本發(fā)明涉及煙用添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種發(fā)酵山楂香料的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

再造煙葉，主要由煙末、碎片、煙梗或低次煙葉加入膠粘劑和其他添加劑等組成。再造煙葉存在雜氣重、刺激性大和口感不適等吸味缺陷，影響了再造煙葉在卷煙產(chǎn)品中的使用效果和添加量。國(guó)內(nèi)通常的做法是采用添加劑的辦法來進(jìn)行改善，目前應(yīng)用較多的添加劑是煙草、天然植物類提取物，這些提取物一般通過水、醇提取或分子蒸餾得到，添加后對(duì)卷煙質(zhì)量的改善程度有限，仍有刺激性大、雜氣多等缺陷。為了使再造煙葉外觀、評(píng)吸品質(zhì)更接近于優(yōu)質(zhì)煙葉，通常還需要對(duì)再造煙葉進(jìn)行加香處理，而現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的再造煙葉及其裹衣還存在燃燒過程中產(chǎn)生較多木質(zhì)氣、刺辣感而影響卷煙煙氣清純氣味等問題。

山楂(Crataegus pinnatifida Bunge)，又名山里果、山里紅，薔薇科山楂屬，核果類水果，核質(zhì)硬，果肉薄，味微酸澀。到目前為止，從山楂(果肉、核及葉)中發(fā)現(xiàn)且分離得到的物質(zhì)有150多種，其中主要有黃酮類、低聚黃烷類、有機(jī)酸類，另外還含有三萜類、甾體類和有機(jī)胺類等，其中含有的阿魏酸是香蘭素的微生物轉(zhuǎn)化前體物質(zhì)。山楂中的天然色素為矢菊色素-3-半乳糖苷、矢車菊色素的雙糖或三糖苷(含量為19.6％)等花色苷類化合物。山楂的藥理作用有：助消化、降壓、降血脂、抗氧化、強(qiáng)心、抑制血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抑制畸變、防癌、保護(hù)視網(wǎng)膜等作用。由于山揸含酸量高，并富臺(tái)果膠、丹寧，果肉質(zhì)地緊密，果核堅(jiān)硬且所占比例較大，給山楂的深加工帶來較大困難。許多年來，山揸加工一直局限在干制品、糖制品、飲料制品及罐裝制品方面，如山揸糖葫蘆、山楂片、山揸糕、果丹皮、山楂醬、山揸蜜餞、山楂汁以及山楂罐頭等產(chǎn)品較為多見，而難以形成大規(guī)模、工業(yè)化、多檔次、多品種的生產(chǎn)，阻礙了山揸這一我國(guó)特有寶貴水果資源的加工轉(zhuǎn)化及全方位利用。另外，對(duì)山揸黃酮類成分的提取及研究亦在日益深化。除此以外，山楂還含有豐富的紅色素。為了充分開發(fā)利用天然資源，從山楂中提取天然食用色素等生物活性成分，為我國(guó)山揸果的深層次加工、提高附加值開辟了新的途徑，提高山楂產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

而在卷煙產(chǎn)品中，過量的纖維素、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會(huì)賦予煙氣尖刺和灼熱感并產(chǎn)生嗆咳。纖維素可被生物酶定向水解生成葡萄糖、低聚糖等，能有效降低卷煙的刺激性，減輕雜氣和改善吸味，但是糖過多也會(huì)使煙氣焦油量增大。而微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，以山楂為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。

現(xiàn)有技術(shù)中，以山楂提取液為底物，以產(chǎn)香菌食甲醇芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1發(fā)酵，制備發(fā)酵山楂香料及其在再造煙葉和裹衣中應(yīng)用，改善再造煙葉的口感吸味，并使外觀接近優(yōu)質(zhì)煙葉，尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種發(fā)酵山楂香料的制備方法，并在再造煙葉和裹衣進(jìn)行應(yīng)用，可提高再造煙葉香氣質(zhì)、降低刺激、減少雜氣，并能使再造煙葉和裹衣更接近于優(yōu)質(zhì)煙葉的外觀色澤。

本發(fā)明提供一種發(fā)酵山楂香料的制備方法，其利用產(chǎn)香菌食甲醇芽孢桿菌VJ4-1發(fā)酵山楂香料，包括以下步驟：

1)將山楂粉與水按質(zhì)量比1:10～40混合、60～75℃提取3～5小時(shí)，抽濾，將濾渣重復(fù)提取2～3次，合并濾液，滅菌；

2)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌VJ4-1活化培養(yǎng)，得到食甲醇芽孢桿菌活化液；菌株活化條件為：25～35℃、pH4～7條件下，100～150r/min震蕩培養(yǎng)24～72小時(shí)，所述的產(chǎn)香菌食甲醇芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)VJ4-1保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2012004，保藏日期：2012年1月11日；

3)發(fā)酵：將步驟2)中所得的活化菌液按體積比5～20％接種到上述步驟1)中的山楂合并濾液中形成發(fā)酵液，上述發(fā)酵液的裝罐量為20～40％，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)條件同活化培養(yǎng)條件；培養(yǎng)時(shí)間為1～7天；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液減壓濃縮至相對(duì)密度1.2～1.3，與95％乙醇按質(zhì)量比1：3～4沉淀過夜后抽濾，將濾液減壓蒸餾除去溶劑，制得深紅褐色浸膏為發(fā)酵山楂香料。

進(jìn)一步的，所述步驟4)中減壓減壓蒸餾的溫度為55～65℃。

本發(fā)明還提供一種上述方法制備的發(fā)酵山楂香料在再造煙葉中的應(yīng)用，所述發(fā)酵山楂香料加入再造煙葉中的質(zhì)量比是0.05～0.3％。

本發(fā)明還提供一種上述方法制備的發(fā)酵山楂香料在再造煙葉裹衣中的應(yīng)用，所述發(fā)酵山楂香料加入再造煙葉裹衣中的質(zhì)量比是0.05～0.1％。

采用GC/MS對(duì)本發(fā)明制備的產(chǎn)香菌發(fā)酵山楂香料與未發(fā)酵山楂香料(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照)進(jìn)行揮發(fā)性致香成分GC/MS對(duì)比分析。

(1)同時(shí)蒸餾萃取

將5g發(fā)酵山楂香料或?qū)φ昭b入圓底燒瓶中，加入400mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計(jì)時(shí)萃取2h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至1mL，濃縮液用于進(jìn)行GC/MS分析。

(2)GC/MS分析：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛細(xì)管柱；進(jìn)樣溫度：250℃；分流比20:1；載氣：He，1mL/min；升溫程序：從50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI源；電子能量：70eV；掃描范圍：50～550amu；使用WILEY和MINILAB譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

(3)揮發(fā)性成分對(duì)比分析

通過GC/MS對(duì)本發(fā)明的產(chǎn)香菌發(fā)酵山楂香料及其對(duì)照進(jìn)行香氣成分分析，從表1中可以看出，(1)發(fā)酵山楂香料一共鑒定出58種揮發(fā)性香氣成分，未發(fā)酵山楂對(duì)照浸膏樣品鑒定出34種揮發(fā)性成分；(2)發(fā)酵山楂香料新增35種揮發(fā)性香氣成分，主要包括己酸、β-月桂烯、乙酸己酯、丁酸己酯、松油醇、香蘭醇、香蘭素、二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯乙醇及其他醇類、烯類、呋喃類、酮類等，其中己酸為低級(jí)脂肪酸、揮發(fā)性有機(jī)酸，對(duì)卷煙的煙氣有利，使煙氣醇和；β-月桂烯具有令人愉快的、清淡的香脂氣味；乙酸己酯具有果香氣；丁酸己酯呈青香、果香、酯香、蔬菜香及強(qiáng)烈的混合水果香氣和菠蘿香昧；松油醇似松針香氣，在煙氣中增加青香，在卷煙香味中起重要作用；香蘭醇具有甜香、奶油、酚香、香莢蘭及椰子香氣，香蘭素具有濃烈奶香氣，通過高溫能揮發(fā)到煙氣中，增加卷煙煙氣的香莢蘭香氣，協(xié)調(diào)煙香，增加煙氣中的吡喃、吡啶類致香物質(zhì)，提高卷煙煙氣的香味成分，有效改善卷煙的感官質(zhì)量，可能是山楂中的阿魏酸經(jīng)微生物酶體系催化轉(zhuǎn)化而來；二氫獼猴桃內(nèi)酯，帶有香豆素樣香氣，并有麝香樣氣息；苯乙醇，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣；(3)發(fā)酵山楂香料中，己醛、糠醛、葵醛、棕櫚酸乙酯等成分的含量有不同程度的提高。其中己醛呈生的油脂和青草氣及蘋果香味；糠醛具有杏仁香帶焦香；棕櫚酸乙酯是高級(jí)飽和脂肪酸，呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣，在卷煙煙氣中具有柔和香氣的作用；(4)發(fā)酵后，山楂中的一些成分消失或含量降低，如3-甲基-2-丁烯-1-醇、2,3-戊二酮、乙酸氯甲酯、乙縮醛、十三酸、鄰苯二甲酸異丁酯、亞油酸、亞油酸乙酯、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯等，其中亞油酸、亞油酸乙酯屬于不飽和酸、不飽和酸酯，鄰苯二甲酸異丁酯、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯屬于有害刺激性成分，在熱裂解過程中容易形成強(qiáng)烈刺激性和雜氣物質(zhì)，增加煙氣對(duì)喉部的刺激性和粗糙感，對(duì)卷煙吸味有不利的影響，它們的含量經(jīng)發(fā)酵后顯著降低或消失，可能是因?yàn)榻?jīng)過微生物酶體系作用而分解、降解、轉(zhuǎn)化，可能有利于卷煙品質(zhì)的提高?？傊?，從揮發(fā)、半揮發(fā)性成分的變化看，經(jīng)食甲醇芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1轉(zhuǎn)化發(fā)酵的山楂香料在卷煙中的加香效果可能比未發(fā)酵的山楂浸膏好。

表1.產(chǎn)香菌發(fā)酵山楂香料與其未發(fā)酵對(duì)照的揮發(fā)性成分GC/MS對(duì)比分析

表1中符號(hào)“/”表示未檢出；內(nèi)標(biāo)為丙酸苯乙酯。

經(jīng)過再造煙葉及裹衣加香評(píng)吸試驗(yàn)表明，所有這些香氣糅合在一起賦予發(fā)酵山楂香料與煙氣協(xié)調(diào)、酸甜奶香氣，增加了煙氣柔和感、降低刺激、減少雜氣、改善吸味，并使再造煙葉及裹衣顏色更自然均勻，接近優(yōu)質(zhì)煙葉。

微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，以為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明制備的產(chǎn)香蘭素菌株食甲醇芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)VJ4-1發(fā)酵山楂香料，可用于再造煙葉及裹衣的加香。用于再造煙葉時(shí)，能協(xié)調(diào)煙氣，使香氣質(zhì)提升，香氣更豐富且?guī)в忻黠@的酸甜奶香氣，同時(shí)還具有降低刺激，減少雜氣的作用；用于卷煙紙時(shí)，能提升卷煙紙的品質(zhì)，使其呈現(xiàn)天然本位的優(yōu)質(zhì)煙絲黃色且色調(diào)自然均勻，能很好地掩蓋卷煙紙燃燒所產(chǎn)生的木質(zhì)氣、刺辣感。

2)采用本發(fā)明制備的發(fā)酵山楂香料，增香成分含量高，產(chǎn)品收率高，生產(chǎn)周期短，工藝條件溫和，且所用的原料具有天然環(huán)保無害等優(yōu)點(diǎn)，具與生產(chǎn)香蘭素單一香料相比步驟簡(jiǎn)便可降低純化成本，香氣復(fù)合天然，有較大的工業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。

具體實(shí)施方式

下面列舉一部分實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)技術(shù)問題作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，有必要在此指出以下具體實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種發(fā)酵山楂香料的制備方法，包括如下步驟：

1)將山楂粉與水按質(zhì)量比1:20混合、60℃提取3小時(shí)，抽濾，將濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，滅菌；

2)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌VJ4-1活化培養(yǎng)，得到食甲醇芽孢桿菌活化液；菌株活化條件為：25℃、pH4.5條件下，100r/min震蕩培養(yǎng)24小時(shí)；

3)發(fā)酵：將步驟2)中所得的活化菌液按體積比5％接種到上述步驟1)中的山楂合并濾液中形成發(fā)酵液，上述發(fā)酵液的裝罐量為20％，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)條件同活化培養(yǎng)條件；培養(yǎng)時(shí)間為2天；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液減壓濃縮至相對(duì)密度1.2～1.3，與95％乙醇按質(zhì)量比1：3～4沉淀過夜后抽濾，將濾液減壓蒸餾除去溶劑，制得深紅褐色浸膏為發(fā)酵山楂香料，相對(duì)密度為1.0144。

該發(fā)酵山楂香料加入再造煙葉中的質(zhì)量比是0.05％，能柔和煙氣、豐富香氣、減少刺激和雜氣，使再造煙葉更有光澤、更貼近自然煙葉黃色。

該發(fā)酵山楂香料加入裹衣中的質(zhì)量比是0.05％，能提升香氣質(zhì)、增加酸甜奶香氣、降低刺激、余味干凈，使裹衣顯現(xiàn)接近煙葉的黃棕色。

實(shí)施例2

一種發(fā)酵山楂香料的制備方法，包括如下步驟：

1)將山楂粉與水按質(zhì)量比1:15混合、65℃提取4小時(shí)，抽濾，將濾渣重復(fù)提取3次，合并濾液，滅菌；

2)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌VJ4-1活化培養(yǎng)，得到食甲醇芽孢桿菌活化液；菌株活化條件為：30℃、pH5條件下，110r/min震蕩培養(yǎng)48小時(shí)；

3)發(fā)酵：將步驟2)中所得的活化菌液按體積比10％接種到上述步驟1)中的山楂合并濾液中形成發(fā)酵液，上述發(fā)酵液的裝罐量為30％，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)條件同活化培養(yǎng)條件；培養(yǎng)時(shí)間為3天；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液減壓濃縮至相對(duì)密度1.2～1.3，與95％乙醇按質(zhì)量比1：3～4沉淀過夜后抽濾，將濾液減壓蒸餾除去溶劑，制得深紅褐色浸膏為發(fā)酵山楂香料，相對(duì)密度為1.0201。

該發(fā)酵山楂香料在再造煙葉中的質(zhì)量比是0.1％，和煙氣協(xié)調(diào)、增加酸甜奶香、降低刺激，顏色更自然、有光澤。

實(shí)施例3

一種發(fā)酵山楂香料的制備方法，包括如下步驟：

1)將山楂粉與水按質(zhì)量比1:40混合、70℃提取5小時(shí)，抽濾，將濾渣重復(fù)提取3次，合并濾液，滅菌；

2)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌VJ4-1活化培養(yǎng)，得到食甲醇芽孢桿菌活化液；菌株活化條件為：35℃、pH6條件下，130r/min震蕩培養(yǎng)72小時(shí)；

3)發(fā)酵：將步驟2)中所得的活化菌液按體積比20％接種到上述步驟1)中的山楂合并濾液中形成發(fā)酵液，上述發(fā)酵液的裝罐量為40％，接種后的發(fā)酵培養(yǎng)條件同活化培養(yǎng)條件；培養(yǎng)時(shí)間為5天；

4)將步驟3)中所得的發(fā)酵液減壓濃縮至相對(duì)密度1.2～1.3，與95％乙醇按質(zhì)量比1：3～4沉淀過夜后抽濾，將濾液減壓蒸餾除去溶劑，制得深紅褐色浸膏為發(fā)酵山楂香料，相對(duì)密度為1.1417。

該發(fā)酵山楂香料加入再造煙葉中的質(zhì)量比是0.3％，能與煙氣較協(xié)調(diào)，增加香氣、減少雜氣、改善口感。

實(shí)施例4評(píng)吸實(shí)驗(yàn)

將制備的發(fā)酵山楂香料分別按與再造煙葉的質(zhì)量比為0.3％、0.1％、0.05％的比例，未發(fā)酵山楂提取物浸膏(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照)按與再造煙葉的質(zhì)量比為0.05％的比例，分別添加到再造煙葉中，依次記為1#、2#、3#、對(duì)照樣品，進(jìn)行評(píng)吸，評(píng)吸按照國(guó)標(biāo)GB 5606.4-1996進(jìn)行。

表2.發(fā)酵山楂香料在再造煙葉中的應(yīng)用

根據(jù)上表2所示，本發(fā)明發(fā)酵山楂香料，加入再造煙葉中進(jìn)行加香比例為0.05％～0.3％時(shí)，與煙氣協(xié)調(diào)性好，有特征酸甜奶香，香氣豐富，煙氣柔和、細(xì)膩，刺激降低，雜氣減少、吸味改善，并能改善再造煙葉及裹衣，使其外觀顏色自然均勻，接近于優(yōu)質(zhì)煙葉。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。