專利名稱：抗蟲融合基因、融合蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得高殺蟲能力的抗蟲融合基因的方法和一種高殺蟲能力的抗 蟲融合基因和融合蛋白、以及該融合蛋白的具體應(yīng)用。
背景技術(shù)：
害蟲給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來每年約80億美元的損失。害蟲的防治目前主要依靠使 用化學(xué)農(nóng)藥，但是農(nóng)藥殘留會(huì)對(duì)人體健康帶來危害。因此，人們成功的選擇了利用殺蟲毒素 轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行抗蟲，目前轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米和棉花已經(jīng)大量種植。
轉(zhuǎn)基因作物抗蟲的關(guān)鍵技術(shù)是獲得性能優(yōu)良的殺蟲蛋白質(zhì)，殺蟲蛋白質(zhì)有多種。 比較常用的是Bt晶體蛋白質(zhì)，例如CrylAb，CrylC等，它們已被大量運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作 物。但是單個(gè)殺蟲毒素往往殺蟲譜都比較窄，殺蟲活性比較低。同時(shí)長期大量使用單一的 殺蟲蛋白質(zhì)還可能引起害蟲抗性的發(fā)展。因此，獲得高殺蟲活性的新型蛋白質(zhì)殺蟲毒素，對(duì) 提高殺蟲能力和減緩害蟲抗性的發(fā)生具有重要應(yīng)用價(jià)值。
參考文獻(xiàn)如下
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本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種獲得高殺蟲能力的抗蟲融合基因的方法；同 時(shí)提供高殺蟲能力的融合抗蟲基因，相應(yīng)的融合蛋白及其用途。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種抗蟲融合基因，該基因包括從5’ -3’依 次為含有編碼BT晶體毒素Cryl的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2 個(gè)核苷酸序列位于同一個(gè)開放閱讀框內(nèi)；Cryl晶體毒素為C端切除的活性毒素。
作為本發(fā)明的抗蟲融合基因的一步改進(jìn)Cryl晶體毒素為CrylAb、CrylAc， CrylAa0
作為本發(fā)明的抗蟲融合基因的進(jìn)一步改進(jìn)當(dāng)Cryl晶體毒素為CrylAb時(shí)，融合基 因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1 ；當(dāng)Cryl晶體毒素為CrylAc時(shí)，融合基因的核苷酸序列為 SEQID NO :2。
本發(fā)明還提供了上述抗蟲融合基因編碼的融合蛋白，該融合蛋白從N端至C端依 次為Cryl晶體毒素和Cry9Aa毒素。
作為本發(fā)明的融合蛋白的一種改進(jìn)當(dāng)Cryl晶體毒素為CrylAb時(shí)，融合蛋白的氨 基酸序列為SEQ ID NO 3 ；當(dāng)Cryl晶體毒素為CrylAc時(shí)，融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :4。
本發(fā)明還提供了上述融合蛋白在轉(zhuǎn)基因抗蟲作物和轉(zhuǎn)基因殺蟲微生物方面的應(yīng)用。
本行業(yè)的技術(shù)人員均知道以下理論
1、二個(gè)Cry殺蟲基因的融合并不是都能夠增強(qiáng)殺蟲能力的。例如CrylAb和CrylCa 的融合蛋白質(zhì)的殺蟲能力比相同重量的單獨(dú)CrylAb和CrylCa的混合物的殺蟲能力還要 低。
2、即使兩個(gè)單獨(dú)蛋白質(zhì)組合使用具有增效作用，但也并不能得出它們的融合蛋白 具有高效殺蟲能力；這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)生物化學(xué)上，兩個(gè)單獨(dú)蛋白質(zhì)的物理混和與融合 是不同的，不能根據(jù)物理混和所具有的增效作用來肯定融合后所獲得的增效作用；且在不 同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相徑庭的。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的用一個(gè)Cryl晶體毒素與Cry9Aa毒素融合成的人工蛋白質(zhì)分子， 與原先的Cryl和Cry9Aa晶體毒素物理混合相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)殺蟲活性提高了 10倍以 上，殺蟲譜更廣。本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)可以殺滅粘蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉 米和棉花的主要鱗翅目害蟲。此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的融合蛋白質(zhì)還可以有效的減緩害蟲抗性 的發(fā)生。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為已知的技術(shù)。在 Ausubel 編寫的 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，禾口 J. Sambrook 等編寫 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning =ALabortory Manual, 3rd ED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1、CrylAb_Cry9A和CrylAc_Cry9A融合基因的構(gòu)建
編碼Cry9Aa、CryIAb、CryIAcJP CrylCa的殺蟲蛋白的基因均由上海生工合成，其 DNA 序列分別為 SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8。這些基因分別 被克隆到載體pET28a表達(dá)載體中限制性內(nèi)切酶BamHI和^cI的位點(diǎn)之間，得到的載體分 別命名為 pET-9Aa、pET-lAb、pET-lAc 和 pET-lCa。
CrylAb-Cry9Aa 構(gòu)建過程=CrylAb 片段由 BamHI 和 XmaI 酶切 pET-lAb 獲得， Cry9Aa片段由XmaI和SacI酶切pET_9Aa獲得。載體pET28a經(jīng)過BamHI和SacI酶切以后 和CrylAb以及Cry9Aa連接，得到載體PET-CrylAb-Cry9Aa。這個(gè)載體包含一個(gè)融合基因， CrylAb-Cry9Aa(如SEQ ID NO 1)，其編碼一個(gè)氨基酸序列為SEQ ID No 3的融合蛋白質(zhì)。
CrylAc-Cry9Aa 構(gòu)建過程CrylAc 片段由 BamHI 和)(mal 酶切 pET-lAc 獲得， Cry9Aa片段由XmaI和SacI酶切pET_9Aa獲得。載體pET28a經(jīng)過BamHI和SacI酶切以 后和CrylAc以及Cry9Aa連接，得到載體PET-CryAC-Cry9Aa。這個(gè)載體包含一個(gè)融合基因， CryAc-Cry9Aa(如SEQ ID NO 2)，其編碼一個(gè)氨基酸序列為SEQ ID No 4的融合蛋白質(zhì)。
說明SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核酸序列的表達(dá)框從第一個(gè)起始密碼子 (ATG)開始，到最后終止密碼子(TAA)前結(jié)束，長度均為3933bp，與SEQ ID NO :3和SEQ IDNO 4對(duì)應(yīng)。第一個(gè)ATG前的核酸序列GGATCC為BamHl酶切位點(diǎn)，其后的ACC為核糖體結(jié) 合位點(diǎn)，最后GAGCTC為Mel酶切位點(diǎn)。
CrylAb-CrylCa 的構(gòu)建過程CrylAb 片段由 BamHI 和)(mal 酶切 pET-lAb 獲得， CrylCa片段由XmaI和&icl酶切ρΕΤ-lCa獲得。載體pET28a經(jīng)過BamHI和&icl酶切以后 和CrylAb以及CrylCa連接，得到載體pET-CrylAb-CrylCa。這個(gè)載體包含一個(gè)融合基因， CryAb-CrylCa，其核酸序列為 SEQ ID No :9。
實(shí)施例2、殺蟲蛋白質(zhì)的制備
包含殺蟲基因的載體pET_9Aa、pET-lAb、pET-lAc、pET-lCa、CrylAb-Cry9Aa, CryAc-Cry9Aa 和 CrylAb-CrylCa 分別導(dǎo)入 BL21Star 細(xì)胞系(Ε. coli)，在包含 50mg/L 卡那 霉素的LB固體培養(yǎng)基上選取單克隆。單個(gè)菌落接種到100毫升LB細(xì)菌培養(yǎng)液，在37°C下 震動(dòng)培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 6，然后加 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactoside)到 0. 5mM,并繼 續(xù)在同樣的條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)液經(jīng)過5000g離心10分鐘沉淀大腸桿菌細(xì)胞，然后棄 上清收集沉淀。沉淀中加30毫升20mM Tris-HCl緩沖液，超聲粉碎。這樣獲得的重組蛋白 質(zhì)用來進(jìn)行殺蟲活性的測(cè)定。
實(shí)施例3、在大腸桿菌中表達(dá)的殺蟲蛋白的殺蟲活性測(cè)定
實(shí)施例2所獲得的殺蟲蛋白各100微升單獨(dú)或者混合涂在0. 5平方厘米昆蟲人工 飼料的表面，飼養(yǎng)新生一齡幼蟲用來進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定。陰性對(duì)照的準(zhǔn)備方法與實(shí)施例2 相同，但質(zhì)粒為不含任何插入DNA的pET28a載體本身。飼養(yǎng)7天以后統(tǒng)計(jì)殺蟲率，結(jié)果如 表1和2所示
表 1、CrylAb_Cry9Aa 的殺蟲率
權(quán)利要求
1.一種抗蟲融合基因，其特征是所述基因包括從5’ -3’依次含有編碼BT晶體毒素 Cryl的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2個(gè)核苷酸序列位于同一個(gè) 開放閱讀框內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蟲融合基因，其特征是所述抗蟲融合基因包括CrylAa、 CrylAb, CryIAc, CrylAa的修飾基因、CrylAb的修飾基因或CrylAc的修飾基因；所述抗蟲 融合基因還包括Cry9Aa或者Cry9Aa經(jīng)過修飾的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗蟲融合基因，其特征是所述抗蟲融合基因的核苷酸序列 為以下任意一種SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、與 SEQ ID NO :3 相比具有彡 90% 的相同性、與 SEQ ID NO: 4相比具有彡90%的相同性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任意一種抗蟲融合基因所編碼的融合蛋白，其特征是所述 融合蛋白從N端至C端依次為Cryl晶體毒素和Cry9Aa毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征是所述融合蛋白的氨基酸序列為以下任 意一種SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、與 SEQ ID NO :1 相比具有彡 90% 的相同性、與 SEQ ID NO: 2相比具有彡90%的相同性。
6.如權(quán)利要求4或5所述的融合蛋白在轉(zhuǎn)基因抗蟲農(nóng)作物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗蟲融合基因，該基因包括從5’-3’依次含有編碼BT晶體毒素Cry1的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2個(gè)核苷酸序列位于同一個(gè)開放閱讀框內(nèi)。該抗蟲融合基因包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Aa的修飾基因、Cry1Ab的修飾基因或Cry1Ac的修飾基因；還包括Cry9Aa或者Cry9Aa經(jīng)過修飾的基因。本發(fā)明還同時(shí)公開了上述抗蟲融合基因所編碼的融合蛋白，該融合蛋白從N端至C端依次為Cry1晶體毒素和Cry9Aa毒素。本發(fā)明的融合蛋白能用于制備轉(zhuǎn)基因抗蟲農(nóng)作物。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102031266SQ201010132429
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者沈志成, 高建華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)