專利名稱：：使用固相和溶液相組合技術(shù)的促胰島素肽合成法的制作方法使用固相和溶液相組合技術(shù)的促胰島素肽合成法本發(fā)明涉及使用固相和溶液相方法制備促胰島素肽(insulinotropicpeptide)，尤其艾塞那肽(exenatide)及其對(duì)應(yīng)物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可在這些方法中使用的中間肽片段。在文獻(xiàn)中描述了許多肽合成方法(例如，見美國專利號(hào)6，015，881；Mergler等人，(1988)TetrahedronLetters(四面體快報(bào))29:4005_4008;Mergler等人，(1988)TetrahedronLetters(四面體快報(bào))29:4009_4012;Kamber等人，(主編)，Peptides,ChemistryandBiology(肽，化學(xué)與生物學(xué))，ESCOM，Leiden(1992)525-526;Riniker等人，(1993)TetrahedronLetters(四面體快報(bào))499307-9320；Lloyd-ffiIliams等人，(1993)TetrahedronLetters(四面體快報(bào))4911065-11133；和Andersson等人，(2000)Biopolymers(生物高分子)55:227_250。不同合成方法通過其中發(fā)生合成的相的物理狀態(tài)來區(qū)分，即，液相或固相。在固相肽合成法(SPPS)中，氨基或肽基結(jié)合于固體支持物樹脂。然后連續(xù)的氨基酸或肽基附著于支持物結(jié)合的肽直至形成目標(biāo)肽物質(zhì)。然后支持物結(jié)合的肽典型地從該支持物上裂解下來并進(jìn)行進(jìn)一步加工和/或純化。在一些情況下，固相合成生成成熟肽產(chǎn)物；在其他情況下，從支持物上裂解的肽(即，“肽中間片段”)用于制備更大的成熟肽產(chǎn)物。由固相方法生成的肽中間片段可在固相或在液相合成方法(本文中稱為“溶液相合成(solutionphasesynthesis)")中偶聯(lián)在一起。溶液相合成可具體用于通過固相合成有用的成熟肽是不可能的或不實(shí)際的情況下。例如，在固相合成中，較長(zhǎng)的肽最終可能采取不規(guī)則的構(gòu)象，而仍然附著在固體支持物上，使得難以向生長(zhǎng)鏈添加另外的氨基酸或肽物質(zhì)。由于肽在支持物樹脂上變得更長(zhǎng)，加工步驟諸如偶聯(lián)和脫保護(hù)的效率可能會(huì)降低。這，隨之，除了增加起始物質(zhì)諸如可活化的氨基酸、共試劑(co-reagent)和溶劑的損失以夕卜，可導(dǎo)致較長(zhǎng)的加工時(shí)間來彌補(bǔ)這些問題。這些問題可隨著肽的長(zhǎng)度增加而增加。因此，找到僅使用固相步驟以單個(gè)片段合成的長(zhǎng)度大于30個(gè)氨基酸的成熟肽是相對(duì)少見的。然而，各個(gè)片段可單獨(dú)地在固相上合成，并然后在固相和/或溶液相中偶聯(lián)以構(gòu)建所需的肽產(chǎn)物。此途徑需要細(xì)心地選擇片段候選物。盡管一些一般原理可指導(dǎo)片段選擇，但常常需要對(duì)片段候選物的經(jīng)驗(yàn)性測(cè)試。在一種情況下能起作用的片段策略可能在其他情況下不能起作用。即使當(dāng)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)钠魏蜻x物時(shí)，對(duì)于合成策略仍然需要工藝的革新從而在商業(yè)上合理的條件下工作。因此，使用混合方案的肽合成經(jīng)常是具有挑戰(zhàn)性的，并且在許多情況下，難以預(yù)測(cè)合成方案中固有的問題直至進(jìn)行實(shí)際的合成。在溶液相偶聯(lián)中，兩個(gè)肽中間片段，或一個(gè)肽中間片段(或“片段”)和反應(yīng)性氨基酸在適當(dāng)?shù)娜軇┲校ǔＴ诹硗獾拇龠M(jìn)偶聯(lián)反應(yīng)的效率和質(zhì)量的試劑的存在下偶聯(lián)。肽中間片段(或“片段”)反應(yīng)性地排列，使得一個(gè)片段的N-末端變?yōu)榕c另一片段的C-末端偶聯(lián)，或反之亦然。另外，在固相合成期間內(nèi)存在的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)通常在溶液相偶聯(lián)期間內(nèi)保持在片段上，以確保所述片段末端的特異反應(yīng)性。這些側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)典型地不被去除直至形成成熟肽?？偤铣煞桨钢械囊粋€(gè)或多個(gè)步驟的適度改進(jìn)可以意味著成熟肽的制備中的顯著改進(jìn)。這樣的改進(jìn)可總體上極大地節(jié)省時(shí)間和試劑，并且還可顯著地提高最終產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。對(duì)于此混合途徑，正確選擇化學(xué)策略是必需的，因?yàn)橛捎诒煌耆Ｗo(hù)的片段的溶解性差以及在溶液相偶聯(lián)中容易發(fā)生差向異構(gòu)化，使得該方法存在明顯的缺陷。盡管對(duì)混合合成中改進(jìn)的重要性的討論適用于使用這些步驟生產(chǎn)的任意肽，但是其在治療有效的和以用于商業(yè)醫(yī)療應(yīng)用的規(guī)模制造的肽的情況下特別重要。較大生物分子藥物諸如治療性肽的合成，可以是非常昂貴的。除了其他因素以外，由于試劑成本、合成時(shí)間、眾多合成步驟，這些較大生物分子藥物的合成工藝中非常小的改進(jìn)就可對(duì)是否在經(jīng)濟(jì)上可行地生產(chǎn)此類藥物具有顯著的影響。由于對(duì)于較大生物分子藥物的高生產(chǎn)成本，這些改進(jìn)是必需的，這一觀點(diǎn)得到下列事實(shí)的支持，即，在許多情況下，存在很少，即便有，關(guān)于這些類型的較大生物分子藥物的合適的治療備選方案。這在促胰島素肽諸如艾塞那肽及其功能性對(duì)應(yīng)物的情況下顯而易見。此類肽是治療2型非胰島素依賴性糖尿病和肥胖癥的治療劑。該肽改善內(nèi)源性胰島素的初始快速釋放，抑制胰腺釋放胰高血糖素，調(diào)節(jié)胃排空，并且降低食欲_所有這些起降低血糖的作用。艾塞那肽是自調(diào)節(jié)的，即當(dāng)水平升高時(shí)降低血糖，但當(dāng)水平恢復(fù)至正常水平時(shí)不再繼續(xù)降低血糖。天然艾塞那肽分離自希拉毒蜥(Gilamonster)，并且其長(zhǎng)度為39個(gè)氨基酸殘基。艾塞那肽的分子量為4186.6道爾頓(Dalton)。天然艾塞那肽，當(dāng)通過合成而生成時(shí)被稱為毒蜥外泌肽-4(exendin-4)，其以BYETTA的商品名在商業(yè)上銷售，并且可表示為符號(hào)艾塞那肽(exenatide)(1-39)。此符號(hào)表明該肽具有從1(N-末端)至39(C-末端)的所有氨基酸。艾塞那肽具有根據(jù)SEQIDNO.1的氨基酸序列Hisl-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leuio-Serll-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-GIy3o-Pro3i-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39在艾塞那肽的固相和溶液相合成中關(guān)鍵的挑戰(zhàn)涉及在15、16和17位中的三個(gè)谷氨酸殘基的序列。實(shí)際上，象這樣在序列中具有至少兩個(gè)谷氨酸殘基的任意肽都將遇到這樣的挑戰(zhàn)。具體來說，難以化學(xué)合成非常遠(yuǎn)離這些谷氨酸殘基的肽片段。不希望受理論的約束，重復(fù)Glu序列傾向于產(chǎn)生在固相中扭曲的片段部分。這使得相對(duì)難以有效地通過該Glu鏈繼續(xù)生成片段尺寸。在常規(guī)的實(shí)踐中，作為實(shí)際情況，具有兩個(gè)或多個(gè)重復(fù)Glu殘基的序列的片段可能僅能夠在上游(朝向C末端)和/或下游(朝向N末端)具有1-3個(gè)氨基酸。該問題往往在該重復(fù)Glu鏈的下游更嚴(yán)重。這常常可能意味著在固相中生長(zhǎng)的含有重復(fù)Glu殘基的序列的肽片段往往相對(duì)短。在艾塞那肽的情形中，這個(gè)問題已經(jīng)影響了固相片段策略。在一種情況下，片段斷裂點(diǎn)可能位于Glu序列內(nèi)，使得一個(gè)片段僅包括一個(gè)Glu殘基。然而，此策略，在艾塞那肽背景下，仍然保留另一個(gè)具有兩個(gè)連續(xù)的Glu殘基的片段，并且在這些片段在溶液相中偶聯(lián)之前可以至少在固相中的4片段合成策略。備選地，所有三個(gè)Glu殘基可包括在一個(gè)片段中。然而，使用常規(guī)策略，這可能意味著在將第三個(gè)Glu殘基添加到構(gòu)建中的片段上后，可能只有向該片段添加Met、Met和Gln，或可能是Met，Gln和Lys殘基是實(shí)際的，由此剩余的殘基以單獨(dú)的肽片段組裝。此外，在片段在溶液相中偶聯(lián)之前，這可以指示在固相中的4片段合成策略。盡管四片段合成途徑在一些情況下可能是理想的，但重復(fù)Glu序列的常規(guī)處理甚至使這些策略產(chǎn)生的問題比期望的更多。簡(jiǎn)言之，實(shí)踐中關(guān)于重復(fù)Glu序列的擔(dān)心可能使合成策略借助額外的片段來確保引入重復(fù)Glu殘基的片段相對(duì)短。非常需要能夠使用固相合成來合成包括兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)的Glu殘基的較長(zhǎng)片段。除了這些擔(dān)心以外，涉及對(duì)于肽的大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)物回收和產(chǎn)物純度，以及試劑處理、儲(chǔ)存和處置的問題，可極大地影響肽合成方案的可行性。因此，一直需要能夠有效地以改進(jìn)的產(chǎn)率大批量地生產(chǎn)商業(yè)上感興趣的肽物質(zhì)的肽合成工藝。本發(fā)明涉及使用固相和溶液相(“混合”)途徑合成的肽的制備，其中該肽包括肽氨基酸序列中的兩個(gè)或多個(gè)鄰接的Glu殘基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)弓I入這些重復(fù)Glu序列的長(zhǎng)的肽片段，在該片段也引入一個(gè)或多個(gè)假脯氨酸殘基作為兩個(gè)相應(yīng)的氨基酸殘基的置換物時(shí)，可以很容易地合成。不希望受理論約束，認(rèn)為所述一個(gè)或多個(gè)假脯氨酸有助于加強(qiáng)生長(zhǎng)的片段，使其更容易地繼續(xù)向生長(zhǎng)鏈上添加比在缺乏所述一個(gè)或多個(gè)假脯氨酸時(shí)可以實(shí)際實(shí)現(xiàn)的顯著更多的氨基酸。示意性地，假脯氨酸可被認(rèn)為是原位支架，其有助于將正在生長(zhǎng)的肽片段保持為更易于將另外的氨基酸殘基引入至正在生長(zhǎng)的肽鏈中的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。在脫保護(hù)期間，假脯氨酸很容易被修飾以生成起初假脯氨酸所置換的所需的氨基酸殘基對(duì)。假脯氨酸可在上游(朝向C-末端)被置換，以允許更多的上游氨基酸殘基在該重復(fù)Glu序列之前，或在下游(朝向N-末端)被置換，以允許更多的下游氨基酸殘基被添加至Glu殘基之后的肽片段上。下游是更優(yōu)選地，因?yàn)槠溆幸嫘Ч怀?。通常，如果將假脯氨酸引入至肽或肽片段中使得不超過8，優(yōu)選地不超過5個(gè)間插氨基酸殘基在假脯氨酸殘基和重復(fù)Glu鏈和/或另一假脯氨酸鏈之間，則是理想的。假脯氨酸殘基的有益效果可延及若干另外的氨基酸殘基，因此在將一個(gè)以上的假脯氨酸引入肽或肽片段中的那些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基位于假脯氨酸殘基之間的理想的。本發(fā)明的原理適用于促胰島素肽諸如艾塞那肽，其包括15、16和17位中的三個(gè)Glu殘基的重復(fù)序列，以及其天然和非天然對(duì)應(yīng)物，和這些的的中間肽片段。例如，通過使用至少一個(gè)假脯氨酸，很容易地使用固相化學(xué)以僅三個(gè)不同的肽中間片段來合成艾塞那肽及其對(duì)應(yīng)物。然后使用溶液相化學(xué)來向片段之一添加另外的氨基酸物質(zhì)。然后使這些片段在溶液相中偶聯(lián)在一起。在艾塞那肽片段之一中使用假脯氨酸使得片段非常長(zhǎng)，即使該片段可以包括重復(fù)Glu殘基的序列，便于固相合成該片段，并且還便于隨后該片段與其他片段的溶液相偶聯(lián)。不使用至少一個(gè)假脯氨酸，需要至少4個(gè)肽片段來有效地應(yīng)用混合合成。例如，諸如艾塞那肽(1-17)、艾塞那肽(1-19)和艾塞那肽(1-20)(它們都包括Glu-Glu-Glu序列)的片段非常容易地使用假脯氨酸置換以高產(chǎn)率和純度來合成，而在不使用假脯氨酸置換時(shí)僅可以相似的產(chǎn)率和純度合成短很多的包括Glu-Glu-Glu序列的片段。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及促胰島素肽片段，包括包含至少兩個(gè)直接連續(xù)(indirectsequentce)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)的氨基酸序列，并且還包括至少一個(gè)假脯氨酸結(jié)構(gòu)部分的殘基，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)。優(yōu)選地，至少第一假脯氨酸殘基在谷氨酸殘基的重復(fù)序列和該片段的N-末端之間。此外，如上所限定的促胰島素肽片段是優(yōu)選，其中在假脯氨酸殘基和谷氨酸殘基的重復(fù)序列的最近的Glu殘基之間存在至少兩個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)優(yōu)選的方面，促胰島素肽還包括位于第一假脯氨酸殘基下游(S卩，靠近N-末端)的第二假脯氨酸殘基。優(yōu)選地，如上所限定的片段包括至少15個(gè)氨基酸的殘基，其中每個(gè)引入至該片段中的假脯氨酸殘基計(jì)數(shù)為兩個(gè)氨基酸殘基。更優(yōu)選地，促胰島素肽片段包括至少17個(gè)氨基酸的殘基。優(yōu)選如上所限定的促胰島素肽片段，其中谷氨酸殘基的重復(fù)序列鄰接該片段的C-末端。還優(yōu)選如上所限定的促胰島素肽片段，其中不超過兩個(gè)氨基酸殘基在谷氨酸殘基的重復(fù)序列和該片段的C-末端之間。更優(yōu)選地，如上所限定的片段包括至少三個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu-Glu)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，如上所限定的促胰島素肽包括SEQIDNo.34的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中選自Gly-Thr(4-5)、Phe_Thr(6-7)、Thr_Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一個(gè)位置被假脯氨酸置換，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)。優(yōu)選選自由下列各項(xiàng)組成的組的促胰島素肽片段SEQIDNo.2His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.4His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.5His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.6His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.7His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.8His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.9His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.10His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.11His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.15His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.16His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.17His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.18His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.19His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.20His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.21His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.25His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.26His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.27His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.28His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.29His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.30His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.31His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位處的假脯氨酸X4-X5對(duì)應(yīng)于Gly-Thr或其對(duì)應(yīng)物；6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物；7和8位處的假脯氨酸X7_X8對(duì)應(yīng)于Thr-Ser或其對(duì)應(yīng)物；以及10和11位處的假脯氨酸X10-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。特別優(yōu)選下式的促胰島素肽片段SEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6—X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位處的假脯氨酸X6_X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸X10-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。進(jìn)一步優(yōu)選的促胰島素肽片段是具有下式的那些SEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu_Glu，或SEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位處的假脯氨酸X6_X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸x10-x11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。還有下式的促胰島素肽片段SEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位處的假脯氨酸X6_X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸x10-x11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。此外優(yōu)選下式的促胰島素肽片段SEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,或SEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位處的假脯氨酸X6_X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸x10-x11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。另一優(yōu)選的促胰島素肽片段具有下式SEQIDNo.4:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val,其中6和7位處的假脯氨酸X6_X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸x^-x11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。還優(yōu)選下式的促胰島素肽片段SEQIDNo.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val，或SEQIDNo.3:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種制備促胰島素肽的方法，包括以下步驟a)制備包括氨基酸序列的第一肽片段或其對(duì)應(yīng)物，所述氨基酸序列包括至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸(Glu-Glu)并還包括假脯氨酸；和b)將所述肽片段引入至促胰島素肽中?！皩⑺鲭钠我胫链僖葝u素肽中”指將該肽片段與第二肽片段偶聯(lián)以獲得促胰島素肽。優(yōu)選地，該方法采用如上所限定的第一肽片段來進(jìn)行，其中至少第一假脯氨酸殘基在谷氨酸殘基的重復(fù)序列和該片段的N-末端之間。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，該方法采用選自由下列各項(xiàng)組成的組的片段來進(jìn)行SEQIDNo.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.4:His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.5:His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.6:His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.7:His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.8:His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.9:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.10His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.11His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.15His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.16His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.17His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.18His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.19His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.20His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.21His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.25His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.26His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Xn-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.27His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.28His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.29His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.30His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.31His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位處的假脯氨酸X4-X5對(duì)應(yīng)于Gly-Thr或其對(duì)應(yīng)物；6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物；7和8位處的假脯氨酸X7-X8對(duì)應(yīng)于Thr-Ser或其對(duì)應(yīng)物；以及10和11位處的假脯氨酸Xltl-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。更優(yōu)選地，該方法采用下式的第一肽片段來進(jìn)行SEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。在另一優(yōu)選方面，該方法采用選自由下列各項(xiàng)組成的組的第一肽片段來進(jìn)行SEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。還優(yōu)選這樣的方法，其中使用下式的第一肽片段SEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。此外，優(yōu)選如上所限定的方法，其中使用選自由下列各項(xiàng)組成的組的第一肽片段SEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala,其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。在進(jìn)一步優(yōu)選的方面，該方法采用下式的第一肽片段來進(jìn)行SEQIDNo.4His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val,其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。還優(yōu)選采用選自由下列各項(xiàng)組成的組的第一肽片段來進(jìn)行的方法SEQIDNo.2His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val，其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thr或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種促胰島素肽，其包括假脯氨酸的至少一個(gè)殘基；至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)；和任選至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。優(yōu)選地，促胰島素肽是艾塞那肽(1-39)的對(duì)應(yīng)物。更優(yōu)選地，該肽與艾塞那肽(1-39)的不同之處在于將假脯氨酸的所述至少一個(gè)殘基引入至該肽中的修飾。在另一方面，本發(fā)明涉及一種促胰島素肽，其包括假脯氨酸的至少一個(gè)殘基；至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)；和任選至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，其中該肽至少包括根據(jù)SEQIDNo.1-79的任意一個(gè)的氨基酸序列或其對(duì)應(yīng)物。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種促胰島素肽，其包括假脯氨酸的至少一個(gè)殘基；至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)；和任選至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，其中該肽至少包括根據(jù)SEQIDNo.2-31的任意一個(gè)的氨基酸序列或其對(duì)應(yīng)物。特別優(yōu)選的是一種促胰島素肽，其包括假脯氨酸的至少一個(gè)殘基；至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)；和任選至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，其中該肽至少包括根據(jù)SEQIDNo.2、3、4、12、13、14、22、23和24的任意一個(gè)的氨基酸序列或其對(duì)應(yīng)物。在另一方面，本發(fā)明涉及肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.35_39的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。在另一方面，本發(fā)明涉及肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.40_42的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。在另一方面，本發(fā)明涉及肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.43_45的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。在另一方面，本發(fā)明涉及肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.46_49的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種制備促胰島素肽的方法，包括以下步驟a)提供第一、第二和第三肽片段，所述第一肽片段包括至少兩個(gè)重復(fù)Glu殘基的序列并且包括假脯氨酸的至少一個(gè)殘基，并且其中所述片段的任意一個(gè)任選地包括至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)；b)將絲氨酸殘基與所述第三肽片段偶聯(lián)以獲得第四肽片段；c)將所述第四片段與所述第二片段偶聯(lián)以獲得第五片段；d)將所述第五肽片段與所述第一肽片段偶聯(lián)以獲得促胰島素肽。在優(yōu)選的方面，該方法進(jìn)一步包括分離所述肽的步驟，即e)層析純化所述肽；和f)沉淀所述純化的肽。優(yōu)選地，如上所限定的步驟a)包括提供包括SEQIDNo.34的氨基酸序列的第一肽片段His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中選自Gly-Thr(4-5),Phe-Thr(6-7),Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一個(gè)位置被假脯氨酸置換，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)。更優(yōu)選地，步驟a)包括提供選自由根據(jù)SEQIDNo.2-31的任意一個(gè)的片段組成的組的第一肽片段。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及制備如上所限定的促胰島素肽的方法，包括以下步驟a)提供選自由根據(jù)SEQIDNo.2-31的任意一個(gè)的片段組成的組的第一肽片段或其對(duì)應(yīng)物，選自由根據(jù)SEQIDNo.35、37-39的任意一個(gè)的片段組成的組的第二肽片段或其對(duì)應(yīng)物和選自由根據(jù)SEQIDNo.41或42的片段組成的組的第三肽片段或其對(duì)應(yīng)物。b)將絲氨酸殘基與所述第三肽片段偶聯(lián)以獲得第四肽片段；c)將所述第四片段與所述第二片段偶聯(lián)以獲得第五片段；d)將所述第五肽片段與所述第一肽片段偶聯(lián)以獲得促胰島素肽。優(yōu)選地，所述第一、第二和第三片段使用固相合成技術(shù)合成，而所述第四和第五片段以及所述促胰島素肽在溶液相中形成。還優(yōu)選這樣的方法，其中步驟(b)包括使用至少乙醇來引起沉淀。此外優(yōu)選如上所限定的方法，其中使用具有根據(jù)SEQIDNo.2、3、4、12、13、14、22、23和24的任意一個(gè)的氨基酸序列的第一肽片段或其對(duì)應(yīng)物。還優(yōu)選如上所限定的方法，其中使用具有根據(jù)SEQIDNo.35_39的任意一個(gè)的氨基酸序列的第二肽片段或其對(duì)應(yīng)物。另外，優(yōu)選如上所限定的方法，其中使用具有根據(jù)SEQIDNo.40_42的任意一個(gè)的氨基酸序列的第三肽片段或其對(duì)應(yīng)物。圖1是根據(jù)本發(fā)明的合成方案(10)的示意圖。第一肽片段(12)、第二肽片段(14)和第三肽片段(16)在固相上制備(步驟a)。第四片段(20)由第三片段(16)通過與絲氨酸偶聯(lián)制備(步驟b)。然后第四片段(20)與第二片段(14)偶聯(lián)以提供第五片段(22)(步驟C)。最后，第五片段(22)與第一片段(12)偶聯(lián)以獲得促胰島素肽(11)(步驟(1)。下面描述的本發(fā)明的實(shí)施方案并非意在是窮盡的，或?qū)⒈景l(fā)明限于下面詳述中公開的精確形式。而是，選擇和描述各實(shí)施方案，使得本領(lǐng)域其他技術(shù)人員可理解和獲知本發(fā)明的原理和實(shí)施。本發(fā)明涉及用于制備肽和肽片段的合成方法，所述肽和肽片段在肽的氨基酸序列中包括兩個(gè)或更多個(gè)鄰接的Glu殘基，優(yōu)選三個(gè)或更多個(gè)鄰接的Glu殘基的。本發(fā)明的肽分子可以是被保護(hù)的、未保護(hù)的或部分保護(hù)的。保護(hù)作用可包括N-末端保護(hù)、側(cè)鏈保護(hù)和/或C-末端保護(hù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明主要針對(duì)合成具有此重復(fù)Glu殘基的促胰島素肽及其對(duì)應(yīng)物，片段及其對(duì)應(yīng)物，以及這些的融合產(chǎn)物及其對(duì)應(yīng)物。最優(yōu)選地，本發(fā)明用來合成毒蜥外泌肽諸如艾塞那肽，艾塞那肽的對(duì)應(yīng)物，及其片段。如本文中所使用的“對(duì)應(yīng)物”指肽的天然或非天然類似物、衍生物、融合化合物、鹽類等。如本文中使用的，肽類似物通常指相對(duì)于另一肽或肽對(duì)應(yīng)物具有諸如通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失、倒位和/或添加作用修飾的氨基酸序列的肽。置換作用可涉及一個(gè)或多個(gè)天然或非天然氨基酸。置換作用優(yōu)選地可以是保守的或高度保守的。保守置換指氨基酸用另一個(gè)通常具有相同的凈電荷并通常具有相同的大小和形狀的氨基酸來置換。例如，具有脂族或置換的脂族氨基酸側(cè)鏈的氨基酸在其側(cè)鏈中的碳原子和雜原子總數(shù)目區(qū)別不超過約4個(gè)時(shí)具有近似相同的大小。當(dāng)其側(cè)鏈中的支鏈數(shù)目區(qū)別不超過大約1個(gè)或兩個(gè)時(shí)，它們具有近似相同的形狀。在其側(cè)鏈中帶有苯基或置換的苯基的氨基酸被認(rèn)為具有相同的大小和形狀。下面列舉了五組氨基酸?；衔镏邪被岜粊碜韵嗤M的另一氨基酸替換通常導(dǎo)致保守置換。I組甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱胺酸、甲硫氨酸和具有C1-C4脂族或C1-C4羥基置換的脂族側(cè)鏈(直鏈或單支鏈的)的非天然存在的氨基酸。II組谷氨酸、天冬氨酸和具有羧酸置換WC1-C4脂族側(cè)鏈(無支鏈的或一個(gè)分支點(diǎn))的非天然存在的氨基酸。III組賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸和具有胺或胍基置換的C1-CJg族側(cè)鏈(無支鏈的或一個(gè)分支點(diǎn))的非天然存在的氨基酸。IV組谷氨酰胺、天冬酰胺和具有酰胺置換的C1-C4脂族側(cè)鏈(無支鏈的或一個(gè)分支點(diǎn))的非天然存在的氨基酸。V組苯丙氨酸、苯甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。如本文中所使用的，術(shù)語“對(duì)應(yīng)物”更優(yōu)選地指肽的鹽類或指其在C-末端被酰胺化的衍生物?！案叨缺Ｊ刂脫Q”是氨基酸用在側(cè)鏈中具有相同的官能團(tuán)并具有幾乎相同大小和形狀的另一氨基酸替換。具有脂族或取代的脂族氨基酸側(cè)鏈的氨基酸在其側(cè)鏈中的碳原子和雜原子的總數(shù)目區(qū)別不超過兩個(gè)時(shí)，具有幾乎相同的大小。當(dāng)它們?cè)谄鋫?cè)鏈中具有相同數(shù)量的支鏈時(shí)，它們具有幾乎相同的形狀。高度保守置換的實(shí)例包括纈氨酸置換亮氨酸，蘇氨酸置換絲氨酸，天冬氨酸置換谷氨酸，以及苯甘氨酸置換苯丙氨酸。“肽衍生物”通常指具有一個(gè)或多個(gè)其側(cè)基、α碳原子、末端氨基和/或末端羧酸基團(tuán)的化學(xué)修飾的肽、肽類似物或其他肽對(duì)應(yīng)物。通過舉例，化學(xué)修飾包括，但不限于，添加化學(xué)結(jié)構(gòu)部分、建立新鍵和/或去除化學(xué)結(jié)構(gòu)部分。氨基酸側(cè)基處的修飾包括但不限于，賴氨酸e-氨基的?；?，精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸和天冬氨酸羧酸基團(tuán)的烷基化，谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺。末端氨基的修飾包括但不限于，脫氨、N-低級(jí)烷基、N-二低級(jí)烷基和N-酰基(例如，-CO-低級(jí)烷基)修飾。末端羧基的修飾包括但不限于，酰胺、低級(jí)烷基酰胺、二烷基酰胺和低級(jí)烷基酯修飾。因此，部分或完全保護(hù)的肽構(gòu)成肽衍生物。在本發(fā)明的實(shí)施中，如果化合物能夠刺激，或?qū)е麓碳せ蛴兄趯?dǎo)致刺激胰島素激素的合成或表達(dá)，則該化合物具有“促胰島素”活性。在優(yōu)選的實(shí)施模式中，可根據(jù)美國專利號(hào)6，887，849和6，703，365中所述的測(cè)定法證實(shí)促胰島素活性。為了舉例說明，現(xiàn)在將參照?qǐng)D1在合成具有下式(SEQ.IDNO.1)的艾塞那肽(11)的情況下說明本發(fā)明的原理Hisl-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leuio-Serll-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-GIy3o-Pro3i-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39認(rèn)為圖1的方案10特別適合于毒蜥外泌肽及其對(duì)應(yīng)物的擴(kuò)大規(guī)模的合成(scaled-upsynthesis)0典型地執(zhí)行擴(kuò)大規(guī)模的工序以提供用于商業(yè)分銷的肽量。例如，在擴(kuò)大規(guī)模的工序中肽的量可以為500g/批次，或Ikg/批次，并且更典型地?cái)?shù)十kg至數(shù)百kg/批次或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可提供這樣的改進(jìn)，即減少加工(合成)時(shí)間，提高產(chǎn)物產(chǎn)率，提高產(chǎn)物純度，和/或減少所需的試劑和起始原料的量。圖1中所示的合成方案10使用固相和溶液相技術(shù)的組合來制備肽產(chǎn)物(11)。參照?qǐng)D1，方案10涉及在固相上合成肽中間片段(12)、(14)和(16)。另外的氨基酸與片段(16)在溶液相中偶聯(lián)以制備片段(20)。然后，所得的三個(gè)片段在溶液相中組裝以制備全尺寸肽(11)。片段(12)通常包括至少8個(gè)氨基酸殘基，并且更理想地從His1經(jīng)由15、16和17位處的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，和更優(yōu)選至少全部三個(gè)Glu殘基延伸。將一個(gè)或多個(gè)假脯氨酸有利地引入至片段(12)中以便促進(jìn)此相對(duì)大的肽片段的合成。直到進(jìn)行脫保護(hù)步驟之前，以此方式使用的假脯氨酸殘基將被引入到該片段中或引入該片段的較大肽中，視情況而定。如在本發(fā)明的實(shí)施中使用的，術(shù)語“假脯氨酸”指包括羥基功能性氨基酸的殘基諸如Ser或Thr的二肽，其中羥基功能性側(cè)鏈被保護(hù)為α_氨基和側(cè)鏈羥基之間的脯氨酸樣，TFA不穩(wěn)定，噁唑烷環(huán)。噁唑烷環(huán)的結(jié)果是，二肽用作可逆的脯氨酸模擬物。假脯氨酸通常在構(gòu)建中被置換入肽片段中替換靶片段的兩個(gè)鄰接的氨基酸殘基。位于C-末端的假脯氨酸的部分通常對(duì)應(yīng)于噁唑烷環(huán)保護(hù)的Ser或Thr，而鄰接部分可對(duì)應(yīng)于任意其他的氨基酸。因此，當(dāng)被引入至肽中時(shí)典型的假脯氨酸殘基或結(jié)構(gòu)部分可表示為通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中靠近N-末端的Φ代表任意氨基酸的殘基，并且R1和R2各自獨(dú)立地是適當(dāng)?shù)亩r(jià)連接結(jié)構(gòu)部分。通常，R1是具有下式的二價(jià)結(jié)構(gòu)部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中R3和R4各自獨(dú)立地是一價(jià)結(jié)構(gòu)部分諸如H或低級(jí)烷基諸如甲基。R3和R4還可以是環(huán)結(jié)構(gòu)的共同成員(co-member)。理想地，R3和R4各自獨(dú)立地是甲基或H。更優(yōu)選地，R3和R4是甲基。對(duì)于噁唑烷環(huán)保護(hù)的Ser，R2是二價(jià)結(jié)構(gòu)部分CH2,而對(duì)于Thr，R2是二價(jià)結(jié)構(gòu)部分-(CH3)CH-。在脫保護(hù)期間，R1結(jié)構(gòu)部分被裂解以提供根據(jù)下式的二肽殘基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中R2如上限定。當(dāng)應(yīng)用于圖1中所示的艾塞那肽(1-39)(11)的片段(12)時(shí)，可將一個(gè)或多個(gè)此假脯氨酸置換入15，16和17位處的Glu殘基下游的片段中，以便促進(jìn)相對(duì)長(zhǎng)的片段的合成。如從SEQID.No.1中可見，在Glu-Glu-Glu殘基的下游5、7、8和11位處有Ser或Three殘基。這表明一個(gè)或多個(gè)假脯氨酸可在Gly-Thr(4_5)、Phe-Thr(6_7)、Thr-Ser(7-8)、和/或Leu-Ser(10-11)位處被置換入片段12中。優(yōu)選地，在Phe-Thr(6-7)和/或Leu-Ser(10-11)位的至少一位中使用假脯氨酸。更優(yōu)選地，在Phe-Thr(6_7)和Leu-Ser(IO-Il)位的各個(gè)位處使用相應(yīng)的假脯氨酸。盡管如果需要可使用第三和第四個(gè)假脯氨酸，但在這兩個(gè)優(yōu)選的位置處使用一個(gè)或兩個(gè)假脯氨酸提供相對(duì)簡(jiǎn)便地構(gòu)建片段12的合適性能而不需要額外的假脯氨酸的作用。在具體的說明性的實(shí)施模式中，適合用于替換10和11位處Leu-Ser的FMOC-保護(hù)的假脯氨酸具有式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中末端OH表示可用于在C-末端處偶聯(lián)的酸功能性。此假脯氨酸可由符號(hào)Fmoc-Leu-Ser(ΨMe’Mepro)-OH來標(biāo)識(shí)。類似地，適合用于替換6和7位處Phe-Thr的Fmoc-保護(hù)的假脯氨酸具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中末端OH表示可用于在C-末端處偶聯(lián)的酸功能性。此假脯氨酸可由符號(hào)Fmoc-Phe-Thr(￥Me'Mepro)-OH來標(biāo)識(shí)。第一片段(12)理想地具有式X^i艾塞那肽(1-m)片段，其中j和k被定義為殘基位置4和5，6和7，7和8，以及/或10和11，條件是假脯氨酸存在于這些位置中的至少一個(gè)位置處；各個(gè)X獨(dú)立地是假脯氨酸結(jié)構(gòu)部分；并且m為15-20，優(yōu)選地17-19，更優(yōu)選地17或19。因此，可以理解的是，第一片段格外地長(zhǎng)，即使優(yōu)選實(shí)施方案將Glu-Glu-Glu的序列引入靠近C-末端，在此處扭曲效應(yīng)可能是對(duì)于固相合成的最大問題。根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可包括側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，肽片段(12)可經(jīng)C-末端與樹脂結(jié)合。該片段任選地可帶有N-末端和/或C-末端保護(hù)基團(tuán)。就肽片段的固相合成而言，F(xiàn)moc,Alloc和Z結(jié)構(gòu)部分分別應(yīng)該是特別有用的N-末端保護(hù)基團(tuán)。Fmoc代表芴基-甲氧基-羰基結(jié)構(gòu)部分。Alloc指烯丙氧基羰基保護(hù)基團(tuán)。Z指芐氧基-羰基保護(hù)基團(tuán)。在代表性的實(shí)施方案中，片段(12)可包括如下的一種或多種肽片段SEQIDNo.2His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.3His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.4His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.5His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.6His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.7His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.8His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.9His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.10His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.11His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValSEQIDNo.12His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.13His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.14His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.15His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.16His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.17His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.18His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.19His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.20His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.21His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaSEQIDNo.22His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.23His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.24His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.25His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.26His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.27His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.28His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.29His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.30His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluSEQIDNo.31His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位處的假脯氨酸對(duì)應(yīng)于Gly-Thr或其對(duì)應(yīng)物；6和7位處的假脯氨酸對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物；7和8位處的假脯氨酸對(duì)應(yīng)于Thr-Ser或其對(duì)應(yīng)物；以及10和11位處的假脯氨酸對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。采用脫保護(hù)形式，含假脯氨酸的根據(jù)SEQIDNo.2_11的片段具有根據(jù)SEQIDNo.32的艾塞那肽(1-19)的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa-Val采用脫保護(hù)形式，含假脯氨酸的根據(jù)SEQIDNo.12_21的片段具有根據(jù)SEQIDNo.33的艾塞那肽(1-18)的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa采用脫保護(hù)形式，含假脯氨酸的根據(jù)SEQIDNo.22_31的片段具有根據(jù)SEQIDNo.34的艾塞那肽(1-17)的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu固相合成通常以片段(12)的C-末端至N-末端的方向進(jìn)行。因此，如果片段(12)包括17個(gè)氨基酸殘基，則存在于片段的C-末端部分上的17位氨基酸(Glu-)，是與固相樹脂支持物偶聯(lián)的第一個(gè)氨基酸殘基。然后固相合成通過以與所需序列對(duì)應(yīng)的方式連續(xù)地添加氨基酸而繼續(xù)進(jìn)行。在N-末端殘基(例如，N-末端組氨酸殘基(His)已加入至新生肽鏈后，肽中間片段的合成完成。片段(14)是第二肽片段，其通?？捎煞?hào)艾塞那肽(n-q)來識(shí)別，其中η為m+1(其中m在上面關(guān)于第一片段而限定，為15-20)，并且q為25-30。因此，片段(14)的N-末端可以是艾塞那肽或其對(duì)應(yīng)物的16-20位中任意一個(gè)位置處的氨基酸殘基，并且C-末端可以位于艾塞那肽或其對(duì)應(yīng)物的25-30位中任意一個(gè)位置處。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，η為18-20，并且q為26-30。根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，片段(14)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可包括側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，肽片段(14)可經(jīng)C-末端與樹脂結(jié)合。該片段任選地可帶有N-末端和/或C-末端保護(hù)基團(tuán)。就肽片段的固相合成而言，F(xiàn)moc,Alloc和Z結(jié)構(gòu)部分分別應(yīng)該是特別有用的N-末端保護(hù)基團(tuán)。在代表性的實(shí)施方案中，片段(14)可以具有如下的氨基酸序列SEQIDNo.35Alal8-Vali9-Arg2o-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26SEQIDNo.36Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly30SEQIDNo.37Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29SEQIDNo.38Vali9-Arg2o-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26SEQIDNo.39Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29如前所述，固相合成通常以片段(14)的C-末端至N-末端的方向進(jìn)行。因此，如果片段(14)在26位處結(jié)束，則存在于該片段的C-末端部分上的亮氨酸(Leu)氨基酸是與固相樹脂支持物偶聯(lián)的第一個(gè)氨基酸殘基。然后固相合成通過以與所需序列對(duì)應(yīng)的方式連續(xù)地添加氨基酸而繼續(xù)進(jìn)行。在N-末端殘基(例如，在片段(14)在18位處結(jié)束的情況下，為N-末端丙氨酸殘基(Ala))已加入至新生肽鏈后，肽中間片段的合成完成。片段(16)是第三肽片段，其可通常由符號(hào)艾塞那肽(q+1-38)來識(shí)別，其中q在上面關(guān)于第二片段而限定。注意到，片段(16)通過在天然艾塞那肽的C末端的39殘基位中尚不包括絲氨酸(Ser)殘基。絲氨酸經(jīng)常隨后在溶液相中與片段(16)的C末端偶聯(lián)，其優(yōu)選地使用帶有側(cè)鏈保護(hù)的絲氨酸。根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，片段(16)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可包括側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，肽片段16可經(jīng)C-末端與樹脂結(jié)合。該片段任選地可帶有N-末端和/或C-末端保護(hù)基團(tuán)。就肽片段的固相合成而言，F(xiàn)m0C、All0C和Z結(jié)構(gòu)部分分別應(yīng)該是特別有用的N-末端保護(hù)基團(tuán)。在代表性的實(shí)施方案中，片段(16)可具有如下的氨基酸序列SEQIDNo.40Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38SEQIDNo.41Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38SEQIDNo.42Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38固相合成通常以片段(16)的C-末端至N-末端的方向進(jìn)行。因此，存在于該片段的C-末端部分上的Pro38氨基酸是與固相樹脂支持物偶聯(lián)的第一個(gè)氨基酸殘基。然后固相合成通過以與所需序列對(duì)應(yīng)的方式連續(xù)地添加氨基酸而繼續(xù)進(jìn)行。在N-末端殘基(例如，在片段(16)包括艾塞那肽(27-38)的實(shí)施方案中，為N-末端賴氨酸殘基(Lys27))已加入至新生肽鏈后，肽中間片段的合成完成。根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，片段(16)的合成中使用的任意一個(gè)氨基酸可包括側(cè)鏈保護(hù)。繼續(xù)參照?qǐng)D1，片段(12)、(14)和(16)以及絲氨酸組裝在一起以完成所需的肽(11)，其理想地使用溶液相偶聯(lián)技術(shù)。要達(dá)到使該片段攜帶側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并引入假脯氨酸殘基的程度，在液相偶聯(lián)期間適當(dāng)?shù)乇３诌@些保護(hù)作用。反應(yīng)物的N-末端和C-末端也在合適時(shí)被保護(hù)。為了實(shí)現(xiàn)這些偶聯(lián)，在溶液相中將絲氨酸添加至片段(16)上以產(chǎn)生中間片段(20)。通過舉例，向片段(16)的各個(gè)實(shí)施方案添加Ser39可產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)片段(20)，諸如下列序列SEQIDNo.43Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.44Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.45Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39然后(14)和(20)在溶液相中偶聯(lián)以生成中間保護(hù)的片段(22)。通過舉例，下列是優(yōu)選的片段(22)的優(yōu)選實(shí)施方案SEQIDNo.46Alal8-Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-PrO31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.47Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.48Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-SeT32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.49Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly3o-Pro31-Ser32-SeT33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39然后肽片段(12)和(22)在溶液相中偶聯(lián)以生成含假脯氨酸的肽(11)。為了達(dá)到使其他氨基殘基攜帶側(cè)鏈保護(hù)的程度，需要在此步驟中自始至終保留該保護(hù)作用。通過舉例，下列是所得的優(yōu)選的肽(11)的優(yōu)選實(shí)施方案SEQIDNo.50His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.51His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.52His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VBl-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp24-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GlY34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.53His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.54His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VBl-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GlY34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.55His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.56His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.57His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.58His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-VBl-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GlY34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.59His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.60His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.61His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.62His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.63His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2l-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-PrO31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.64His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.65His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.66His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.67His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.68His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.69His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AlaVal-ATg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.70His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.71His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.72His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.73His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly28-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.74His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.75His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.76His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.77His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu34-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-GIy34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.78His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVaI-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39SEQIDNo.79His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GluAlaVal-ATg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39在SEQIDNo.50-79中，如上所限定，X4_X5，X6-X7,X7-X8和Xltl-X11對(duì)分別構(gòu)成假脯氨酸殘基。在進(jìn)行圖1的反應(yīng)方案中，可通過工業(yè)中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行固相和溶液相合成。在代表性的實(shí)施模式中，利用氨基酸從C-末端至N-末端添加的化學(xué)性質(zhì)在固相中合成肽。因此，靠近特定片段的C-末端的氨基酸或肽基團(tuán)首先被添加至樹脂上。這通過所述氨基酸或肽基團(tuán)的C-末端功能性與樹脂支持物上的互補(bǔ)功能性的反應(yīng)而發(fā)生。所述氨基酸或肽基團(tuán)的N-末端側(cè)被掩蔽以防止不需要的副反應(yīng)。所述氨基酸或肽基圖案也期望還包括側(cè)鏈保護(hù)。然后連續(xù)的氨基酸或肽基圖案附著于與支持物結(jié)合的肽物質(zhì)，直至形成目的肽。根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，這些中的大多數(shù)也包括側(cè)鏈保護(hù)。隨著各自連續(xù)的偶聯(lián)，與樹脂結(jié)合的肽物質(zhì)的N-末端處的掩蔽基團(tuán)被去除。其然后與N-末端被掩蔽的下一氨基酸的C-末端反應(yīng)。由此，固相合成的產(chǎn)物是結(jié)合于樹脂支持物的肽。可使用適合實(shí)施固相肽合成的任意類型的支持物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，支持物包括可由下列各項(xiàng)制成的樹脂一種或多種聚合物、共聚物或聚合物的組合，諸如聚酰胺、聚磺酰胺、置換的聚乙烯、聚乙二醇，酚醛樹脂、多糖或聚苯乙烯。聚合物支持物也可以是對(duì)肽合成中使用的溶劑充分地不溶和惰性的任意固體。固體支持物典型地包括連接結(jié)構(gòu)部分，在合成期間正在生長(zhǎng)的肽與其偶聯(lián)，并且其在所需的條件下可被裂解以從支持物上釋放肽。合適的固體支持物可具有連接體，該連接體是可光裂解的(photo-cleavable)、可TFA裂解的(TFA-cleavable)、可HF裂解的(HF_cleavabIe)、可氟離子裂解的(fluorideion-cleavable)、可還原裂解的(reductively-cleavable)；可Pd(O)-裂解的(Pd(O)-CleavabIe)；可親核裂解的(nucleophilically-cleavable)；或可自由基裂解的(radically-cleavable)。優(yōu)選的連接結(jié)構(gòu)部分是可在這樣的條件下裂解的，所述條件是裂解的肽的側(cè)鏈基團(tuán)仍然基本上被完全保護(hù)。在一個(gè)優(yōu)選的合成方法中，肽中間片段在包括三苯甲基的酸敏固體支持物上合成，和更優(yōu)選地在包括具有懸垂氯基團(tuán)(pendentchlorinegroup)的三苯甲基的樹脂例如，2-氯三苯甲基氯(2-CTC)樹脂(Barlos等人，(1989)TetrahedronLetters(四面體快報(bào))30(30)=3943-3946)上合成。實(shí)例還包括三苯甲基氯樹脂、4-甲基三苯甲基氯樹脂、4-甲氧基三苯甲基氯樹脂、4-氨基丁-1-醇2-氯三苯甲基樹脂、4-氨基甲基苯甲酰2-氯三苯甲基樹脂、3-氨基丙-1-醇2-氯三苯甲基樹脂、溴乙酸2-氯三苯甲基樹脂、氰基乙酸2_氯三苯甲基樹脂、4-氰基苯甲酸2-氯三苯甲基樹脂、glicinol2-氯三苯甲基樹脂、丙酸2-氯三苯甲基樹脂、乙二醇2-氯三苯甲基樹脂、N-Fmoc羥胺2-氯三苯甲基樹脂、胼2-氯三苯甲基樹脂。一些優(yōu)選的固體支持物包括聚苯乙烯，其可與二乙烯基苯共聚合以形成其上錨定有反應(yīng)性基團(tuán)的支持物材料。在固相合成中使用的其他樹脂包括“Wang”樹脂，其包括帶有4-羥甲基苯氧基甲基錨定基團(tuán)(anchoringgroup)的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物(Wang，S.S.1973，J.Am.Chem.Soc.(美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志))，以及4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂(Richter等人，(1994)，TetrahedronLetters(四面體快報(bào))35(27):4705_4706)。Wang樹脂、2-氯三苯甲基氯樹脂和4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂可購自，例如，Calbiochem-NovabiochemCorp.,圣地亞哥,加利福尼亞。為了制備用于固相合成的樹脂，樹脂可在適當(dāng)?shù)娜軇┲蓄A(yù)洗。例如，將諸如2-CTC樹脂的固相樹脂加入至肽室內(nèi)并且用適當(dāng)?shù)娜軇╊A(yù)洗。預(yù)洗溶劑可基于偶聯(lián)反應(yīng)中使用的溶劑(或溶劑的混合物)類型來選擇，或反之亦然。適合用于洗滌，并且也適合隨后的偶聯(lián)反應(yīng)的溶劑包括二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、二甲基甲酰胺(DMF)等，以及這些試劑的混合物。其他有用的溶劑包括DMS0、吡啶、氯仿、二噁烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮及其混合物。一些情況下，偶聯(lián)可在二元溶劑體系，諸如體積比范圍為91-19，更常見地41-14的DMF和DCM的混合物中進(jìn)行。除非另外注明，本發(fā)明的合成優(yōu)選地在合適的保護(hù)基團(tuán)的存在下進(jìn)行。保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)和應(yīng)用在本領(lǐng)域中是公知的。通常，適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)是可有助于防止其附著的原子或結(jié)構(gòu)部分，例如，氧或氮，在加工和合成期間參與不需要的反應(yīng)的任意類型的基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)包括側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和氨基或N-末端保護(hù)基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)也可防止羧酸、硫醇等的反應(yīng)或結(jié)合?！皞?cè)鏈保護(hù)基團(tuán)”指與氨基酸的側(cè)鏈(S卩，氨基酸通SH2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分，其有助于防止側(cè)鏈的一部分與肽合成、加工等的步驟中使用的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的選擇可取決于多種因素，例如，進(jìn)行的合成的類型，肽將要進(jìn)行的加工，以及所需的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)也取決于氨基酸本身的性質(zhì)。通常，選擇在固相合成期間的α-氨基脫保護(hù)期間不被去除的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。因此，α-氨基保護(hù)基團(tuán)和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)典型地是不相同的。在一些情況下，并且根據(jù)固相合成和其他肽加工中使用的試劑的類型，氨基酸可以不需要側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的存在。這些氨基酸典型地在側(cè)鏈中不包括反應(yīng)性的氧、氮、或其他反應(yīng)性結(jié)構(gòu)部分。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括乙?；?Ac)、苯甲酰基(Bz)、叔-丁基(tBu)、三苯基甲基(三苯甲基)、四氫吡喃基、芐醚(Bzl)和2，6_二氯芐基(DCB)、叔-丁氧羰基(Boc)、4-硝基苯磺?；?Ns)、對(duì)-甲苯磺?；?Tos)、五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)、金剛烷氧羰基(adamantyloxycarbonyl)、咕噸基(xanthyl)(Xan)、芐基、2，6_二氯芐基、甲酯、乙酯和叔-丁酯(OtBu)、芐氧羰基(Z)、2_氯芐氧羰基(2-C1-Z)、叔-戊氧基羰基(t-amyloxycarbonyl)(Aoc)，以及芳香族或脂族氨基甲酸乙酯(urethan-)型保護(hù)基團(tuán)，光不穩(wěn)定基團(tuán)(photolabilegroup)諸如硝基藜聲氧羰基(nitroveratryloxycarbonyl)(NVOC)；以及氟化物不穩(wěn)定基團(tuán)(fluoridelabilegroup)諸如三甲基甲硅氧基羰基(trimethylsilyloxycarbonyl)(TEOC)。優(yōu)選的側(cè)鏈基團(tuán)為叔-丁基(tBu)、三苯基甲基(三苯甲基)、叔-丁氧羰基(Boc)、對(duì)-甲苯磺?；?Tos)、五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、叔-丁酯(OtBu)和芐氧羰基(Z)。對(duì)于在本發(fā)明的實(shí)施中普遍用于合成艾塞那肽的氨基酸，優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)顯示在下面的表A中表A氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基tfAla無Arg無或pbf*Asp叔-丁酯(OtBu)~Gln三苯甲基(trt)GluOtBuGly1His三苯甲基(trt)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*pbf指五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?。保護(hù)的氨基酸為N-a-Fmoc-NG-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-L-精氨酸，并且具有下式<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>“氨基末端保護(hù)基團(tuán)”包括與氨基酸的α氨基偶聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分。典型地，在添加待加入至正在生長(zhǎng)的肽鏈的下一個(gè)氨基酸之前，氨基末端保護(hù)基團(tuán)在脫保護(hù)反應(yīng)中被去除，但當(dāng)肽從支持物上被裂解時(shí)其可以維持。氨基末端保護(hù)基團(tuán)的選擇可取決于多種因素，例如，進(jìn)行的合成的類型和所需的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物。氨基末端保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括⑴酰基型保護(hù)基團(tuán)，諸如甲?；⑾┍；?Acr)、苯甲?；?Bz)和乙?；?Ac)；(2)芳香族氨基甲酸乙酯型保護(hù)基團(tuán)，諸如芐氧羰基(Z)和置換的Z，諸如對(duì)-氯芐氧羰基、對(duì)_硝基芐氧羰基、對(duì)_溴芐氧羰基、對(duì)_甲氧基芐氧羰基；(3)脂族保護(hù)基團(tuán)諸如叔-丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧基羰基、乙氧羰基、烯丙氧羰基；(4)環(huán)烷基氨基甲酸乙酯型保護(hù)基團(tuán)諸如9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、環(huán)戊氧羰基、金剛烷氧羰基和環(huán)己氧羰基；(5)硫代氨基甲酸乙酯型(thiourethan-type)保護(hù)基團(tuán)，諸如苯基硫代羰基。優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、2-(4-聯(lián)苯基)_丙基(2)氧羰基(Bpoc)、2-苯基丙基(2)-氧羰基(Poc)和叔-丁氧羰基(Boc)。Fmoc或Fmoc樣化學(xué)性質(zhì)是對(duì)固相肽合成高度優(yōu)選的，因?yàn)榱呀馓幱趧e保護(hù)狀態(tài)的所得肽是使用溫和的酸性裂解劑相對(duì)簡(jiǎn)單地來進(jìn)行的。就所得的副產(chǎn)物、雜質(zhì)等而言，此類裂解反應(yīng)是相對(duì)干凈的，使其在技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上適宜從溶脹和縮水洗滌物(swellingandshrinkingwashes)中大規(guī)?；厥针模瑥亩岣弋a(chǎn)率。如本文中所使用的，關(guān)于肽合成的“大規(guī)?！蓖ǔ０ㄔ谥辽?00g/批次，更優(yōu)選至少2kg/批次范圍內(nèi)的肽合成。大規(guī)模合成典型地在大型反應(yīng)容器諸如鋼反應(yīng)容器中進(jìn)行，所述容器可容納大量的試劑諸如樹脂、溶劑、氨基酸、用于偶聯(lián)和脫保護(hù)反應(yīng)的化學(xué)品，其尺寸允許生產(chǎn)處于千克至公噸范圍內(nèi)的肽。另外，F(xiàn)moc保護(hù)基團(tuán)，相對(duì)于側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，可選擇性地與肽裂開，使得當(dāng)Fmoc被裂解時(shí)側(cè)鏈保護(hù)仍然保留在適當(dāng)?shù)奈恢?。此種選擇性在氨基酸偶聯(lián)期間對(duì)最小化側(cè)鏈反應(yīng)非常重要。另外，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，相對(duì)于Fmoc，可被選擇性裂解以被除去，使Fmoc保持在適當(dāng)?shù)奈恢?。在下面進(jìn)一步描述的純化方案過程中有利地依賴后一種選擇性。固相偶聯(lián)反應(yīng)可在一種或多種增強(qiáng)或改善偶聯(lián)反應(yīng)的化合物的存在下進(jìn)行?？稍黾臃磻?yīng)速率并減少副反應(yīng)速率的化合物包括鱗和脲鹽，它們可在叔堿例如二異丙基乙胺(DIEA)和三乙胺(TEA)的存在下，將被保護(hù)的氨基酸轉(zhuǎn)化為活化的種類(例如，B0P、PyBOPO,HBTU和TBTU都生成HOBt酯)。其他試劑通過提供保護(hù)試劑而有助于防止外消旋化。這些試劑包括帶有加成的輔助親核體(例如，1-羥基_苯并三唑(HOBt)，1-羥基-氮雜苯并三唑(HOAt)或HOSu)的碳二亞胺(例如，DCC或WS⑶I)。還可采用利用帶有或不帶有加成的輔助親核體的氯甲酸異丁酯的混合酐法，同樣可以采用氮化物法，這歸因于與其相關(guān)的低外消旋化。這些類型的化合物還可增加碳二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)速率，以及防止Asn和Gln殘基的脫水。在確定偶聯(lián)完成后，偶聯(lián)反應(yīng)混合物用溶劑洗滌，并且對(duì)肽物質(zhì)隨后的各個(gè)氨基酸殘基重復(fù)偶聯(lián)循環(huán)。為了偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸，典型地通過用試劑處理來實(shí)現(xiàn)從樹脂結(jié)合物質(zhì)上去除N-末端保護(hù)基團(tuán)(例如，F(xiàn)moc基團(tuán))，所述試劑包括處于諸如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)的溶劑中的20-50%哌啶(基于重量)。去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，典型地進(jìn)行數(shù)次洗滌以去除殘余的哌啶和Fmoc副產(chǎn)物(諸如二苯并富烯及其哌啶加合物)。隨后的氨基酸可以以相對(duì)于樹脂支持物上肽物質(zhì)的負(fù)荷系數(shù)(loadingfactor)的化學(xué)計(jì)量過量的氨基酸來使用。通常在偶聯(lián)步驟中使用的氨基酸的量至少等于樹脂上第一氨基酸的負(fù)荷系數(shù)(1倍等價(jià)(equivalent)或更大)。優(yōu)選地，在偶聯(lián)步驟中使用的氨基酸的量為至少1.3倍等價(jià)的(0.3倍超過量)或更大，并且最優(yōu)選地約1.5倍等價(jià)的(0.5倍超過量)或更大。在一些情況下，例如，偶聯(lián)步驟采用1-3倍范圍內(nèi)的等價(jià)量的氨基酸。在最終的偶聯(lián)循環(huán)后，用溶劑諸如NMP洗滌樹脂，然后使用惰性第二溶劑諸如DCM來洗滌。為了從樹脂去除已合成的肽物質(zhì)，以下列的方式進(jìn)行裂解處理，即使得被裂解的肽物質(zhì)仍然帶有足夠的側(cè)鏈和末端保護(hù)基團(tuán)。保持保護(hù)基團(tuán)在合適的位置有助于在樹脂裂解期間或之后防止肽片段的不需要的偶聯(lián)或其他不需要的反應(yīng)。在用Fmoc或類似的化學(xué)來合成肽的情況下，可以任意所需的方式來實(shí)現(xiàn)保護(hù)的裂解，諸如通過使用相對(duì)弱酸試劑諸如乙酸或在溶劑諸如DCM中的稀釋TFA。典型地使用在DCM中的0.5-10重量％，優(yōu)選1_3重量％TFA0參見，例如，美國專利號(hào)6，281，335。從固相樹脂中裂解肽中間片段的步驟可沿著如下示例性的工藝路線來繼續(xù)進(jìn)行。然而，可使用有效地從樹脂中裂解肽中間片段的任意適當(dāng)?shù)墓に嚒＠?，約5-20，優(yōu)選約10體積的含酸性裂解劑的溶劑加入到裝有樹脂結(jié)合肽物質(zhì)的容器中。結(jié)果，樹脂典型地以珠子形式浸沒在試劑中。當(dāng)在適當(dāng)?shù)臏囟认聦⒁后w內(nèi)容物攪動(dòng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段時(shí)發(fā)生裂解反應(yīng)。攪動(dòng)有助于防止珠子凝集。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和溫度條件將取決于一些因素諸如要使用的酸試劑，肽的性質(zhì)，樹脂的性質(zhì)等。作為一般的原則，在約_15°C-約5°C，優(yōu)選約-10°C-約0°C下攪拌約5分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選地約25分鐘-約45分鐘將是合適的。裂解時(shí)間可在約10分鐘-約2小時(shí)或甚至多至一天的范圍內(nèi)。期望裂解在此冷溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，以提供可在反應(yīng)期間典型地發(fā)生的反應(yīng)放熱曲線。另外，裂解反應(yīng)的較低溫度防止酸敏側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，諸如trt基團(tuán)在此階段被去除。在裂解處理結(jié)束時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。這可例如，通過將裂解劑和適當(dāng)?shù)膲A諸如吡啶等混合，并且繼續(xù)攪動(dòng)和攪拌一段額外的時(shí)間，諸如額外的5分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選地約20分鐘-約40分鐘來完成。堿的加入和繼續(xù)的攪動(dòng)導(dǎo)致容器內(nèi)容物的溫度增加。在攪動(dòng)結(jié)束時(shí)，容器內(nèi)容物可處在約0°C-約15°C，優(yōu)選地約5°C-約10°C的溫度范圍內(nèi)。在總合成工藝中可任選地加入一些因素，諸如使樹脂溶脹和縮水以便改善肽回收的多個(gè)方面。這些技術(shù)描述在，例如，美國專利公開號(hào)2005/0164912A1中。在一些方面，可制備裂解的肽片段，以用于與其他肽片段和/或氨基酸的溶液相偶聯(lián)。溶液相中的肽偶聯(lián)反應(yīng)的綜述見，例如，NewTrendsinPeptideCouplingReagents(f^K^O^irM^)；Albericio,Fernando；Chinchilla,Rafeal；Dodsworth,DavidJ.；禾口Najera,Armen；OrganicPreparationsandProceduresInternational(國際有機(jī)物制備與程序)(2003)，33(3)，203-303.肽片段優(yōu)選地在采用溶液相偶聯(lián)之前被分離。例如，根據(jù)適用于片段(12)的一個(gè)說明性的分離策略，片段(12)用水提取一次或多次。如果出現(xiàn)乳液，則本發(fā)明采用鹽水溶液。說明性的鹽水溶液是飽和NaCl溶液，需要被過濾以去除固體。鹽水溶液有助于分解乳液，并在DCM和水相之間提供更好的分離層?？墒褂梅刺崛磔o助獲得較高的產(chǎn)率。使用蒸餾來減少二氯甲烷，所述二氯甲烷用于從樹脂裂解和至少一些后繼的洗滌和隨后的庚烷添加，以便沉淀作為固體的產(chǎn)物，從而分離。任何剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至小于25體積％。沉淀的片段(12)用庚烷洗滌，并然后在至多35°C的溫度下真空干燥以結(jié)束分離。相反，片段(14)可更容易地乳化。因此，對(duì)于片段(14)的分離不太需要水提取作為初始步驟。而是，說明性的分離策略首先通過蒸餾減少二氯甲烷(DCM)，然后加入處于水中的25%IPA(異丙醇)，并通過蒸餾進(jìn)一步減少剩余的二氯甲烷至小于25體積％。分離沉淀的片段(14)，用25%IPA/水洗滌，然后在至多35°C的溫度下真空干燥。片段(16)的分離類似于片段(12)的分離，因?yàn)楫?dāng)在水中提取時(shí)通常不形成片段(16)的乳液。因此，對(duì)于片段(16)，可以遵從上面關(guān)于片段(12)確定的分離方案。肽中間片段與其他片段或氨基酸在溶液相中的偶聯(lián)可使用原位偶聯(lián)劑來進(jìn)行，所述原位偶聯(lián)劑例如為B0P，6-氯-1-羥基苯并三唑(6-C1-H0BT)、o_(苯并三唑-1-基)-N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、HATU、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、水溶性碳二亞胺(WS⑶I)或O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)。其他偶聯(lián)技術(shù)使用預(yù)先形成的活性酯諸如諸如羥基琥珀酰亞胺酯(HOSu)和對(duì)硝基苯酚(HONp)酯；預(yù)先形成的對(duì)稱的酐；非對(duì)稱酐諸如N-羧酸酐(N-carboxyanhydrides)(NCAs)；或酸性鹵化物諸如?；约磅；?。在溶液相偶聯(lián)反應(yīng)中可使用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)溶劑。理解所用偶聯(lián)溶劑可影響形成的肽鍵的外消旋化作用；肽和/或肽片段的溶解性；以及偶聯(lián)反應(yīng)速率。在一些實(shí)施方案中，偶聯(lián)溶劑包括一種或多種水_易混溶性試劑。水_易混溶性試劑的例子包括，例如，DMSOJtt啶、氯仿、二噁烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二噁烷或其混合物。在其他的實(shí)施方案中，偶聯(lián)反應(yīng)可包括一種或多種非水_易混溶性試劑。示例性的非水_易混溶性溶劑是二氯甲烷。在這些實(shí)施方案中，非水_易混溶性溶劑優(yōu)選地與脫保護(hù)反應(yīng)相容；例如，如果優(yōu)選使用非水_易混溶性溶劑，則其不會(huì)有害地影響脫保護(hù)反應(yīng)。在形成肽(11)后，產(chǎn)物可進(jìn)行脫保護(hù)，層析純化、凍干和/或沉淀，進(jìn)一步加工(例如，與另一肽反應(yīng)以形成融合蛋白)；這些工藝的組合，和/或類似工藝，如果需要。例如，根據(jù)本發(fā)明，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和一些末端保護(hù)基團(tuán)典型地在整個(gè)固相合成期間保留在肽中間片段上，并且也進(jìn)入并貫穿溶液相偶聯(lián)反應(yīng)。通常，在溶液相偶聯(lián)步驟完成后，可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)脫保護(hù)步驟以從肽上去除一個(gè)或多個(gè)保護(hù)基團(tuán)。通過全面脫保護(hù)(globaldeprotection)去除保護(hù)基團(tuán)典型地采用脫保護(hù)溶液，該脫保護(hù)溶液包括酸解劑(acidolyticagent)以裂解側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。為了全面脫保護(hù)普遍使用的酸解劑包括純?nèi)宜?TFA)、HC1、路易斯酸諸如BF3Et2O或Me3SiBr、液態(tài)氫氟酸(HF)、溴化氫(HBr)，三氟甲磺酸及其組合。脫保護(hù)溶液還包括一種或多種適當(dāng)?shù)年栯x子清除劑，例如，二硫蘇糖醇、茴香醚、對(duì)甲酚、乙二硫醇或二甲硫。脫保護(hù)溶液還可包括水。如在此使用的，在脫保護(hù)組合物中存在的試劑量典型地以比率來表示，其中單個(gè)組分的量表示為以“份”計(jì)的分子(numerator)，諸如“份重量”或“份體積”，并且分母是組合物的總份數(shù)。例如，含有9055(重量/重量/重量)的TFAH2ODTT的脫保護(hù)溶液具有90/100重量份的TFA，5/100重量份的H2O以及5/100重量份的DTT。在一些實(shí)施方案中，可進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，其中酸解劑優(yōu)選TFA在脫保護(hù)組合物中的量大于90/100重量份。其他優(yōu)選的脫保護(hù)組合物包括的酸解劑的量為93/100重量份或更大，或在93/100重量份-95/100重量份的范圍內(nèi)。粗固體沉淀物可以多種方式純化。根據(jù)一個(gè)說明性的策略，將粗肽溶解在緩沖液中，并通過反相層析純化。層析片段用水稀釋，并然后在反相層析介質(zhì)中濃縮。層析后，可使用一種或多種策略分離肽。根據(jù)一種策略，可使用常規(guī)的凍干策略。備選地，可使用沉淀策略來分離肽。沉淀作用是特別有利的。首先，沉淀作用比凍干更為經(jīng)濟(jì)，并且更易于以商業(yè)規(guī)模應(yīng)用。此外，鑒于凍干提供很少，如果存在任何，進(jìn)一步提高肽的純度的機(jī)會(huì)，沉淀作用能提高肽純度，因?yàn)辂}和其他可溶性純凈物保留在溶液中。鹽尤其容易地被洗掉。沉淀作用提供具有非常低的殘余鹽含量的純化肽。典型的層析純化提供處于包括水和乙腈作為主要組分的液體介質(zhì)中的肽。此外，往往還存在TFA抗衡離子。為了實(shí)現(xiàn)沉淀，需要轉(zhuǎn)換抗衡離子乙酸根、檸檬酸根、琥珀酸根、有機(jī)羧酸根和/或類似物，以用于制劑配制。此種轉(zhuǎn)換很容易地使用反相柱或離子交換介質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。此類柱也傾向于濃縮肽并將溶劑體系改變?yōu)檫m合肽分離的一種或多種溶劑體系。典型的所得溶劑為約4-約8重量份的乙醇比1重量份的水。在此轉(zhuǎn)換后，單獨(dú)使用乙醇或結(jié)合其他醇類或有機(jī)溶劑諸如乙酸乙酯沉淀來自層析的洗脫餾分。沉淀物過濾，然后用乙醇洗滌并干燥，包裝，儲(chǔ)存，進(jìn)一步加工和/或另外進(jìn)行處理。在一段時(shí)間諸如約10-約50分鐘內(nèi)加入無水，純或變性乙醇。此添加在受控溫度下諸如在-10°c至-20°c范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行并混合/攪動(dòng)，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)這產(chǎn)生具有較好過濾特征的肽?，F(xiàn)在將參考下列說明性的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的原理。在下列實(shí)施例中，除非另外特意地說明，所有百分?jǐn)?shù)和比值均以體積計(jì)。實(shí)施例1-在N-末端處H有Fmoc{呆護(hù)的片段(12),^MMWt(1_17)0H的固相合成A.制備Fmoc-H-Glu-負(fù)載的2CTC樹脂F(xiàn)moc-H-Glu-負(fù)載的2CTC樹脂與二氯甲烷混合以便溶脹樹脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(S卩，10克樹脂在60mlDMF中)。B.在N-末端處具有Fmoc保護(hù)的片段(12)(AA1-170H)的固相肽合成1.氨基酸偶聯(lián)負(fù)載在H-Glu-樹脂上的下一氨基酸為Fmoc-L-Glu(tBu)OH0過量的被保護(hù)的氨基酸(例如，1.7-2.O倍等價(jià)量)、過量的N-羥基苯并三唑(Η0ΒΤ，例如，1.7-2.O倍等價(jià)量)和過量的二異丙基乙胺(DIEA，例如，1.9-2.2倍等價(jià)量)在DMF中組合并冷卻至彡5°C。得到的溶液與過量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，例如，1.7-2.O倍等價(jià)量)的DMF溶液組合。此活化的氨基酸溶液與樹脂組合，然后用二氯甲烷沖洗。混懸液在<25°C下攪拌直至獲得陰性茚三酮測(cè)試(如下面所提供的)(典型地在3小時(shí)內(nèi))。茚三酮測(cè)試<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>2.從樹脂裂解Fmoc和側(cè)鏈保護(hù)的片段通過用處于DMF溶液中的哌啶(典型地5-20%)的處理來去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。將溶液排出，并用DMF洗滌樹脂以減少殘余的哌啶。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)氨基酸偶聯(lián)和Fmoc去除的循環(huán)。所有假脯氨酸偶聯(lián)物均不含H0BT。下列被保護(hù)的氨基酸是以所示的次序?yàn)榇似闻悸?lián)的那些氨基酸Fmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-MetOHFmoc-L-Gln(trt)OHFmoc-L-Lys(Boc)OHFmoc-L-Leu-Ser(假脯氨酸)Fmoc-L-Asp(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Phe-Thr(假脯氨酸)Fmoc-L-Thr(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-His(trt)OH在最終的偶聯(lián)后，用DMF洗滌樹脂得到結(jié)合樹脂的Fmoc-保護(hù)的艾塞那肽(1_17)片段，其可用符號(hào)FmocAAl-17-樹脂表示，其具有假脯氨酸置換，如上面列舉的氨基酸中所7J\ο使用在二氯甲烷中稀釋的(例如，1%)三氟乙酸(TFA)從樹脂上裂解結(jié)合樹脂的FAA1-170H彡llOmin。然后加入吡啶以中和TFA。去除液體并用二氯甲烷洗滌樹脂?？赏ㄟ^另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液處理及然后用吡啶處理而重復(fù)樹脂_裂解，且所得溶液與第一次裂解溶液組合。3.FmocAAl-70H的沉淀FmocAA1-17OH用水提取3次。有時(shí)觀察到乳液。在此情況下，如果出現(xiàn)乳液，則使用鹽水溶液(即，飽和NaCl水溶液)來代替純水提取液。使用反提取(向水性提取物的收集液中加入DCM)以有助于確保良好的產(chǎn)率。通過蒸餾減少二氯甲烷。然后加入庚烷作為抗溶劑以沉淀肽產(chǎn)物。備選地，產(chǎn)物的DCM溶液可加入至庚烷中以引起沉淀。所需的添加次序通過評(píng)價(jià)沉淀物的性質(zhì)，即，過濾性，來經(jīng)驗(yàn)性地確定。剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%。分離沉淀的FAA1-170H，用庚烷洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例2-在N-末端處具有Fmoc保護(hù)的片段(14),艾塞那肽(18_26)OH的固相合成A.制備Fmoc-H-Leu-負(fù)載的2CTC樹脂F(xiàn)moc-H-Leu-負(fù)載的2CTC樹脂與二氯甲烷組合以便溶脹樹脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(S卩，10克樹脂在60mlDMF中)。B.固相肽合成1.氨基酸偶聯(lián)負(fù)載在樹脂上的下一氨基酸為Fmoc-Trp(Boc)OH0過量的被保護(hù)的氨基酸(例如，1.5倍等價(jià)量)、過量的N-羥基苯并三唑(H0BT，例如，1.5倍等價(jià)量)和過量的二異丙基乙胺(DIEA，例如，1.7倍等價(jià)量)在DMF中組合并冷卻至彡5°C。得到的溶液與過量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，例如，1.5倍等價(jià)量)的DMF溶液混合。此活化的氨基酸溶液與樹脂混合，然后用二氯甲烷沖洗?；鞈乙涸?lt;25°C下攪拌直至獲得陰性茚三酮測(cè)試(如上所述)(典型地3小時(shí))。2.Fmoc去除通過用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液處理去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。將溶液排出，并用DMF洗滌樹脂以減少殘余的哌啶。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)氨基酸偶聯(lián)和Fmoc去除的循環(huán)。下列被保護(hù)的氨基酸是以所示的次序?yàn)榇似闻悸?lián)的那些氨基酸Fmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-IleOHFmoc-L-PheOHFmoc-L-LeuOHFmoc-L-Arg(pbf)OHFmoc-L-ValOHFmoc-L-AlaOH在最終的偶聯(lián)后，用DMF洗滌樹脂得到Fmoc-保護(hù)的結(jié)合樹脂的艾塞那肽(18-26)片段，其可通過符號(hào)FmocAA18-26-樹脂來標(biāo)識(shí)。3.從樹脂的裂解使用在二氯甲烷中稀釋的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)從樹脂上裂解結(jié)合樹脂的FmocAA18-260H彡IlOmin。然后加入吡啶以中和TFA。去除液體并用二氯甲烷洗滌樹脂?？赏ㄟ^另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液處理及然后用吡啶處理而重復(fù)樹脂_裂解，。4.FmocAA18-260H的沉淀FmocAA18-260H可很容易乳化。因此，不推薦水提取。而是，通過蒸餾將二氯甲烷減少至初始體積的<50%，加入處于水中的25%IPA(異丙醇)，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<10vol%。分離沉淀的FAA18-260H，用25%IPA/水洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例3-在N-末端處具有Fmoc保護(hù)的片段(16),艾塞那肽(27_38)OH的固相合成A.制備Fmoc-H-L-Pro負(fù)載的2CTC樹脂H-L-Pro樹脂(2_C1_三苯甲基)與二氯甲烷組合以便溶脹樹脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(S卩，10克樹脂在60mlDMF中)。B.固相肽合成1.氨基酸偶聯(lián)序列中的下一氨基酸Fmoc-L-Pro-OH、過量的被保護(hù)的氨基酸(例如，1.5倍等價(jià)量)、過量的N-羥基苯并三唑(Η0ΒΤ，例如，1.5倍等價(jià)量)和過量的二異丙基乙胺(DIEA，例如，1.7倍等價(jià)量)在DMF中組合并冷卻至彡5°C。得到的溶液與過量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，例如，1.5倍等價(jià)量)的DMF溶液組合。此活化的氨基酸溶液與樹脂組合，然后用二氯甲烷沖洗?；鞈乙涸?lt;25°C下攪拌直至獲得陰性茚三酮測(cè)試(如上面實(shí)施例1中所提供的)(典型地3小時(shí))。2.Fmoc去除通過用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液處理去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。優(yōu)選的步驟添加仲胺(哌嗪+HOBT(BP,5克哌嗪+1.5gHOBT/lOOmlDMF)，特別是在第二次和第三次Fmoc去除步驟之后)。將溶液排出，并用DMF洗滌樹脂以減少殘余的piperizine。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)氨基酸偶聯(lián)和Fmoc去除的循環(huán)。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)該循環(huán)。下列被保護(hù)的氨基酸是以所示的次序?yàn)榇似闻悸?lián)的那些氨基酸Fmoc-L-ProOHFmoc-L-AlaOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-ProOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Asn(trt)OHFmoc-L-Lys(Boc)OH在最終的偶聯(lián)后，用DMF洗滌樹脂，由此得到Fmoc-保護(hù)的結(jié)合樹脂的艾塞那肽(27-38)片段，其可通過符號(hào)FmocAA27-38-樹脂來標(biāo)識(shí)。3.從樹脂的裂解使用在二氯甲烷中稀釋的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)從樹脂上裂解結(jié)合樹脂的FmocAA27-380H彡IlOmin。加入吡啶以中和TFA。去除溶液并用二氯乙烷洗滌樹脂。可通過另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液處理及然后用吡啶處理而重復(fù)樹脂_裂解，。4.FmocAA27-380H的沉淀FmocAA27-380H用水提取3次。如果觀察到乳液，則推薦鹽水溶液，如前所述。使用利用DCM的反提取，以有助于確保良好的產(chǎn)率。通過蒸餾減少二氯甲烷，加入庚烷并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%。分離沉淀的FAA27-38，用庚烷洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例4-溶液相肽合成向片段(16)添加絲氨酸上面實(shí)施例3中制備的片段16可通過加入(1.2倍等價(jià)量)，過量的6_氯羥基苯并三唑(6-C1-H0BT；例如，1.2-1.4倍等價(jià)量)，L_絲氨酸(tBu)酰胺(例如，1-1.2倍等價(jià)量)和DMF使絲氨酸酰胺附著于其上。溶液冷卻至彡5°C并與過量的DIEA(例如，2.0倍等價(jià)量)和HBTU(例如，1.25倍等價(jià)量)組合。所得溶液保持在<0°C，直至反應(yīng)完成(即，彡FmocAA27-380H，例如通過HPLC)。然后去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。在一種方法中，將哌啶或哌嗪結(jié)合的樹脂加入至反應(yīng)混合物中，并且該溶液在<0°C下攪拌直至完成(即，彡FmocAA27-39NH2，例如通過HPLC)。在另一方法中，胺堿(例如，單乙醇胺、二甲胺、二丙胺、三乙胺)加入至反應(yīng)混合物中，并使該溶液在下攪拌直至完成(即，<FmocAA27-39NH2，例如通過HPLC)。二氯甲烷溶液用磷酸鹽緩沖液(典型地pH8-9)洗滌。二氯甲烷通過蒸餾減少。裂解溶液用水提取，然后用MTBE沉淀至圓底燒瓶中。備選地，可將肽的DCM溶液加入至MTBE中以沉淀肽。所需次序可通過評(píng)價(jià)使用各方法形成的沉淀物的特性來經(jīng)驗(yàn)性地確定。剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%(例如，通過GC)。分離沉淀的HAA27-39NH2，用MTBE洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。(N-末端處的H參考該處的胺功能性。C-末端處的NH2參考該處的酰胺功能性。)實(shí)施例5-溶液相肽合成制備艾塞那肽(18-39)MU片段22)(C-末端處的NH2參考酰胺功能件)H-AA(27-39)NH2(1.25倍等價(jià)量)、Fmoc-AA(18-26)OH(1倍等價(jià)量)和過量的6-Cl-H0BT(例如，1.2-1.4倍等價(jià)量)溶解在DCM和DMF(191)中，并且所得溶液冷卻至彡25°C。該混合物與過量的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)(4倍等價(jià)量)在DMF中組合。所得溶液保持在彡25°C，直至反應(yīng)完成(8卩，彡總Fmoc-AA(18-26)0H，例如通過HPLC)。如果需要，可另外地投入原料和/或試劑。哌啶或哌嗪結(jié)合的樹脂與該混合物組合，以去除Fmoc基團(tuán)(g卩，彡1%Fmoc-AA(18-39)NH2；例如通過HPLC)。當(dāng)完成時(shí)，該混合物與水在彡25°C下組合。將如前所述的鹽水溶液加入到DCM溶液中，然后進(jìn)行4次水提取。該溶液汽提干燥，并將DCM加回。通過蒸餾減少二氯甲烷。然后，加入甲基叔-丁醚(MTBE)或向MTBE中加入DCM以沉淀肽，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%(例如，通過GC)。分離沉淀的HAA18-39NH2，用MTBE洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例6-艾塞那肽(1-39)NHJ片段11)(被完全保護(hù)的)的溶液相肽合成處于DCM中的片段22(艾塞那肽(18_39)NH2)(1倍等價(jià)量)、片段12(如上所制備的艾塞那肽(1-17))(1倍等價(jià)量)、過量的6-Cl-H0BT(例如，1.4-2倍等價(jià)量)與過量的EDAC(例如，3-4倍等價(jià)量)在彡0°C下組合。攪拌反應(yīng)混合物直至反應(yīng)完成(即，彡1.0%AA1-170H和彡1.5%HAA18_39NH2，例如，通過HPLC)。加入哌啶或哌嗪結(jié)合的樹脂，以在彡25°C下在2小時(shí)期間內(nèi)從AAF1-39NH2去除fmoc。反應(yīng)物冷卻至15°C。反應(yīng)用水淬滅，并溶解在DCM中。然后對(duì)其進(jìn)行水提取4次并汽提至干燥。任選地，可顛倒水提取和FMOC去除步驟。AAH1-39NH2溶解在DCM中。實(shí)施例7-全面脫保護(hù)AAl-39Mi為艾塞那肽來自前面實(shí)施例的二氯甲烷溶液與三氟乙酸、水和二硫蘇糖醇(例如，1/0.08/0.012wt%)組合?；旌衔镌卺?4°C下攪拌至多3小時(shí)，然后冷卻至彡0°C?；旌衔锉３衷诘?dú)庵?。逐滴加入冷MTBE以從反應(yīng)混合物中沉淀肽。產(chǎn)物漿料在0°C下攪拌lhr。通過過濾分離固體，用MTBE洗滌，并在彡35°C下真空干燥。實(shí)施例8-脫羧IPA，單乙醇胺或，DIEA和乙酸(例如，2811ν/ν/ν)與脫保護(hù)的肽在35°C下預(yù)混并攪拌3hr。反應(yīng)物在0°C下冷卻。過濾HAA1-39NH2，用IPA沖洗，并在彡35°C下真空干燥。實(shí)施例9-純化實(shí)施例9描述通過在高pH下使用梯度#1的反相層析純化粗制的全面脫保護(hù)的艾塞那肽。如下面的步驟中所述，在實(shí)施例9中使用下列的裝置四元泵高效液相層析(QuaternarypumpHighPerformanceLiquidChromatography)(HPLC)系統(tǒng)，UV檢測(cè)器禾口餾分收集系統(tǒng)。如下面步驟中所述，在實(shí)施例9中使用下列的試劑HPLC級(jí)乙腈(ACN)、蒸餾水、乙酸銨NH4OAcACS級(jí)，以及氫氧化銨NH4OHACS級(jí)。實(shí)施例9的步驟描述如下步驟1.如下制備流動(dòng)相A和B流動(dòng)相A通過將4gNH4OAc和2mLNH4OH混合到1700mLH2O中來制備。進(jìn)行混合直至固體溶解?；旌虾?，加入300mLACN。流動(dòng)相B通過將4gNH4OAc和2mLNH4OH混合到500mLH2O中來制備。進(jìn)行混合直至固體溶解?；旌虾螅尤?500mLACN。步驟2.安裝柱并設(shè)定下列的操作參數(shù)層析條件柱KromasilC4IOym2cmx250mm爐環(huán)境流速15.5mL/min檢測(cè)器波長(zhǎng)VWD:280nm注射體積800mg包含的艾塞那肽/50%樣品/50%H2O0如在本說明書中使用的，術(shù)語“粗”指整個(gè)樣品。術(shù)語“包含的”是在整個(gè)樣品中的艾塞那肽的量。例如，如果粗產(chǎn)物為50%純，則每稱量Ig得到0.5g實(shí)際的艾塞那肽。運(yùn)行時(shí)間62分鐘+樣品加樣時(shí)間步驟3-在將樣品加樣至柱中之前將樣品通過5μm疏水PTFE濾器過濾。步驟4-將樣品加樣至柱中。在加樣之前，在初始條件下調(diào)節(jié)柱，直至獲得穩(wěn)定的基線。表9-梯度#1<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>運(yùn)行后時(shí)間(Posttime)(再平衡時(shí)間):10min.步驟5.從10.0分鐘至17.5分鐘收集餾分，30-60個(gè)秒切片(secondslices)。步驟6.餾分匯集標(biāo)準(zhǔn)收集和匯集>97.0%面積歸一化(areanormalization)的餾分以分離和沉淀。收集<97.0%面積歸一化的物質(zhì)如下收集在97.0%餾分作為前段(frontends)組合以前收集餾分，且在97.0%餾分作為后段(backends)組合之后收集餾分。然后，如果需要，將前段和后段再層析。實(shí)施例10-純化實(shí)施例10描述通過在低pH下使用梯度#2的反相層析純化粗制的全面脫保護(hù)的艾塞那肽。如下面的步驟中所述，在實(shí)施例10中使用下列的裝置四元泵HPLC系統(tǒng)，UV檢測(cè)器和餾分收集系統(tǒng)。如下面步驟中所述，在實(shí)施例10中使用下列的試劑HPLC級(jí)乙腈(ACN)、蒸餾水和三氟乙酸(TFA)。實(shí)施例10的步驟描述如下步驟1.如下制備流動(dòng)相A和B流動(dòng)相A通過將1802.3gH20,152.OgACN和3.OgTFA/2升流動(dòng)相A(S卩，1800mLH2O,200mLACN,2mLTFA)組合來制備。流動(dòng)相B通過將1005.2gH2CK773.7gACN和3.OgTFA/2升流動(dòng)相B(即，IOOOmLH20，IOOOmLACN禾口2mLTFA)組合來制備。步驟2.安裝柱并設(shè)定下列的操作參數(shù)層析條件柱PhenomenexLunaC18(2)2cmx250mm爐環(huán)境、流速5.OmL/min檢測(cè)器波長(zhǎng)VWD:218nm注射體積lg實(shí)際的粗艾塞那肽/20mLH20(360mg包含的艾塞那肽)運(yùn)行時(shí)間60分鐘+樣品加樣時(shí)間在將樣品加樣至柱中之前將樣品通過5μm疏水性PTFE濾器過濾。步驟3-將樣品加樣至柱中。在加樣之前，在初始條件下調(diào)節(jié)株，直至獲得穩(wěn)定的基線。表10-梯度#2:<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>運(yùn)行后時(shí)間20min.步驟4.從18.5分鐘至43.5分鐘收集餾分，通過峰頂取15個(gè)秒切片，并且在峰的前側(cè)和后側(cè)上取30-60個(gè)秒切片。步驟5.匯集餾分如下為了前段，后段，(85%面積歸一化，且為了在高pH柱上純化，匯集彡85%。實(shí)施例11-純化實(shí)施例11描述通過在低pH下使用梯度#3的反相層析純化粗制的全面脫保護(hù)的艾塞那肽。如下面的步驟中所述，在實(shí)施例11中使用下列的裝置四元泵HPLC系統(tǒng)，UV檢測(cè)器和餾分收集系統(tǒng)。如下面步驟中所述，在實(shí)施例11中使用下列的試劑HPLC級(jí)乙腈(ACN)、蒸餾水、四氫呋喃(THF)、三氟乙酸(TFA)、冰乙酸HPLC，U.S.P.或ACS級(jí)，三水乙酸鈉HPLC，U.S.P.或ACS級(jí)以及L-甲硫氨酸98%+或等價(jià)物。實(shí)施例11的步驟描述如下步驟1.如下制備流動(dòng)相A和B流動(dòng)相A通過將1802.3gH20,152.OgACN和3.OgTFA/2升流動(dòng)相A(即，1800mLH2O,200mLACN,2mLTFA)組合來制備。流動(dòng)相B通過將1005.2gH20,531.4gACN,261.5gTHF和3.OgTFA/2升流動(dòng)相B(即，IOOOmLH20、700mLACN、300mlTHF禾口2mLTFA)組合來制備。注意THF不含過氧化物。過氧化物清除劑溶液制備1.63g三水乙酸鈉、1.49gL-甲硫氨酸和1.08g乙酸加入至IOOOmLH2O中。步驟2.安裝柱并設(shè)定下列的操作參數(shù)層析條件柱Kromasil100-10—C18lcmx250mm爐環(huán)境流速3.6mL/min檢測(cè)器波長(zhǎng)VWD:280nm注射體積IOOmg包含的艾塞那肽/20mL，流動(dòng)相A運(yùn)行時(shí)間50分鐘+樣品加樣時(shí)間步驟3-在將樣品加樣至柱中之前將樣品通過5μm疏水PTFE濾器過濾。步驟4-將樣品加樣至柱中。在加樣之前，在初始條件下調(diào)節(jié)柱，直至獲得穩(wěn)定的基線。表11-梯度#3:時(shí)間流動(dòng)~~~%A~~%BminmL/min初始361000加樣Γθ000.01367003θΓθ~24.03622Γθ780~24.0122Γθ78Γθ~24.10O100.040.036O100.0運(yùn)行后時(shí)間20min.步驟5.從16.0分鐘至22.0分鐘收集餾分，15-30個(gè)秒切片。步驟6.將等體積的清除劑溶液加入至收集的各餾分中，在N2和0_6°C下儲(chǔ)存。步驟7.匯集餾分如下為了前段，后段，(85%面積歸一化，且為了在高pH柱上純化，匯集彡85%。實(shí)施例12-純^實(shí)施例12描述通過在低pH下使用梯度M的反相層析純化粗制的全面脫保護(hù)的艾塞那肽。如下面的步驟中所述，在實(shí)施例12中使用下列的裝置四元泵HPLC系統(tǒng)，UV檢測(cè)器和餾分收集系統(tǒng)。如下面步驟中所述，在實(shí)施例12中使用下列的試劑HPLC級(jí)乙腈(ACN)、蒸餾水和三氟乙酸(TFA)。實(shí)施例12的步驟描述如下步驟1.如下制備流動(dòng)相A和B流動(dòng)相A通過將1802.3gH20,152.OgACN和3.OgTFA/2升流動(dòng)相A(即，1800mLH2O,200mLACN,2mLTFA)組合來制備。流動(dòng)相B通過將1005.2gH20,773.7gACN和3.OgTFA/2升流動(dòng)相B(即，IOOOmLH2O,IOOOmLACN禾口2mLTFA)組合來制備。步驟2.安裝柱并設(shè)定下列的操作參數(shù)層析條件柱Kromasil100-10—C18lcmx250mm爐環(huán)境流速3.6mL/min檢測(cè)器波長(zhǎng)VWD:280nm注射體積IOOmg包含的艾塞那肽/20mL，流動(dòng)相A運(yùn)行時(shí)間60分鐘+樣品加樣時(shí)間步驟3.在將樣品加樣至柱中之前將樣品通過5μm疏水性PTFE濾器過濾。步驟4.將樣品加樣至柱中。在加樣之前，在初始條件下調(diào)節(jié)柱，直至獲得穩(wěn)定的基線。表12-梯度#4時(shí)間~~流動(dòng)~~%A~%BminmL/min初始Γθ1000加樣Γθοο0.01Γθ78Γθ2Ζ0~~IToΓθ227ο78Γθ~~14.013Γθ227ο78Γθ~~14.103ΓθOO100.0~30.0ΓθOO100.0~運(yùn)行后時(shí)間20min.步驟5.從14.0分鐘至24.0分鐘收集餾分，15-30個(gè)秒切片。步驟6.匯集餾分如下為了前段，后段，(85%面積歸一化，且為了在高pH柱上純化，匯集彡85%。實(shí)施例13-艾塞那肽(1-19)的固相肽合成Α.制備Fmoc-L-Val負(fù)載的樹脂F(xiàn)mocL纈氨酸樹脂(2_C1_三苯甲基)(1倍等價(jià)量)與二氯甲烷組合以便溶脹樹月旨，并用N,N二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(即，10克樹脂在60mlDMF中)。B.固相合成l.Fmoc(1-19)的氨基酸偶聯(lián)負(fù)載在H-Val-樹脂上的下一氨基酸為Fmoc-L-Ala0H。過量的被保護(hù)的氨基酸(例如，1.7-2.O倍等價(jià)量)、過量的N-羥基苯并三唑(H0BT，例如，1.7-2.O倍等價(jià)量)和過量的二異丙基乙胺(DIEA，例如，1.9-2.2倍等價(jià)量)在DMF中組合并冷卻至彡5°C。得到的溶液與過量2-(1Η-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，例如，1.7-2.O倍等價(jià)量)的DMF溶液組合。此活化的氨基酸溶液與樹脂組合，然后用二氯甲烷沖洗。混懸液在<25°C下攪拌直至獲得陰性茚三酮測(cè)試(如上所述)(典型地3小時(shí))。2.Fmoc去除通過用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液處理去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。將溶液排出，并用DMF洗滌樹脂以減少殘余的哌啶。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)氨基酸偶聯(lián)和Fmoc去除的循環(huán)。所有假脯氨酸偶聯(lián)物均不含HOBT。下列被保護(hù)的氨基酸是以所示的次序?yàn)榇似闻悸?lián)的那些氨基酸Fmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-MetOHFmoc-L-Gln(trt)OHFmoc-L-Lys(Boc)OHFmoc-L-Leu-Ser(假脯氨酸)Fmoc-L-Asp(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Phe-Thr(假脯氨酸)Fmoc-L-Thr(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-His(trt)OH在最終的偶聯(lián)后，用DMF洗滌樹脂得到Fmoc-保護(hù)的結(jié)合樹脂的艾塞那肽(1_19)片段，其可通過符號(hào)FmocAAl-19-樹脂來標(biāo)識(shí)，其具有假脯氨酸置換，如上面列舉的氨基酸中所示。3.從樹脂的裂解使用在二氯甲烷中稀釋的(例如，1%)三氟乙酸(TFA)從樹脂上裂解結(jié)合樹脂的FAA1-190H≤llOmin。然后加入吡啶以中和TFA。去除液體并用二氯甲烷洗滌樹脂。可通過另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液處理，及然后用吡啶處理來重復(fù)樹脂_裂解，且所得溶液與第一次裂解溶液組合。4.FmocAAl-190H的沉淀FmocAAl-190H用水提取3次。如果觀察到乳液，則推薦鹽水溶液。使用DCM的反提取用于協(xié)助確保良好的產(chǎn)率。通過蒸餾減少二氯甲烷，加入庚烷以沉淀肽，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%。分離沉淀的FAA1-19，用庚烷洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例14-Fmoc保護(hù)的艾塞那肽(20_29)的固相肽合成A.制備Fmoc-H-Gly-負(fù)載的樹脂H-Gly-樹脂(2_C1_三苯甲基)(1倍等價(jià)量)與二氯甲烷組合以便溶脹樹脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(即，10克樹脂在60mlDMF中)。B.固相合成1.氨基酸偶聯(lián)負(fù)載在樹脂上的下一氨基酸為Fmoc-Asn(trt)OH。過量的被保護(hù)的氨基酸(例如，1.5倍等價(jià)量)、過量的6C1N-羥基苯并三唑(6C1Η0ΒΤ，例如，1.5倍等價(jià)量)和過量的N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC，例如，1.7倍等價(jià)量)在DMFDMSO二甲基亞砜(11)中組合并冷卻至<25°C。此活化的氨基酸溶液與樹脂組合，然后用二氯甲烷沖洗。混懸液在^25°C下攪拌直至獲得陰性茚三酮測(cè)試(如上所述)(典型地3小時(shí))。2.Fmoc去除通過用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液處理去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。將溶液排出，并用DMF洗滌樹脂以減少殘余的哌啶。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)氨基酸偶聯(lián)和Fmoc去除的循環(huán)。下列被保護(hù)的氨基酸是以所示的次序?yàn)榇似闻悸?lián)的那些氨基酸Fmoc-Lys(Boc)OHFmoc-LeuOHFmoc-L-Trp(Boc)OHFmoc-L-Glu(tBu)OHFmoc-L-IleOHFmoc-L-PheOHFmoc-L-LeuOHFmoc-L-Arg(Pbf)OH在最終的偶聯(lián)后，用DMF洗滌樹脂得到Fmoc-保護(hù)的結(jié)合樹脂的艾塞那肽(20-29)片段，其可通過符號(hào)FmocAA20-29-樹脂來標(biāo)識(shí)。3.從樹脂的裂解使用在二氯甲烷中稀釋的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)從樹脂上裂解結(jié)合樹脂的FmocAA20-290H彡IlOmin。加入吡啶以中和TFA。去除液體并用二氯甲烷洗滌樹脂?？赏ㄟ^另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液處理，及然后用吡啶處理來重復(fù)樹脂_裂解，。4.FmocAA20-290H的沉淀FmocAA20-290H可以很容易乳化。因此，不推薦水提取。而是，通過蒸餾減少二氯甲烷，加入25%IPA(異丙醇)/水，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%。分離沉淀的FAA20-290H，用25%IPA/水洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例15-艾塞那肽(30-38)的固相肽合成A.制備H-L-Pro-負(fù)載的樹脂H-L-Pro樹脂(2_C1_三苯甲基)(1倍等價(jià)量)與二氯甲烷組合以便溶脹樹脂，并用N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(即，10克樹脂在60mlDMF中)。B.固相合成1.氨基酸偶聯(lián)序列中的下一氨基酸Fmoc-L-Pro-OH，過量的被保護(hù)的氨基酸(例如，1.5倍等價(jià)量)、過量的N-羥基苯并三唑(Η0ΒΤ，例如，1.5倍等價(jià)量)和過量的二異丙基乙胺(DIEA，例如，1.7倍等價(jià)量)在DMF中組合并冷卻至彡50C。得到的溶液和DMF溶液和過量2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，例如，1.5倍等價(jià)量)組合。此活化的氨基酸溶液與樹脂組合，然后用二氯甲烷沖洗?；鞈乙涸?lt;25°C下攪拌直至獲得如上所述的陰性茚三酮測(cè)試(典型地3小時(shí))。2.Fmoc去除通過用哌啶(典型地5-20%)/DMF溶液處理去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，只除了第二個(gè)和第三個(gè)Pro使用哌嗪以外。將溶液排出，并用DMF洗滌樹脂以去除殘余的堿。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)氨基酸偶聯(lián)和Fmoc去除的循環(huán)。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)該循環(huán)。下列被保護(hù)的氨基酸是以所示的次序?yàn)榇似闻悸?lián)的那些氨基酸Fmoc-L-ProOHFmoc-L-AlaOHFmoc-L-GlyOHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-Ser(tBu)OHFmoc-L-ProOHFmoc-L-GlyOH在最終的偶聯(lián)后，用DMF和然后用二氯甲烷洗滌樹脂得到Fmoc-保護(hù)的基于樹脂的艾塞那肽(30-38)片段，其可通過符號(hào)FmocAA30-38-樹脂來標(biāo)識(shí)。3.從樹脂的裂解使用在二氯甲烷中稀釋的(例如，2%)三氟乙酸(TFA)從樹脂上裂解結(jié)合樹脂的FmocAA30-380H^IlOmin0加入吡啶以中和TFA。去除液體并用二氯乙烷洗滌樹脂?？赏ㄟ^另外用三氟乙酸/二氯甲烷溶液處理及然后用吡啶處理來重復(fù)樹脂_裂解，。4.片段的沉淀艾塞那肽(30-38)OH用水提取3次。如果觀察到乳液，則推薦鹽水溶液。使用DCM的反提取用于確保良好的產(chǎn)率。通過蒸餾減少二氯甲烷，加入庚烷，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%。分離沉淀的FAA30-38，用庚烷洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)O實(shí)施例16-艾塞那肽(30-39)Mi的溶液相肽合成FmocAA30-380H(l.2倍等價(jià)量)、過量的6_氯-1-羥基苯并三唑(6-C1-H0BT；例如，1.2-1.4倍等價(jià)量)，L-絲氨酸(tBu)酰胺(例如，1-1.2倍等價(jià)量)和DMF組合。該溶液冷卻至≤5°C并與過量的DIEA(例如，2.O倍等價(jià)量)和HBTU(例如，1.2倍等價(jià)量)組合。所得溶液保持在≤0°C，直至反應(yīng)完成(S卩，≤FmoCAA27-380H，例如通過HPLC)。反應(yīng)混合物與稀釋的乙酸水溶液(典型地3%-5%)在25°C下組合。二氯甲烷溶液用稀釋的碳酸氫鈉水溶液(典型地2%-3%)洗滌，并進(jìn)行兩次水洗滌，然后汽提至油。推薦采用二氯甲烷反提取。為了去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，將哌啶或哌嗪結(jié)合樹脂加入至反應(yīng)混合物中，并且使溶液在≤0°C下攪拌直至完成(即，≤1%FmocAA30-39NH2；例如通過HPLC)。通過蒸餾減少二氯甲烷，加入甲基叔-丁醚(MTBE)以沉淀肽，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%(例如，通過GC)。分離沉淀的HAA30-39NH2，用MTBE洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例17-ImSBflt(20-39)NH,的溶液相flt合成H-AA(30-39)NH2(1.25倍等價(jià)量)、Fmoc-AA(20-29)OH(1倍等價(jià)量)和過量的6-Cl-H0BT(例如，1.2-1.4倍等價(jià)量)溶解在DCM中。該溶液冷卻至≤25°C，并與過量的DIEA(例如，2.7倍等價(jià)量)和HBTU(例如，1.2倍等價(jià)量)組合。所得溶液保持在<25°C，直至反應(yīng)完成(即，≤總Fmoc-AA(20-29)0H，例如通過HPLC)。如果需要，可另外地投入原料和/或試劑。哌啶或哌嗪結(jié)合的樹脂與該混合物組合以去除Fmoc基團(tuán)(即，<Fmoc-AA(20-39)NH2；例如通過HPLC)。當(dāng)完成時(shí)，該混合物與鹽水洗滌液組合，并然后在<25°C下4x水洗滌。使用二氯甲烷的反提取用于提高產(chǎn)率。通過蒸餾減少二氯甲烷，加入甲基叔-丁醚(MTBE)，并且剩余的二氯甲烷進(jìn)一步通過蒸餾減少至<25vol%(例如，通過GC)。分離沉淀的HAA20-39NH2，用MTBE洗滌，然后真空干燥(35°C，最大)。實(shí)施例18-艾塞那肽(1-39)NHJ被完全保護(hù))的溶液相肽合成DCM中的HAA20-39NH2(1倍等價(jià)量)、AAF1_190H(1倍等價(jià)量)、過量的6-C1-H0BT(例如，1.5-2倍等價(jià)量)與過量的HBTU和DIEA在≤0°C下混合。攪拌反應(yīng)混合物直至反應(yīng)完成(即，≤1.0%AA1-190H和彡1·5%ΗΑΑ20-39ΝΗ2，例如，通過HPLC確定)。冷卻反應(yīng)器至15°C，用DCM猝滅，并暖化至25°C。用水進(jìn)行水提取2次。濃縮DCM層。加入哌啶或哌嗪結(jié)合的樹脂以去除Fmoc，從而在≤25°C下2小時(shí)的期間內(nèi)提供AAF1-39NH2。AAH1-39NH2溶解在DCM中。備選的途徑是在活化反應(yīng)前5分鐘時(shí)，使用處于DMF中的DIC(N，N，-二異丙基碳二亞胺)/代替HBTU/DIEA，將反應(yīng)物冷卻至0°C。活化后等待5分鐘。然后暖化樣品至室溫(25°C)。進(jìn)行水提取和然后去除Fmoc保護(hù)可增加wt/wt值。也可嘗試Fmoc去除，和然后進(jìn)行水提取。實(shí)施例19-艾塞那肽(1-39)Mi的全面脫保護(hù)來自前面步驟的二氯甲烷溶液與三氟乙酸、水和二硫蘇糖醇(例如，1/0.08/0.012比值)組合。該混合物在<24°C下攪拌至多3小時(shí)，然后冷卻至<0°C。一直保持在氮?dú)庵?。逐滴加入冷MTBE以從反應(yīng)混合物中沉淀肽。一旦所有肽在MTBE中，則攪拌lhr。通過過濾分離固體，用MTBE洗滌，并在彡35°C下真空部分干燥。實(shí)施例20-脫羧遵照上面實(shí)施例8概述的流程來對(duì)實(shí)施例19的脫保護(hù)的肽進(jìn)行脫羧。實(shí)施例21-純化分別遵照實(shí)施例9-12中概述的流程，以純化實(shí)施例20的脫羧的肽。實(shí)施例22-層析后進(jìn)行的濃縮和分離所有溶液在使用前應(yīng)該通過用氮?dú)獯祾咧辽?0分鐘來進(jìn)行脫氧。將含有產(chǎn)物的所有溶液保持在氮?dú)庵小３钦f明，所有操作均在室溫下完成。1.通過卡爾費(fèi)歇爾滴定法(KarlFischertitration)將肽溶液調(diào)節(jié)至<10%乙腈(ACN)。所有匯集的餾分用2體積水稀釋。這提供校正的ACN濃度。也可使用真空蒸餾來去除乙腈。2.以約2ml/min向Amberchrome柱加樣(見下面的柱制備)。3.用1柱體積的0.5M(38.5g/l)乙酸銨以約4ml/min洗滌以去除HPLC緩沖液。4.用1柱體積的2_5wt%乙酸溶液以約4ml/min洗滌。5.用1柱體積的水以約4ml/min洗滌。6.用8020(wt/wt)Et0H(2B)洗脫水處于約2ml/min的流速。7.收集餾分。肽應(yīng)該在空隙體積(voidvolume)后立即洗脫。在洗脫期間可增加乙醇濃度，或可單獨(dú)地收集尾段用于下一輪再注射。8.可通過用4柱體積水沖洗重建柱。9.可通過將乙醇/水共沸物蒸餾掉來進(jìn)行進(jìn)一步濃縮。10.向產(chǎn)物餾分中隨著攪動(dòng)加入乙醇(2B)以沉淀肽。約10-15體積乙醇用于沉淀。11.隨著攪動(dòng)冷卻至<0°C并保持至少2小時(shí)。12.可使用有機(jī)共溶劑諸如甲苯、MTBE或乙酸乙酯來提高沉淀的產(chǎn)率。13.使用氮?dú)鈮毫νㄟ^標(biāo)定1μm濾膜壓力濾液。如果其混濁則將第一部分再循環(huán)。保持濾器冷卻。14.用IOml/克Et0H(2B或可使用純乙醇)沖洗。持續(xù)吹氮直至干燥。在干燥期間，濾器可升溫至25°C。15.在減壓下繼續(xù)干燥直至達(dá)到所需的殘留溶劑水平。16.在發(fā)現(xiàn)濾器和包裝之前對(duì)殘留溶劑取樣。Amberchrome柱的制備1.Amberchrome在獲得時(shí)為處于乙醇中的50%漿料，在加樣前將漿料至少確認(rèn)一次。2.沉降30min并倒掉細(xì)粒。加回等體積水。3.將漿料倒入柱中。打開閥門并排掉過量的液體。4.用2柱體積水洗柱。5.在加樣前排掉高于樹脂床的所有液體。實(shí)施例23下面是在層析后進(jìn)行的艾塞那肽的實(shí)施例。2.5x17cmAmberchromeCM樹脂裝填在低壓玻璃柱中并用去離子水平衡。含有4.7g純化肽的體積為950ml的純化肽溶液以至多4ml/分鐘的速率加樣至柱上。肽溶液應(yīng)當(dāng)被稀釋至大于90%的水溶液濃度。當(dāng)加樣時(shí)，肽結(jié)合的樹脂用120ml0.IM乙酸銨水溶液洗滌，然后用120ml2%乙酸水溶液洗滌。然后用51的乙醇水的溶液洗脫肽，并收集含產(chǎn)物的餾分。然后所收集的約150ml的濃縮溶液通過以約30ml/分鐘的速率加入800ml乙醇而被沉淀。然后漿料冷卻至_20°C并保持2小時(shí)。通過加入70ml乙酸乙酯并另外保持30分鐘來完成沉淀作用。漿料通過多孔玻璃漏斗過濾，并用200ml乙醇洗滌。在氮?dú)饬骱蜏p壓下，在室溫下干燥濕餅直至完全干燥。這樣產(chǎn)生了3.8克干燥的純化肽。權(quán)利要求一種促胰島素肽片段，包括包括至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)的氨基酸序列，并且還包括至少一個(gè)假脯氨酸結(jié)構(gòu)部分的殘基，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)。2.如權(quán)利要求1所述的促胰島素肽片段，其中一個(gè)或兩個(gè)假脯氨酸殘基在所述谷氨酸殘基的重復(fù)序列和所述片段的N-末端之間。3.如權(quán)利要求1所述的促胰島素肽片段，其中所述片段包括至少15個(gè)氨基酸的殘基，其中每個(gè)引入至所述片段中的假脯氨酸殘基計(jì)數(shù)為兩個(gè)氨基酸殘基。4.如權(quán)利要求3所述的促胰島素肽片段，其中所述片段包括至少17個(gè)氨基酸的殘基。5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的促胰島素肽片段，包括SEQIDNo.34的氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中選自Gly-Thr(4-5)、Phe-Thr(6-7)、Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一個(gè)位置被假脯氨酸置換，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的促胰島素肽片段，其中所述片段選自由下列各項(xiàng)組成的組His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.2)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.3)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.4)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.5)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.6)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.7)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.8)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.9)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.10)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.11)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.12)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.13)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xlo-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.14)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.15)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.16)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.17)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.18)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.19)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.20)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.21)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.22)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.23)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.25)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.26)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.27)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.28)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.29)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.30)，和His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.31)，其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位處的假脯氨酸X4-X5對(duì)應(yīng)于Gly-Thr或其對(duì)應(yīng)物；6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物；7和8位處的假脯氨酸X7-X8對(duì)應(yīng)于Thr-Ser或其對(duì)應(yīng)物；以及10和11位處的假脯氨酸Xltl-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的促胰島素肽片段，其中所述片段具有下式His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物。8.一種制備促胰島素肽的方法，包括以下步驟a)制備包括氨基酸序列的第一肽片段或其對(duì)應(yīng)物，所述氨基酸序列包括至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸(Glu-Glu)并還包括假脯氨酸；以及b)將所述肽片段與第二肽片段偶聯(lián)以獲得所述促胰島素肽。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一肽片段是包括SEQIDNo.34的氨基酸序列的片段His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中選自Gly-Thr(4-5)、Phe-Thr(6-7)、Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一個(gè)位置被假脯氨酸置換，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述第一肽片段選自由下列各項(xiàng)組成的組His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.2)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.3)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.4)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.5)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.6)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.7)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.8)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.9)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.10)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val(SEQIDNo.11)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.12)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.13)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X1c1-X11-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.14)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.15)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.16)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.17)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.18)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.19)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.20)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala(SEQIDNo.21)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.22)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.23)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X1c1-X11-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.25)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.26)，His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.27)，His-Gly-Glu-X4-X5-X6-X7-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.28)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Leu--Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.29)，His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.30)，和His-Gly-Glu-X4-X5-Phe-X7-X8-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.31)，其中在SEQIDNo.2-31中，4和5位處的假脯氨酸X4-X5對(duì)應(yīng)于Gly-Thr或其對(duì)應(yīng)物；6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物；7和8位處的假脯氨酸X7-X8對(duì)應(yīng)于Thr-Ser或其對(duì)應(yīng)物；以及10和11位處的假脯氨酸Xltl-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物，并且所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一肽片段具有下式His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-Xio-Xll-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu(SEQIDNo.24)，其中6和7位處的假脯氨酸X6-X7對(duì)應(yīng)于Phe-Thre或其對(duì)應(yīng)物以及10和11位處的假脯氨酸Xici-X11對(duì)應(yīng)于Leu-Ser或其對(duì)應(yīng)物，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第二肽片段選自由下列各項(xiàng)組成的組Alal8-Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-S32er-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.46)，Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-Gl34y_Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.47)，Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly3o-Pro31-Ser32-S33er-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.48)，Vali9-Arg2o-Leu2i-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly3o-Pro31-Ser32-Ser33-G34Iy-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38Ser39(SEQIDNo.49)，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述促胰島素肽為艾塞那肽(exenatide)(1-39)或其對(duì)應(yīng)物。14.一種促胰島素肽，包括脯氨酸的至少一個(gè)殘基；至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)；以及任選地至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。15.如權(quán)利要求14所述的促胰島素肽，其中所述肽是艾塞那肽(1-39)的對(duì)應(yīng)物。16.如權(quán)利要求14或15所述的促胰島素肽，其中所述肽是艾塞那肽(1-39)的對(duì)應(yīng)物，所述對(duì)應(yīng)物與艾塞那肽(1-39)的不同之處在于將假脯氨酸的至少一個(gè)殘基引入至所述肽中的修飾。17.根據(jù)權(quán)利要求33所述的促胰島素肽，其中所述肽包括根據(jù)SEQIDNo.50-79的任意一個(gè)的至少一條氨基酸序列或其對(duì)應(yīng)物。18.一種肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.35-39的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。19.一種肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.40-42的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。20.一種肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.43-45的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。21.一種肽片段，其選自由根據(jù)SEQIDNo.46-49的任意一個(gè)的片段組成的組，或其對(duì)應(yīng)物。22.—種制備促胰島素肽的方法，包括以下步驟a)提供第一、第二和第三肽片段，所述第一肽片段包括至少兩個(gè)重復(fù)Glu殘基的序列并且包括假脯氨酸的至少一個(gè)殘基，并且其中所述片段的任意一個(gè)任選地包括至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)；b)將絲氨酸殘基與所述第三肽片段偶聯(lián)以獲得第四肽片段；c)將所述第四片段與所述第二片段偶聯(lián)以獲得第五片段；和d)將所述第五肽片段與所述第一肽片段偶聯(lián)以獲得促胰島素肽。23.權(quán)利要求22所述的方法，還包括以下的步驟e)層析純化所述肽；和f)沉淀所述純化的肽。24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中步驟a)包括提供包括SEQIDNo.34的氨基酸序列的第一肽片段His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu,其中選自Gly-Thr(4-5)、Phe-Thr(6-7)、Thr-Ser(7-8)和Leu-Ser(10-11)的至少一個(gè)位置被假脯氨酸置換，所述片段任選地含有側(cè)鏈保護(hù)。25.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中步驟a)包括提供第一肽片段，所述第一肽片段選自由根據(jù)SEQIDNo.2-31的任意一個(gè)的片段組成的組。26.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中步驟a)包括，提供選自由根據(jù)SEQIDNo.2-31的任意一個(gè)的片段組成的組的第一肽片段或其對(duì)應(yīng)物，選自由根據(jù)SEQIDNo.35、37-39的任意一個(gè)的片段組成的組的第二肽片段或其對(duì)應(yīng)物和選自由根據(jù)SEQIDNo.41或42的片段組成的組的第三肽片段或其對(duì)應(yīng)物。27.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述第一、所述第二和所述第三片段利用固相合成技術(shù)合成。28.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述第四和第五片段以及所述促胰島素肽在溶液相中形成。29.如前文中所述的發(fā)明。全文摘要本發(fā)明涉及使用固相和溶液相(“混合”)途徑合成的包括至少兩個(gè)直接連續(xù)的谷氨酸殘基(Glu-Glu)的促胰島素肽的制備。一般地，該途徑包括使用固相化學(xué)合成三個(gè)不同的肽中間片段。然后使用溶液相化學(xué)將另外的氨基酸物質(zhì)添加至片段之一上。然后這些片段在溶液相中偶聯(lián)在一起。在片段之一中使用假脯氨酸便于該片段的固相合成，并且還便于隨后該片段與其他片段的溶液相偶聯(lián)。本發(fā)明對(duì)于形成促胰島素肽諸如艾塞那肽(exenatide)(1-39)及其對(duì)應(yīng)物是非常有用的。文檔編號(hào)C07K1/107GK101835794SQ200880112874公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年10月17日優(yōu)先權(quán)日2007年10月27日發(fā)明者保羅·亞當(dāng)·白瑞,布拉德利·S·德霍夫,理查德·A·加貝爾,約翰·愛德華·卡里德爾,羅伯特·薩德·卡爾二世,貝利·托馬斯·金申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司