本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，特別涉及一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法及其應用。
背景技術：
：納米材料指粒子的三維空間尺寸至少有一維處于納米級(通常為0.1-100nm)的材料。磁性納米材料是一類重要的納米材料，具有以下特點：(1)材料尺寸小，可自由滲透血管；(2)能隨外磁場的變化產(chǎn)生相應的熱效應；(3)可根據(jù)使用目的功能化，增強其生物相容性及靶向性；(4)材料展現(xiàn)出量子尺寸效應、表面效應、宏觀量子隧道效應及良好的生物相容性等特殊的物理化學性質(zhì)，可作為磁性載體用于藥物傳輸?shù)?。近年來，磁性納米材料已廣泛應用于細胞磁性分離、靶向載藥、腫瘤熱磁療等，在疾病診療等領域具有廣闊的應用前景。DNA作為編碼、存儲和傳遞遺傳信息的生物大分子，控制著生物體的遺傳和性狀。由于其具有功能序列的可設計性和響應性等特點，可程序化組裝為二維或三維結構。目前，人們已將DNA作為一種組裝材料建立了DNA自組裝技術，進行微納米結構的組裝和分子器件的構建。DNA水凝膠是由DNA單體通過化學或物理方法交聯(lián)形成的多孔網(wǎng)狀結構。可通過設計DNA序列及序列長度精確控制DNA水凝膠的組裝過程，反應快速，且條件溫和，在生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。目前尚無磁性DNA超分子水凝膠的制備并將其用于藥物載體和ATP檢測體系構建的相關文獻報道。技術實現(xiàn)要素：為了克服上述不足，本發(fā)明提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，并將其應用于載藥體系和ATP檢測體系的構建。本發(fā)明的第一個方面，提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法。實驗原理如圖1所示，首先分別利用三條單鏈(Y1、Y2、Y3)構建Y型DNA單體(Y-DNA)、兩條單鏈(L1、L2)構建連接體DNA單體(L-DNA)；同時，利用氧化石墨烯與氨基磁珠間發(fā)生酰胺反應，制備磁性氧化石墨烯。利用Y-DNA和L-DNA粘性末端互補雜交自組裝形成DNA超分子水凝膠，基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將DNA水凝膠通過外部裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到磁性DNA超分子水凝膠。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種磁性DNA超分子水凝膠，包括：摻雜有磁性氧化石墨烯的DNA超分子水凝膠；其中，所述DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面。磁性氧化石墨烯具有較大的比表面積，可負載大量的DNA水凝膠。將其用于載藥體系，可實現(xiàn)較高的載藥效能；將其用于ATP的檢測，則顯著提高檢測靈敏度。另外，利用DNA水凝膠裸露在外的粘性末端與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用形成磁性DNA超分子水凝膠，和傳統(tǒng)的靜電吸附相比，具有較強的結合力和穩(wěn)定性，且克服了采用共價修飾方法合成時步驟繁瑣、成本較高的缺點。優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補雜交自組裝而成，其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2。更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明通過上述設計的DNA序列即可精確控制DNA水凝膠的自組裝過程，設計簡單，易于實際應用。本發(fā)明首先提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，將磁性氧化石墨烯、Y-DNA、L-DNA分散于緩沖溶液中，混合均勻，恒溫反應，即得。本發(fā)明的制備方法簡單，易于操作。本發(fā)明利用DNA水凝膠裸露在外的粘性末端與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用形成磁性DNA超分子水凝膠，反應快速，條件溫和，且具有較強的結合力和穩(wěn)定性。而一般納米粒子作為藥物載體時，多采用共價合成或靜電吸附的方法。其中，共價合成雖具有較好的穩(wěn)定性，但操作步驟復雜，反應條件苛刻；靜電吸附雖合成步驟簡單，但結合力和穩(wěn)定性較差。優(yōu)選的，所述恒溫反應的條件為35～37℃下，反應3～3.5h；優(yōu)選的，所述磁性氧化石墨烯的具體制備方法如下：配制氧化石墨烯分散液、活化，與氨基磁珠反應，即得；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補雜交自組裝而成；其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2；更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體的制備方法如下：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000～6500rpm離心10～15min制得終濃度為1～1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600～650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600～650μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(EDC)，35～37℃振蕩活化1～1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300～320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35～37℃振蕩反應12～14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用PBS緩沖液清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4～5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉鹽)；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?.磁性DNA超分子水凝膠的制備取等量上述制備的Y-DNA和L-DNA于微量離心管中，然后向混合體系中加入磁性氧化石墨烯溶液，最后加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯的終濃度分別為6～12μM、18～36μM、0.02～0.04μM。將混合體系于35～37℃反應3～4h制得磁性DNA超分子水凝膠。本發(fā)明的第二個方面，基于上述制備的磁性DNA超分子水凝膠，提供了一種將該磁性DNA超分子水凝膠作為藥物載體的技術應用。原理如圖2所示，基于Y-DNA與L-DNA的交聯(lián)作用自組裝形成DNA超分子水凝膠，結合磁性氧化石墨烯對單鏈DNA的吸附作用，通過DNA水凝膠裸露在外的粘性末端將DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面制備得到磁性DNA超分子水凝膠，即本專利的第一個方面中所制備的磁性DNA超分子水凝膠。進一步，利用抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)可嵌插到DNA雙鏈結構中的性質(zhì)，將抗腫瘤藥物DOX嵌合到磁性DNA超分子水凝膠的DNA雙鏈結構中，制備得到負載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠藥物載體。由于脫氧核糖核酸酶I(DeoxyribonucleaseI，簡稱DNaseI)在中性環(huán)境且有Mg2+存在時，可非特異性地水解雙鏈DNA，生成5′磷酸末端和3′羥基末端的寡核苷酸。因此，當向體系中加入DNaseI后，DNaseI將負載DOX的DNA超分子水凝膠水解為DNA片段，從而釋放出所負載的抗腫瘤藥物DOX，實現(xiàn)藥物釋放。該方法將抗腫瘤藥物與生物相容性和水溶性良好的DNA納米結構相結合，克服了藥物自身水溶性差、穩(wěn)定性差等缺點；同時該方法結合磁性氧化石墨烯在DNA載藥納米結構制備過程中易于分離和純化的優(yōu)點，為構建高度有序和精確控制的核酸藥物載體提供了良好的應用平臺，具有廣闊的發(fā)展前景。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種負載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠，包括：摻雜有磁性氧化石墨烯的DNA超分子水凝膠；負載在所述磁性DNA超分子水凝膠上的抗腫瘤藥物；其中，所述負載抗腫瘤藥物的DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面。利用DNA自組裝技術制備得到網(wǎng)狀DNA水凝膠，該結構中含有大量DNA堿基對。由于一些抗腫瘤藥物，如阿霉素(DOX)、表柔比星(E-ADM)、吡柔比星(THP)可嵌插到DNA雙鏈中，因此用DNA超分子水凝膠作為藥物載體可極大地增加載藥量。此外，利用DNaseI可非特異性水解雙鏈DNA的特性，從而達到藥物緩釋的目的。本發(fā)明網(wǎng)狀DNA水凝膠與一般的納米結構相比，載藥量高。優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA與磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：3×104～6×104；優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物為DOX、E-ADM、THP；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補雜交自組裝而成，其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2。更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明還提供了一種負載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，包括：將磁性氧化石墨烯、Y-DNA、L-DNA、抗腫瘤藥物分散于緩沖溶液中，混合均勻，恒溫反應，磁性分離，即得負載抗腫瘤藥物的磁性DNA超分子水凝膠。優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：3×104～6×104；優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物為DOX、E-ADM、THP；優(yōu)選的，所述恒溫反應的條件為35～37℃下，反應3～3.5h；優(yōu)選的，所述磁性氧化石墨烯的具體制備方法如下：配制氧化石墨烯分散液、活化，與氨基磁珠反應，即得；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補雜交自組裝而成；其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2；更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的負載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000～6500rpm離心10～15min制得終濃度為1～1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600～650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600～650μLEDC，35～37℃振蕩活化1～1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300～320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35～37℃振蕩反應12～14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4～5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠的制備向DOX溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物DOX的終濃度分別為6～12μM、18～36μM、0.02～0.04μM、600～1200μM?；旌象w系于35～37℃反應7～8.5h，磁性分離，除去過量的DOX，制得負載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負載DOX的磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液中，4～5℃保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的第三個方面，基于磁性DNA超分子水凝膠的制備，提供了一種包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，實現(xiàn)對三磷酸腺苷(ATP)的高靈敏度、高選擇性檢測的應用體系。原理如圖5所示，將L-DNA中L1的部分序列設計為ATP適體，并以此改變其他DNA序列，制備得到兩種DNA單體(Y-DNA'和L-DNA')。利用Y-DNA'和L-DNA'的交聯(lián)作用形成DNA水凝膠，同時將HRP包覆于DNA水凝膠中。進一步基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將包覆HRP的DNA水凝膠通過裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。基于核酸適體與目標物的特異性識別作用，當有ATP存在時，ATP與其適體鏈特異性結合生成ATP-適體復合物，從而破壞DNA水凝膠結構，釋放出所包覆的HRP。磁性分離，向上清液中加入反應底物TMB/H2O2，反應完成后采用紫外-可見分光光度計檢測，從而實現(xiàn)對ATP的高靈敏、高特異性定量分析。此外，采用本方法制備包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠，通過改變不同的適體序列可實現(xiàn)對其它目標物質(zhì)的檢測，具有廣泛適用性。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下方案：一種包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，包括：摻雜有磁性氧化石墨烯的DNA超分子水凝膠；包覆在所述DNA超分子水凝膠中的辣根過氧化物酶(HRP)；其中，構成所述DNA超分子水凝膠的L-DNA'單體中，與Y-DNA連接的單鏈DNA含有ATP適體序列；所述包覆HRP的DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面。磁性氧化石墨烯具有較大的比表面積，可負載大量的DNA水凝膠。將其用于ATP的檢測，可顯著提高檢測靈敏度。優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA'和L-DNA'的粘性末端互補雜交自組裝而成，其中，Y-DNA'為三條DNA單鏈(Y1'、Y2'、Y3')構建的Y-DNA'單體；L-DNA'為兩條DNA單鏈(L1'、L2')構建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過氧化物酶(HRP)的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：1250～2500。更優(yōu)選的，所述Y-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：Y1'：5'-TTGGACCCTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2'：5'-TTGGACCCCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3'：5'-TTGGACCCAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：L1'：5'-GGGTCCAAGTGAAGAGTCTATTGAAGAATTCCAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'；L2'：5'-GGAATTCTTCAATAGACTCTTCAC-3'。本發(fā)明還提供了一種包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，包括：將辣根過氧化物酶(HRP)、磁性氧化石墨烯、形成DNA超分子水凝膠的Y-DNA'、L-DNA'分散于緩沖溶液中，混合均勻，恒溫反應，即得。優(yōu)選的，所述Y-DNA'、L-DNA'、與磁性氧化石墨烯、辣根過氧化物酶(HRP)的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：1250～2500；優(yōu)選的，所述恒溫反應的條件為35～37℃，反應3～3.5h；優(yōu)選的，所述磁性氧化石墨烯的具體制備方法如下：配制氧化石墨烯分散液、活化，與氨基磁珠反應，即得；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA'和L-DNA'的粘性末端互補雜交自組裝而成，其中，Y-DNA'為Y型DNA單體；L-DNA'為兩條單鏈(L1'、L2')構建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA'、L-DNA'和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2。更優(yōu)選的，所述Y-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：Y1'：5'-TTGGACCCTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2'：5'-TTGGACCCCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3'：5'-TTGGACCCAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：L1'：5'-GGGTCCAAGTGAAGAGTCTATTGAAGAATTCCAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'；L2'：5'-GGAATTCTTCAATAGACTCTTCAC-3'。本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體包括如下步驟：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000～6500rpm離心10～15min制得終濃度為1～1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600～650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600～650μLEDC，35～37℃振蕩活化1～1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300～320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35～37℃振蕩反應12～14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4～5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA'和L-DNA'的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1'、Y2'、Y3'(濃度比Y1'：Y2'：Y3'＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1'、L2'(濃度比L1'：L2'＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA'和L-DNA'，備用。3.包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠的制備向HRP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過氧化物酶的終濃度分別為6～12μM、18～36μM、0.02～0.04μM、25～50μM。混合體系于35～37℃反應3～3.2h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法。利用Y-DNA和L-DNA粘性末端互補雜交自組裝形成DNA超分子水凝膠，基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將DNA水凝膠通過外部裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到磁性DNA超分子水凝膠。(2)本發(fā)明提供了一種將該磁性DNA超分子水凝膠作為藥物載體的技術應用。該方法將抗腫瘤藥物與生物相容性和水溶性良好的DNA納米結構相結合，克服了藥物自身水溶性差、穩(wěn)定性差等缺點；同時該方法結合磁性氧化石墨烯在DNA載藥納米結構制備過程中易于分離和純化的優(yōu)點，為構建高度有序和精確控制的核酸藥物載體提供了良好的應用平臺，具有廣闊的發(fā)展前景。(3)本發(fā)明提供了一種包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，實現(xiàn)對三磷酸腺苷(ATP)的高靈敏度、高選擇性檢測的應用體系。采用本方法制備包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠，通過改變適體序列可實現(xiàn)對其它目標物的檢測，具有廣泛適用性。(4)本發(fā)明制備方法簡單、檢測效率高、實用性強，易于推廣。附圖說明圖1磁性DNA超分子水凝膠制備原理圖。圖2磁性DNA水凝膠用于藥物載體原理圖。圖3向負載DOX磁性DNA超分子水凝膠中加入不同濃度DNaseI，反應完成后，磁性分離得到上清液溶液照片。DNaseI濃度(從左向右)：0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL。圖4向負載DOX磁性DNA超分子水凝膠中加入不同濃度DNaseI，反應完成后，磁性分離得到上清液溶液紫外-可見光譜圖。DNaseI濃度(從下向上，以波峰處計)：0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL。圖5包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠用于ATP檢測原理圖。圖6向包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中加入不同濃度ATP，與TMB/H2O2反應完成后，溶液顏色照片。ATP濃度(從左向右)：0，2μM，4μM，6μM，8μM，10μM。圖7向包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中加入不同濃度ATP，與TMB/H2O2反應完成后，溶液體系的紫外-可見光譜圖。ATP濃度(從下向上，以波峰處計)：0，2μM，4μM，6μM，8μM，10μM。圖8向包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中加入PBS緩沖液(即空白)、ATP類似物、以及ATP(濃度均為8μM)，與TMB/H2O2反應完成后，溶液體系在450nm處的紫外-可見吸光度的比較。具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明特征及其它相關特征作進一步詳細說明，以便于同行業(yè)技術人員的理解：實施例1一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法。實驗原理如圖1所示，首先分別利用三條單鏈(Y1、Y2、Y3)構建Y型DNA單體(Y-DNA)、兩條單鏈(L1、L2)構建連接體DNA單體(L-DNA)；同時，利用氧化石墨烯與氨基磁珠間發(fā)生酰胺反應，制備磁性氧化石墨烯。利用Y-DNA和L-DNA粘性末端互補雜交自組裝形成DNA超分子水凝膠，基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將DNA水凝膠通過外部裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到磁性DNA超分子水凝膠。具體的制備方法如下：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000rpm離心10min制得終濃度為1mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600μLEDC，37℃振蕩活化1h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)(注意：氨基磁珠使用前用咪唑-鹽酸緩沖液(1M，pH6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用)清洗干凈)，37℃振蕩反應12h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.磁性DNA超分子水凝膠的制備取等量上述制備的Y-DNA和L-DNA于微量離心管中，然后向混合體系中加入磁性氧化石墨烯溶液，最后加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯的終濃度分別為6μM、18μM、0.02μM。將混合體系于37℃反應3h制得磁性DNA超分子水凝膠。實施例2一種將該磁性DNA超分子水凝膠作為藥物載體的技術應用。原理如圖2所示，基于Y-DNA與L-DNA的交聯(lián)作用自組裝形成DNA超分子水凝膠，結合磁性氧化石墨烯對單鏈DNA的吸附作用，通過DNA水凝膠裸露在外的粘性末端將DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面制備得到磁性DNA超分子水凝膠，此為本專利第一個方面中所制備的磁性DNA超分子水凝膠。進一步，利用抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)可嵌插到DNA雙鏈結構中的性質(zhì)，將抗腫瘤藥物DOX嵌合到磁性DNA超分子水凝膠的DNA雙鏈結構中，制備得到負載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠藥物載體。由于脫氧核糖核酸酶I(DeoxyribonucleaseI，簡稱DNaseI)在中性環(huán)境且有Mg2+存在時，可非特異性地水解雙鏈DNA，生成5′磷酸末端和3′羥基末端的寡核苷酸。因此，當向體系中加入DNaseI后，DNaseI將負載DOX的DNA超分子水凝膠水解為DNA片段，從而釋放出所負載的抗腫瘤藥物DOX，實現(xiàn)藥物釋放。該方法將抗腫瘤藥物與生物相容性和水溶性良好的DNA納米結構相結合，克服了藥物自身水溶性差、穩(wěn)定性差等缺點；同時該方法結合磁性氧化石墨烯在DNA載藥納米結構制備過程中易于分離和純化的優(yōu)點，為構建高度有序和精確控制的核酸藥物載體提供了良好的應用平臺，具有廣闊的發(fā)展前景。具體的制備方法如下:表1-1所用寡核苷酸鏈序列名稱序列(5'-3')Y1CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATGY2CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCTY3CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCAL1AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGGL2AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000rpm離心10min制得終濃度為1mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600μLEDC，37℃振蕩活化1h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)(注意：氨基磁珠使用前用咪唑-鹽酸緩沖液(1M，pH6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用)清洗干凈)，37℃振蕩反應12h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負載抗腫瘤藥物DOX磁性DNA超分子水凝膠的制備向DOX溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物DOX的終濃度分別為6μM、18μM、0.02μM、600μM?；旌象w系37℃反應7h，磁性分離，除去過量的DOX，制得負載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負載DOX磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?.釋藥量的檢測分別取500μL上述制備的負載DOX磁性DNA超分子水凝膠于8個離心管中，向其中分別加入50μL濃度分別為0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL的DNaseI，其中DNaseI分散于1×消化緩沖液(10mMTris溶液、0.5mMCa2+、2.5mMMg2+，pH7.4)中。加入杜氏磷酸緩沖液補充終體積至1mL，將該反應體系于37℃反應1h。反應完成后，磁性分離，取等量上清液，加入杜氏磷酸緩沖液補充終體積至2mL，于紫外-可見分光光度計檢測。5.實驗結果與討論將不同濃度DNaseI溶液(濃度依次為0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL)加入到負載DOX磁性DNA超分子水凝膠中，于37℃反應1h。反應結束后，磁性分離，取上層清液，加入杜氏磷酸緩沖液補充終體積至2mL后，觀察溶液顏色。如圖3所示，上清液呈桔紅色(即為DOX顏色)，且顏色隨著加入DNaseI濃度的增加逐漸加深，表明加入DNaseI后，DNA水凝膠雙鏈結構被DNaseI水解為寡核苷酸片段，嵌插在DNA雙鏈中的DOX被釋放出來，且所釋放的DOX的濃度隨加入DNaseI量的增加而增大。進一步，利用紫外-可見分光光度計對所得上清液進行紫外-可見吸收檢測。如圖4所示，隨著加入DNaseI濃度的增大，其對應的上清液在480nm處的紫外-可見吸光度依次升高，進一步說明釋放出來的DOX濃度與加入的DNaseI的量呈正相關，從而證實了將磁性DNA超分子水凝膠用于藥物載體的可行性。實施例3一種包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，實現(xiàn)對三磷酸腺苷(ATP)的高靈敏度、高選擇性檢測的應用體系。原理如圖5所示，將L-DNA中L1的部分序列設計為ATP適體，并以此改變其他DNA序列，制備得到兩種DNA單體(Y-DNA'和L-DNA')。利用Y-DNA'和L-DNA'的交聯(lián)作用形成DNA水凝膠，同時將HRP包覆于DNA水凝膠中。進一步基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將包覆HRP的DNA水凝膠通過裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面制備得到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠?；诤怂徇m體與目標物的特異性識別作用，當有ATP存在時，ATP與其適體鏈特異性結合生成ATP-適體復合物，破壞DNA水凝膠結構，從而釋放HRP。磁性分離，向上清液中加入反應底物TMB/H2O2，反應完成后采用紫外-可見分光光度計檢測，從而實現(xiàn)對ATP的高靈敏、高特異性定量分析。此外，采用本方法制備包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠，通過改變不同的適體序列可實現(xiàn)對其它目標物的檢測，具有廣泛適用性。具體的制備方法如下:表1-2所用寡核苷酸及適體鏈序列1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000rpm離心10min制得終濃度為1mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600μLEDC，37℃條件下振蕩活化1h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300μL用咪唑-鹽酸緩沖液(1M，pH6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用)清洗后的氨基磁珠(粒徑約為100nm)，37℃振蕩反應12h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA'和L-DNA'的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1'、Y2'、Y3'(濃度比Y1'：Y2'：Y3'＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1'、L2'(濃度比L1'：L2'＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA'和L-DNA'，備用。3.包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠的制備向HRP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過氧化物酶的終濃度分別為6μM、18μM、0.02μM、25μM?；旌象w系于37℃反應3h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。4.ATP檢測分別取100μL不同濃度三磷酸腺苷(ATP)標準液，加入到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠體系中，25℃反應1h。反應結束后，磁性分離，分別移取50μL上清液，向其中加入10μL0.5％TMB溶液、20μL30％H2O2溶液、920μL緩沖液(26.6mM檸檬酸，51.4mMNa2HPO4，15mMKCl,pH5.0)，反應15min后，分別加入500μL2MH2SO4終止反應，然后加入500μL緩沖液(pH5.0)補充終體積至2mL，利用紫外可見分光光度計進行紫外-可見吸收檢測。5.特異性檢測分別將100μLPBS緩沖液、ATP類似物(三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鳥苷(GTP)，濃度均為8μM)、目標物ATP(濃度為8μM)加入到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠體系中，25℃反應1h后，磁性分離，分別移取50μL上清液，向其中加入10μL0.5％TMB溶液、20μL30％H2O2溶液、920μL緩沖液(26.6mM檸檬酸，51.4mMNa2HPO4，15mMKCl,pH5.0)，反應15min后，分別加入500μL2MH2SO4終止反應，然后加入500μL緩沖液(pH5.0)補充終體積至2mL，利用紫外可見分光光度計進行紫外-可見吸收檢測。6.實驗結果與討論向HRP溶液中加入一定量Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、PBS緩沖液(pH7.0)，使混合體系于37℃反應3h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。將不同濃度ATP標準溶液(濃度依次為0，2μM，4μM，6μM，8μM，10μM)加入到包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中，于25℃反應1h后，磁性分離，取上清液。向上清液中加入TMB溶液和H2O2溶液，反應15min后，加入硫酸終止反應，加入緩沖液(pH5.0)補充終體積至2mL，觀察溶液體系顏色。如圖6所示，溶液呈黃色，且顏色隨著加入ATP濃度的增大逐漸加深，表明加入ATP后，包覆在DNA水凝膠中的HRP被釋放出來，且所釋放的HRP濃度隨加入ATP濃度的增大而增大。利用紫外-可見分光光度計進行紫外-可見吸收檢測，結果如圖7所示，隨著加入ATP濃度的增大，上清液在450nm處的紫外-可見吸光度依次升高，進一步說明釋放出的HRP濃度與加入的ATP濃度呈正相關，從而實現(xiàn)對ATP的高靈敏定量檢測。為驗證本體系對ATP檢測的特異性，向所制備的包覆HRP的磁性DNA水凝膠中分別加入等體積PBS緩沖液(即空白)、ATP類似物(UTP、CTP、GTP，濃度均為8μM)、目標物ATP(濃度為8μM)，利用紫外-可見分光光度計進行紫外-可見吸收檢測。結果如圖8所示，體系中加入ATP類似物(UTP、CTP、GTP)反應后溶液在450nm處的紫外-可見吸光度與空白樣品相比，沒有明顯變化；當加入目標物ATP后，反應后溶液在450nm處的紫外-可見吸光度明顯增大，表明該方法具有良好的特異性。實施例4一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體的制備方法如下：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.磁性DNA超分子水凝膠的制備取等量上述制備的Y-DNA和L-DNA于微量離心管中，然后向混合體系中加入磁性氧化石墨烯溶液，最后加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM。將混合體系于36℃反應4h制得磁性DNA超分子水凝膠。實施例5一種較優(yōu)的負載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負載抗腫瘤藥物E-ADM磁性DNA超分子水凝膠的制備向E-ADM溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物E-ADM的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM、1200μM?；旌象w系37℃反應6h，磁性分離，除去過量的抗腫瘤藥物，制得負載抗腫瘤藥物的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負載E-ADM磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液，5℃保存?zhèn)溆谩嵤├?一種較優(yōu)的負載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負載抗腫瘤藥物THP磁性DNA超分子水凝膠的制備向THP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物THP的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM、1200μM?；旌象w系37℃反應6h，磁性分離，除去過量的抗腫瘤藥物，制得負載抗腫瘤藥物的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負載THP磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液，5℃保存?zhèn)溆?。實施?一種包覆辣根過氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體包括如下步驟：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA'和L-DNA'的制備實驗中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1'、Y2'、Y3'(濃度比Y1'：Y2'：Y3'＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1'、L2'(濃度比L1'：L2'＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結構穩(wěn)定的Y-DNA'和L-DNA'，備用。3.包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠的制備向HRP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過氧化物酶的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM、50μM?；旌象w系于36℃反應3.2h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。最后應該說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述雖然結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。當前第1頁1 2 3