，使得反應(yīng)的水解度得到進(jìn)一步提高，縮短了酶解時(shí)間，風(fēng)味蛋白酶所具有的外切活性豐富了產(chǎn)物的氨基酸和多肽的構(gòu)成。

對(duì)比例2

同實(shí)施例1，不同之處在于，復(fù)合酶解的順序進(jìn)行調(diào)整，先進(jìn)行風(fēng)味蛋白酶的酶解，不滅酶，再進(jìn)行堿性蛋白酶的酶解。

結(jié)果是：水解度為12.25％，氮收率為45.67％。

發(fā)明人研究中發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶催化反應(yīng)水解度均隨著時(shí)間的增加而升高。其中堿性蛋白酶催化反應(yīng)的初期，水解度變化劇烈，這可能與堿性蛋白酶酶切位點(diǎn)較多有關(guān)，在適宜的pH值等條件下，酶活較高，酶解反應(yīng)速率很快。反應(yīng)30min時(shí)，水解度為7.56％，反應(yīng)90min時(shí)水解度上升趨勢(shì)變緩，此時(shí)水解度達(dá)到8.44％，酶解3h時(shí)，水解度達(dá)到10.13％，而繼續(xù)酶解到6h時(shí)，水解度為12.40％。此時(shí)，酶解時(shí)間的延長(zhǎng)并未帶來較大幅度的水解度提升，而堿性蛋白酶催化反應(yīng)的氮收率在90min后基本趨于平緩。風(fēng)味蛋白酶催化酶解反應(yīng)水解度隨時(shí)間的增加逐步上升，在反應(yīng)前100min，堿性蛋白酶催化酶解反應(yīng)水解度大于風(fēng)味蛋白酶，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過100min，風(fēng)味蛋白酶的水解度優(yōu)于堿性蛋白酶。

如果將順序進(jìn)行調(diào)換后，風(fēng)味蛋白酶在酶解反應(yīng)進(jìn)行90min后，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶并沒有提供更佳的水解效果，反而有所浪費(fèi)。

對(duì)比例3

其他同實(shí)施例1，不同之處在于，堿性蛋白酶解時(shí)的pH調(diào)節(jié)為7.5，風(fēng)味蛋白酶酶解時(shí)pH調(diào)節(jié)為8.5。

結(jié)果為水解度為11.35％，氮收率30.58％。

由于酶和底物蛋白分子的部分基團(tuán)的解離狀態(tài)受pH值的影響非常大，pH值的變化能直接影響到酶的水解效果。酶的本質(zhì)是具有生物活性的蛋白質(zhì)，pH值的過高或者過低可以都會(huì)破壞其內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)，使酶失去活力。雖然pH值的小幅度變化不會(huì)導(dǎo)致酶的變性失活，但是仍會(huì)對(duì)酶的催化活力產(chǎn)生一定的影響。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶催化酶解反應(yīng)的氮收率均隨著pH的升高先升后降。當(dāng)pH值在9.5時(shí)，堿性蛋白酶催化反應(yīng)的氮收率最大，當(dāng)pH值在7時(shí)，風(fēng)味蛋白酶催化反應(yīng)的氮收率最大。

堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶催化酶解反應(yīng)的水解度也均隨著pH的升高先升后降。其中堿性蛋白酶在pH值低于9時(shí)，水解度隨著pH值的升高增幅明顯，水解度變化幅度較大，在pH值為9的時(shí)候，水解度最大，而后緩慢下降。風(fēng)味蛋白酶在pH值為7時(shí)水解度最大。

綜上所述，pH值在9-9.5時(shí)，堿性蛋白酶表現(xiàn)出良好的催化性能。而風(fēng)味蛋白酶的最適pH值為7。本對(duì)比例中的pH嚴(yán)重偏離了上述最佳范圍，導(dǎo)致水解度和氮收率不佳。

本發(fā)明酶解產(chǎn)物A、B、C、D的品質(zhì)分析

將實(shí)施例1所得到的冷凍干燥的酶解產(chǎn)物A、B、C、D進(jìn)行分析。

1、實(shí)驗(yàn)方法

1.1分子量分布的測(cè)定

將冷凍干燥的酶解產(chǎn)物A、B、C、D配成濃度為1mg/ml的溶液，使用基質(zhì)輔助激解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，確定其分子量范圍。

1.2氨基酸構(gòu)成分析

使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析，參照GB/T5009.124-2003。

1.3氮溶解指數(shù)NSI值的測(cè)定

精確稱取100mg左右的酶解產(chǎn)物，溶于10ml的去離子水中，室溫下磁力攪拌30min，然后NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)pH值為3、5、7、9，再磁力攪拌30min，4000r/min離心15min，取上清液用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。NSI＝上清液中蛋白質(zhì)含量/總蛋白質(zhì)含量。

1.4乳化能力與乳化穩(wěn)定性的測(cè)定與計(jì)算

乳化性測(cè)定：將樣品配制成濃度為1％(w/v)蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0，取配制好的溶液16ml至50ml離心管，加入4ml純大豆油，在10，000r/min下，均質(zhì)60s，取下層乳化液50μL，加入0.1％(W/W)的SDS溶液5.0ml，A₀表示500nm處的吸光值(Pearce and Kinsella1978)。

乳化能力大小用乳化活力指數(shù)(Emulsifying Activity Index，簡(jiǎn)稱EAI)表示。乳化穩(wěn)定性(Emulsion Stability Index，簡(jiǎn)稱ESI)(Agyare，Addo et al.，2009)。

計(jì)算公式如下：

DF為稀釋倍數(shù)，ρ為蛋白濃度，g/mL；φ為光程，φ＝0.01m；θ為油相所占分?jǐn)?shù)；A₀、A₁₀分別為0min和10min時(shí)的吸光度。產(chǎn)物比較多的時(shí)候，需精確計(jì)時(shí)，一管一管測(cè)量數(shù)值。

1.5粘度測(cè)定

將酶解產(chǎn)物A、B、C、D配置成濃度為20％蛋白液。采用AR1500流變儀，設(shè)定測(cè)定條件為：直徑60nm錐形板，間隔1mm，測(cè)量溫度25℃，剪切速率0.1-200-1。

2、結(jié)果分析：

2.1分子量測(cè)定結(jié)果

鱸魚加工副產(chǎn)物酶解產(chǎn)物是氨基酸和多肽的混合物，分子量大小不一，分布在各個(gè)分子段，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀器對(duì)其進(jìn)行分析。由于四個(gè)酶解產(chǎn)物獲得時(shí)間差異較大，水解程度不同，為了準(zhǔn)確的反映產(chǎn)物的分子量分布，同時(shí)使用分析肽和分析蛋白的方法，分別別為700D～3500D和1000D～20000D段，準(zhǔn)確的獲知酶解產(chǎn)物的分子量分布。

圖1、圖2反應(yīng)了酶解產(chǎn)物A的分子量分布，由圖1可知，在700D～3500D全段各個(gè)分子量均出現(xiàn)大小不同的峰，說明酶解產(chǎn)物A的組成豐富，產(chǎn)物分子量大小不一。這是可能由于堿性蛋白酶的酶解位點(diǎn)多，酶解產(chǎn)物為大小不同的多肽和氨基酸的混合物。在1000D以下的低分子段，可以看到879.758處有一個(gè)明顯的峰，在1400D-2500D段也有若干較強(qiáng)峰出現(xiàn)，在2500D-3500D段，2989.431D出現(xiàn)強(qiáng)度最強(qiáng)的峰，其左右還有若干強(qiáng)峰。由圖2知，3500D-20000D段，有3847.5D和4455.2D兩個(gè)較強(qiáng)峰，在6000D以上基本上無產(chǎn)物，這可能是因?yàn)閴A性蛋白酶與底物接觸后，酶切位點(diǎn)多，所獲得的多肽片段分子量相對(duì)較小。酶解產(chǎn)物A是反應(yīng)5min時(shí)獲得的，堿性蛋白酶作用時(shí)間短，并未獲得大分子段肽。

圖3、4反應(yīng)了酶解產(chǎn)物B的分子量分布，對(duì)比圖3與圖1可知，酶解產(chǎn)物B的組成更加復(fù)雜，各個(gè)分子段均出現(xiàn)明顯的峰，較強(qiáng)峰左移趨勢(shì)明顯。2000D以下出現(xiàn)若干強(qiáng)峰，2025.927處出現(xiàn)最強(qiáng)峰，這說明隨酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，酶解反應(yīng)更加充分，更多的多肽和氨基酸片段被酶切下來，一部分的分子量較大的多肽被酶解為更小的肽和氨基酸。由圖4可知，在3000D-20000D段，3234.3D、3581.9D和4469.7D出現(xiàn)三個(gè)明顯峰，酶解產(chǎn)物A也有近似的峰，這可能是因?yàn)椋附猱a(chǎn)物A和B均是由堿性蛋白酶單酶酶解所得，酶解位點(diǎn)相同，作用方式相同，所以在大分子肽段出現(xiàn)近似峰。又因?yàn)槊附猱a(chǎn)物B比A酶解時(shí)間長(zhǎng)，所以在2000D以下，出現(xiàn)峰強(qiáng)度整體大于2000D以上分子段。

圖5反應(yīng)了酶解產(chǎn)物C的分子量分布，3500D以上未檢出，2192.958D處出現(xiàn)最強(qiáng)峰。堿性蛋白酶屬于非特異性蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)切酶，作用底物廣泛，能水解所有羧基側(cè)具有芳香族或疏水性氨基酸，風(fēng)味蛋白酶同時(shí)具有內(nèi)切和外切活性，能催化水解肽鏈末端顯苦味的疏水性氨基酸。酶解產(chǎn)物C和D是兩種酶同時(shí)作用的產(chǎn)物，反應(yīng)體系的pH值適宜風(fēng)味蛋白酶作用，偏離了堿性蛋白酶的最適pH。對(duì)比酶解產(chǎn)物A和B的分子量分布圖，可以看出酶解產(chǎn)物C的峰相對(duì)集中，峰數(shù)量也少于酶解產(chǎn)物A和B，這可能是因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶的加入，兩種酶酶切位點(diǎn)不同，堿性蛋白酶偏離最適pH活性降低，風(fēng)味蛋白酶起主導(dǎo)作用，同時(shí)產(chǎn)物C是堿性蛋白酶酶解90min后加入風(fēng)味蛋白酶酶解20min時(shí)獲得的，酶解反應(yīng)90min時(shí)氮收率增加已經(jīng)趨于平緩，風(fēng)味蛋白酶的加入，可能更多的是作用于將已獲得的分子量較大的多肽酶切為分子量較小的肽，增加酶解產(chǎn)物的游離氨基酸。

圖6反應(yīng)了酶解產(chǎn)物D的分子量分布，1466.449D出現(xiàn)最強(qiáng)峰，3500D以上無檢出。與酶解產(chǎn)物A、B、C相比，酶解產(chǎn)物D酶解時(shí)間最長(zhǎng)，3h，酶解反應(yīng)充分，大分子的多肽被水解為小分子肽段和游離氨基酸，酶解產(chǎn)物D分子量分布主要集中于1500D以下。

綜上所述，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的分子量分布向低分子段遷移明顯，酶解產(chǎn)物A、B、C、D分子量分布逐漸變小。對(duì)比酶解產(chǎn)物A和B，可以發(fā)現(xiàn)，隨堿性蛋白酶作用時(shí)間增加，所得產(chǎn)物組成更加豐富，大分子的肽段被酶切為小分子的肽段。對(duì)比酶解產(chǎn)物B和C可知，風(fēng)味蛋白酶的加入使得產(chǎn)物分布趨于集中，峰強(qiáng)度增加，峰數(shù)量減少。由酶解產(chǎn)物D可知，酶解反應(yīng)3h，產(chǎn)物分子量較小，酶解反應(yīng)充分。

2.2氨基酸構(gòu)成分析結(jié)果見表1和實(shí)施例1的分析。

2.3四個(gè)酶解產(chǎn)物氮溶解指數(shù)NSI值的比較研究

由圖7可知，四個(gè)酶解產(chǎn)物的在不同的酸堿度下溶解性都表現(xiàn)良好，符合產(chǎn)品進(jìn)一步加工生產(chǎn)的要求。這可能是因?yàn)楫a(chǎn)物以多肽和氨基酸形式存在，酶解導(dǎo)致肽鏈?zhǔn)嬲褂H水性基團(tuán)暴露，電荷密度增大，極性增強(qiáng)，親水性增強(qiáng)，產(chǎn)物溶解性增加。酶解產(chǎn)物B的溶解性最好，產(chǎn)物D的溶解性一般，產(chǎn)物A和C溶解性表現(xiàn)差不多，可能是因?yàn)榈睦鋬龈稍镞^程中，蛋白質(zhì)不同程度的變性造成酶解產(chǎn)物復(fù)溶性受到一定影響。

2.4四個(gè)酶解產(chǎn)物乳化能力與乳化穩(wěn)定性的研究

如圖8、9所示，酶解產(chǎn)物A、B、C、D的乳化活力逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)物A(EAI為133.804)<產(chǎn)物B<產(chǎn)物C<產(chǎn)物D(EAI為208.191)，酶解產(chǎn)物A、B、C之間差異不顯著性(P>0.05)，四個(gè)酶解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性之間差異不顯著性(P>0.05)。乳化性的提高有利于產(chǎn)物在臨床乳劑產(chǎn)品中的進(jìn)一步應(yīng)用。

決定蛋白質(zhì)體系乳化能力的根本是親水性和親油性的平衡，隨酶解進(jìn)一步深入，暴露出大量的疏水鍵，產(chǎn)物疏水性氨基酸的含量進(jìn)一步增加，非極性鍵在內(nèi)部形成疏水核，而親水性氨基酸則分布在表面親水的環(huán)境中(高育哲，2008)，提升了酶解產(chǎn)物的表面活性，降低了界面張力。水解度越高，暴露出的疏水基越多，表面疏水性越高，界面張力越低，乳化性越好(YIN S W et al，2008；LIU X M，2005)。

2.5四個(gè)酶解產(chǎn)物粘度的測(cè)定

圖10表示酶解產(chǎn)物A、B、C、D隨剪切速率增加粘度變化的曲線圖，四個(gè)樣品都表現(xiàn)出良好的假塑性流體性質(zhì)，粘度值均較低，在較低的剪切速率下粘度值呈急劇下降趨勢(shì)，在較高的剪切速率下，產(chǎn)物C的粘度值最大，產(chǎn)物D的粘度值最小。

本發(fā)明酶解產(chǎn)物在臨床營(yíng)養(yǎng)乳劑中的應(yīng)用

將酶解產(chǎn)物A、B、C、D按照20％的比例替代完全營(yíng)養(yǎng)品配方(力全平)中的酪元酸鈉，完全營(yíng)養(yǎng)品配方做對(duì)照，具體配方見表3，采用高速組織勻漿機(jī)，將配置好的營(yíng)養(yǎng)品乳劑于2,0000r/min下，均質(zhì)15min。測(cè)定其對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響、穩(wěn)定系數(shù)R和粘度值。

表3完全營(yíng)養(yǎng)品配方(力全平)基本成分表

注；力全平為保密配方，未列出具體成分及配比。

1、酶解產(chǎn)物的替代比對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

酶解產(chǎn)物A、B、C、D在0替代時(shí)，體系的乳化活力指數(shù)為881.18m²/g；

酶解產(chǎn)物A以20％替代比時(shí)，體系的乳化活力指數(shù)為601.38m²/g，乳化穩(wěn)定性為62.1％；

酶解產(chǎn)物B以20％替代比時(shí)，體系的乳化活力指數(shù)為594.35m²/g，乳化穩(wěn)定性為67.8％；

酶解產(chǎn)物C以20％替代比時(shí)，體系的乳化活力指數(shù)為750.86m²/g，乳化穩(wěn)定性為64.7％；

酶解產(chǎn)物D以20％替代比時(shí)，體系的乳化活力指數(shù)為852.43m²/g，乳化穩(wěn)定性為65.5％。

酪元酸鈉作為大分子蛋白具有很高的乳化活力，酶解產(chǎn)物A、B、C、D以20％替代酪元酸鈉，乳化活性相比0替代比時(shí)均有所下降，但仍然具有較高的乳化活性。酶解產(chǎn)物D以20％替代后與0替代無顯著差異，說明了酶解產(chǎn)物替代酪元酸鈉后仍然具有較好的乳化性和乳化穩(wěn)定性，復(fù)合加工要求。

2、穩(wěn)定性系數(shù)實(shí)驗(yàn)

營(yíng)養(yǎng)品乳劑是一個(gè)復(fù)雜體系，含有蛋白質(zhì)，糖類，酯類，維生素類和礦物質(zhì)類等，以滿足特定的能量和營(yíng)養(yǎng)需求。在簡(jiǎn)單體系中表現(xiàn)出良好乳化活性和乳化穩(wěn)定性的酶解產(chǎn)物并不一定在復(fù)雜體系中表現(xiàn)良好。受樣品條件的制約無法將其經(jīng)膠體磨后再經(jīng)高壓均質(zhì)，本發(fā)明以高速組織勻漿機(jī)進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單的模擬，對(duì)于進(jìn)一步研究提供參考。

穩(wěn)定系數(shù)R：取一定量乳液于2000r/min離心5min，取中間液稀釋100倍，用分光光度計(jì)及在750nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2，與離心前的吸光值比A1。

R＝A2/A1。

體系的穩(wěn)定性系數(shù)見表4。

表4酶解產(chǎn)物替代20％蛋白體系穩(wěn)定性系數(shù)R的比較

表4所示為四個(gè)酶解產(chǎn)物替代全營(yíng)養(yǎng)品乳劑中20％的酪元酸鈉，所得各體系穩(wěn)定系數(shù)R的值。表4結(jié)果顯示酶解產(chǎn)物20％比例替代酪元酸鈉時(shí)，產(chǎn)物A和產(chǎn)物D在復(fù)雜體系均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性能。

3、粘度值實(shí)驗(yàn)

粘度值用數(shù)顯粘度計(jì)測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5酶解產(chǎn)物替代20％蛋白體系粘度值的比較

由表5結(jié)果可知，產(chǎn)物A、B、C、D替代體系的粘度值均較全營(yíng)養(yǎng)品體系低。粘度值是臨床營(yíng)養(yǎng)品乳劑評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，臨床營(yíng)養(yǎng)品乳劑因其特殊的功能需求，體系成分較為復(fù)雜，穩(wěn)定困難，穩(wěn)定劑的添加過多會(huì)使體系的粘度增加，流動(dòng)性變差，無法滿足臨床病人需要經(jīng)過鼻胃腸管或著造屢管提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。產(chǎn)物A、B、C、D替代降低了體系的粘度值，在不經(jīng)過膠體磨和高壓均質(zhì)的工藝條件情況下仍具有良好的穩(wěn)定性，可以替代全營(yíng)養(yǎng)品中的部分蛋白。

綜上所述，本發(fā)明所獲得水解產(chǎn)物A、B、C、D可以部分替代全營(yíng)養(yǎng)品中的酪元酸鈉，所得到的配方符合臨床乳劑產(chǎn)品的要求，同時(shí)能夠提供更為營(yíng)養(yǎng)豐富的氨基酸和多肽。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。