一種多肽提取與分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種多肽提取與分離方法。本發(fā)明以大尺寸的二氧化硅（亞毫米級）共價負載聚乙撐亞胺作為吸附劑(SiO2@PEI)，在不同的pH環(huán)境下能提取等電點不同的多肽，而降低pH則多肽可被高效釋放。這是由于該吸附劑易質(zhì)子化而呈陽離子性，而多肽隨pH降低可由帶負電變成帶正電，因此與吸附劑間由靜電互補吸附變成靜電互斥而釋放。吸附劑與多肽間的絡合常數(shù)一般都高于1012M-1,因此即使含量在亞飛摩爾級的痕量多肽也可被提取。同時，對絕大多數(shù)多肽，釋放率達到79-92%。該吸附劑至少能提取相對豐度僅為0.1%的多肽。該吸附劑制備簡單，能反復使用。
【專利說明】一種多肽提取與分罔方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種分離技術和生物分析與檢測領域，具體涉及一類能高效提取水中 某些多肽，又能高效脫附的多肽提取與分離方法。

【背景技術】
[0002] 多肽的提取與分離是當今的一項重要技術。比如某些多肽有特定的生理功能，但 在原料中含量很低，這時就需要進行提取濃縮。再比如在蛋白、核酸分析中，基質(zhì)輔助激光 解析離子化飛行譜（MALDI-T0F)是一種極為靈敏的質(zhì)量檢測技術，適合大分子質(zhì)量的檢 測，靈敏度非常高，特別適合多肽、蛋白等檢測，但是在體系中豐度較低的多肽卻很難被檢 測到。這種情況下就可采用提取洗脫技術進行檢測。這對于構(gòu)建蛋白和核酸序列是十分必 要的。科學界針對多肽的分離和檢測已開發(fā)了多種技術，例如雙向電泳，各種色譜技術等。 這些技術針對微量操作效果是理想的，在檢測上也有重要意義，主要是確定化學物種的存 在，但一般不能直接提供分子量等信息。其它技術如等電點沉降對痕量物種效果不理想。近 年來，提取特定多肽的技術有重大突破。例如以結(jié)構(gòu)明確的磁性納米顆粒吸附特定多肽，再 進行洗脫濃縮和分析。這些技術對于磷蛋白、糖蛋白等翻譯后改性蛋白的分析是非常有用 的。但這些材料的合成要求很高，一般針對特定多肽有效?？傮w而言，還缺乏一種通用而高 效的多肽提取劑。
[0003] 另一方面，多肽的脫附是一個重要的技術挑戰(zhàn)。一般而言，多肽分子量較大，與吸 附劑間作用點多，與吸附劑的作用很強。正如有文獻指出的那樣，締合常數(shù)與作用點成指數(shù) 增長關系。而多肽不同于小分子，作用點很多，故強吸附通常容易發(fā)生，但解吸很難。因此 在多肽的提取分離中，難解吸是重要技術挑戰(zhàn)之一。應該注意到，多肽盡管可以帶一定電荷 并且可以是水溶性的，但本質(zhì)上都有一定親油性，這種親油作用是導致其難以從吸附劑上 解吸下來的重要原因之一。一般而言，常規(guī)吸附劑都具有選擇性偏低，解吸率低的特點。本 發(fā)明的目的是提供一種能高效、高選擇地吸附某一等電點的多肽同時又能高效地解吸的吸 附劑。利用對吸附劑的設計或選擇，可最大化pH-可逆的離子作用而最小化親油互補作用， 就能實現(xiàn)商效吸附和商效解吸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種多肽提取與分離方法，該法并能有效提取等電點在特 定范圍的多肽，并通過分離洗脫來達到純化目的。
[0005] 本發(fā)明提出的多肽提取與分離方法，具體步驟如下： (1)對單一多肽的吸附與釋放 (1. 1)配置濃度為1X ΚΓ2摩爾/升X ΚΓ8摩爾/升的多肽的緩沖水溶液，控制緩沖 水溶液pH值大于多肽的等電點pl，然后向所得溶液中加入吸附劑Si02@PEI，并進行紫外/ 可見光譜的時間檢測，隨著時間加長，吸光度越來越低，直到吸光度不發(fā)生變化，即認為達 到了吸附平衡； (1. 2)將上述吸附了多肽的吸附劑Si02@PEI過濾，并采用新鮮的緩沖水溶液洗滌，所述 緩沖水溶液與步驟（1. 1)所述的緩沖水溶液的pH值相同，然后該吸附劑Si02@PEI所吸附 的多肽用另一緩沖水溶液洗脫回收，所述另一緩沖水溶液pH值小于多肽的等電點pl，并繼 續(xù)進行紫外/可見光譜的時間檢測，直到紫外/可見光吸收不發(fā)生變化；即認為達到了釋放 平衡； (2)對特定多肽的提取與純化 由于特定多肽具有確定的等電點（pl)，因此先將吸附劑Si02@PEI加入到含有目標提 取多肽和干擾多肽的緩沖水溶液中，控制緩沖水溶液中的pH值大于目標提取多肽的等電 點pi ;經(jīng)過1~48小時孵化，將吸附劑Si02@PEI分離并在該pH值下采用新鮮的緩沖水溶液 洗滌，該吸附劑Si0 2@PEI所吸附的多肽以另一 pH值低于pi的緩沖水溶液洗脫回收，該過 程采用高效液相色譜（HPLC)或基質(zhì)輔助激光解吸/離子化時間譜（MALDI-TOF)進行檢測； 基于等電點差異的提取方法通過切換pH值即可提取各類目標多肽，完全滿足常規(guī)的分離 要求。洗脫后的吸附劑可再利用。
[0006] 本發(fā)明中，所述二氧化硅至少有一維尺寸在150微米以上，特別是300微米以上的 二氧化硅，目的在于便于過濾或離心分離。
[0007] 本發(fā)明中，所述目標提取多肽與干擾多肽的濃度中的任意一種多肽的濃度不低于 或等于1ΧΚΓ 6摩爾/升時，采用高效液相色譜（HPLC)進行檢測。
[0008] 本發(fā)明中，所述目標提取多肽與干擾多肽中的任意一種多肽的濃度不低于或等于 IX 10_15摩爾/升時，采用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化時間譜（MALDI-T0F)進行檢測。
[0009] 本發(fā)明利用二氧化硅負載的P E I作為吸附劑，這是由P E I的特點決定的。P E I易于質(zhì)子化而呈陽離子性，只有當p Η大于1 0時才呈電中性。因此當p Η小于1 0 時，能吸附陰離子性的多肽。同時，當將Ρ Η切換到更低值時，多肽可以由帶負電變成帶正 電，與PE I產(chǎn)生電荷排斥，從而可以脫附。還應該注意到，PE I在低pH值時呈強烈親 水性，與多肽的電荷排斥作用強而親油互補弱，故可能體現(xiàn)高的脫附能力。在這方面，Ρ E I是獨特的：它的脂肪胺含量高，易質(zhì)子化，同時在低pH時親油性弱。
[0010] 本發(fā)明利用較大尺寸的二氧化硅作為載體有利于分離。一般而言，載體顆粒越小， 表面積越大，吸附越快。這是其有利的一方面。但是顆粒小到一定程度則不易分離。故本 發(fā)明采用150微米以上的二氧化硅，特別是300微米以上的二氧化硅，目的在于便于過濾或 離心分離。
[0011] 本發(fā)明所述的二氧化硅載體可以是多孔的，但PEI不宜在孔中。PEI如果進入孔中 并被固定在其中可能不利于底物的洗脫。
[0012] 本發(fā)明所示的吸附劑可以處理含多種多肽的水溶液。多肽的含量可僅為皮摩爾每 升或飛摩爾以下。
[0013] 本發(fā)明所述的吸附劑能按pH不同而選擇吸附不同的多肽。例如對于等電點分別 為3和5的多肽，可以選擇pH為4,則等電點為3的多肽被吸附而等電點為5的保持不動。 如果選擇pH為6,則兩種多肽都被吸附。但洗脫時如果選擇pH為4,則僅一種多肽被洗脫 下來。
[0014] 本發(fā)明所述的吸附劑，可以用較強酸處理而再生。所用的酸以無機酸最佳，例如P Η為1或更低。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：能處理痕量級別（飛摩爾量以下）的多肽組分；能高效脫 附，對一般多肽脫附率在79-92% ;能抗干擾，即使目標多肽的相對豐度僅為0. 1%或更低也 能有效選擇吸附。本發(fā)明非常適合某些特定功能的多肽的提取純化；也可用于蛋白序列分 析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1對多肽（A) EE-6和QF-9或（B)PP-6和GI-6在以過量吸附劑處理前(實 線)和處理后（點線）的HPLC檢測跡線。測試條件：對（A)的吸附是pH 5 (醋酸緩沖液， 0.01 M)而（B) pH為7.4 (磷酸緩沖液0.01 M);所有多肽儲備液的濃度為5.0 X ΚΓ5 M，但在HPLC測試前經(jīng)冷凍一干燥法濃縮20倍左右；HPLC測試采用梯度洗脫液，即0. 1% CF3C00H乙腈液/0.1% CF3C00H水液，前者在2 5分鐘內(nèi)由18%升至100% (A)或由15% 升至100% (B) ; X代表CF3C00H的信號。
[0017] 圖 2 含量僅為 5. 0 X 1(Γ12 Μ 的 PP-6, QF-9, VE-18 和 PH-28 經(jīng)吸附一分離一 洗脫后進行MALDI-T0F測試的結(jié)果。條件：吸附在pH 7.4的磷酸緩沖液中進行，然后再 以pH 4的醋酸緩沖液洗脫后進行測試。
[0018] 圖3低豐度的多肽EE-6，ED-9，SP-20和EL-25 (濃度均為4.0 X 1(Γ7 M)和 高豐度的多肽PP-6 (4.0 X 10_4M) -起進行MALDI-T0F測試時，只有后者的信號可以被 觀測到（A)，但經(jīng)過吸附劑吸附、分離和洗脫后，這些低豐度的多肽信號可以被清晰地觀 測到（B)。測試條件：孵化時pH 5 (醋酸緩沖液0.01 M)，洗脫時pH 2 (磷酸緩沖液0.01 M)。

【具體實施方式】
[0019] 以下實施例僅為更進一步具體說明本發(fā)明，在不違反本發(fā)明的主旨下，本發(fā)明應 不限于以下實例具體明示的內(nèi)容。
[0020] 實施例1 (多肽的吸附與釋放） 表1.在實施例中涉及到的幾種多肽._

【權利要求】
1. 一種多肽提取與分離方法，其特征在于具體步驟如下： 對于單一多肽的吸附與釋放 (1. 1)配置濃度為1X ΚΓ2摩爾/升X ΚΓ8摩爾/升的多肽的緩沖水溶液，控制緩沖 水溶液pH值大于多肽的等電點pl，然后向所得溶液中加入吸附劑Si02@PEI，并進行紫外/ 可見光譜的時間檢測，隨著時間加長，吸光度越來越低，直到吸光度不發(fā)生變化，即認為達 到了吸附平衡； (1. 2)將上述吸附了多肽的吸附劑Si02@PEI過濾，并采用新鮮的緩沖水溶液洗滌，所述 緩沖水溶液與步驟（1. 1)所述的緩沖水溶液的pH值相同，然后該吸附劑Si02@PEI所吸附 的多肽用另一緩沖水溶液洗脫回收，所述另一緩沖水溶液pH值小于多肽的等電點pl，并繼 續(xù)進行紫外/可見光譜的時間檢測，直到紫外/可見光吸收不發(fā)生變化；即認為達到了釋放 平衡； 對于特定多肽的提取與純化 由于特定多肽具有確定的等電點pl，因此先將吸附劑Si02@PEI加入到含有目標提取 多肽和干擾多肽的緩沖水溶液中，控制緩沖水溶液中的pH值大于目標提取多肽的等電點 pi ;經(jīng)過1~48小時孵化，將吸附劑Si02@PEI分離并在該pH值下采用新鮮的緩沖水溶液洗 滌，該吸附劑Si0 2@PEI所吸附的多肽以另一 pH值低于pi的緩沖水溶液洗脫回收，該過程 采用高效液相色譜或基質(zhì)輔助激光解吸/離子化時間譜進行檢測；基于等電點差異的提取 方法通過切換pH值即可提取各類目標多肽，完全滿足常規(guī)的分離要求，洗脫后的吸附劑可 再利用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述二氧化硅至少有一維尺寸在150微米 以上。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述目標提取多肽與干擾多肽中的任意一 種多肽的濃度不低于或等于IX 1〇_6摩爾/升時，采用高效液相色譜進行檢測。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述目標提取多肽與干擾多肽中的任意一 種多肽的濃度不低于或等于1X 1〇_15摩爾/升時，采用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化時間譜 進行檢測。
【文檔編號】C07K1/36GK104193799SQ201410396536
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2014年8月13日
【發(fā)明者】萬德成, 陳 峰, 金明, 浦鴻汀 申請人:同濟大學