專利名稱：1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硝基呋喃類抗生素代謝物的免疫原及其制備方法，尤其涉及一種呋 喃妥因(Nitrofurantoin)代謝物l-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原及其制備方法與應(yīng)用。屬 硝基呋喃類抗生素藥免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
下列定義適用于整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求書
牛血清蛋白(Bovine Serum ALb咖in，簡(jiǎn)稱BSA): Sigma公司產(chǎn)品 卵清蛋白(簡(jiǎn)稱0VA): Sigma公司產(chǎn)品
磷酸緩沖液(Phosphate Buffered SaLine，簡(jiǎn)稱PBS) : (0. 01 M, pH =7. 40) 1-氨基-乙內(nèi)酰脲(l-aminohydantoin，簡(jiǎn)稱AHD): Sigma公司產(chǎn)品 3 —羧基苯甲醛(3-carboxybenzaLbenzaLdehyde,簡(jiǎn)稱CBA):上海點(diǎn)耀精細(xì)化工有 限公司產(chǎn)品
3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(簡(jiǎn)稱CPAHD):實(shí)驗(yàn)室合成 鄰硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde，簡(jiǎn)稱NBA):北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司 鄰硝基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(簡(jiǎn)稱NPAHD):實(shí)驗(yàn)室合成 乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(簡(jiǎn)稱EDC) :Sigma公司產(chǎn)品 三正丁胺中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品 氯甲酸異丁酯上海飛翔化工廠產(chǎn)品
乙二胺廣東 汕頭西隴化工產(chǎn)品
透析膜bioshorp公司產(chǎn)品
N,N' -二甲基甲酰胺(DMF):天津市廣成化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品
呋喃妥因(Nitrofurantoin)是一種重要的硝基呋喃類抗感染藥，而1-氨基-乙內(nèi)酰 脲(l-aminohydantoin)為呋喃妥因的代謝物。由于優(yōu)良的抗菌性能和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，呋喃 類藥物早已被廣泛地應(yīng)用于家畜、家禽和水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)的傳染病預(yù)防與治療，是一類廣 譜抗菌藥。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，硝基呋喃類藥物以及其代謝產(chǎn)物具有 致癌和致突變的特性。動(dòng)物長(zhǎng)期或大劑量服用呋喃類藥物能引起毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為興奮， 驚厥，癱瘓的急性神經(jīng)癥狀以及全身出血和反芻消化障礙等慢性中毒反應(yīng)。對(duì)于人體的 不良反應(yīng)主要是胃腸反應(yīng)，溶血性貧血，血小板減少性紫癜，多發(fā)性神經(jīng)炎，眼部損害， 急性肝壞死和嗜酸性白細(xì)胞增多等過(guò)敏反應(yīng)。
由于這些毒害作用，世界上很多國(guó)家都對(duì)硝基呋喃類藥物的使用和殘留實(shí)施了嚴(yán)格的規(guī)定。美國(guó)21CFR530.41規(guī)定食源性動(dòng)物禁止使用呋喃妥因；澳大利亞于1992年 禁止在養(yǎng)殖業(yè)中使用硝基呋喃類藥物；歐盟EEC2377/90規(guī)定動(dòng)物食源性食品中不得 檢出硝基呋喃(包括呋喃妥因)；歐盟在1995年6月開(kāi)始規(guī)定動(dòng)物源食品中不得檢出硝 基呋喃(Commission ReguLation 1442/95);在我國(guó)，硝基呋喃藥物是農(nóng)業(yè)部嚴(yán)禁的抗 菌素。盡管如此，硝基呋喃類藥物由于藥效顯著，價(jià)格低廉，難以檢測(cè)，在我國(guó)的畜禽 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用非常普遍,這給人們的健康安全帶來(lái)巨大的隱患。我國(guó)出口歐盟的魚， 蝦，禽肉，兔肉，和腸衣均被檢出過(guò)含有硝基呋喃類藥物，尤其是兔肉和禽肉，常常導(dǎo) 致出口食品被迫就地銷毀。這已嚴(yán)重影響我國(guó)動(dòng)物源食品的出口，對(duì)國(guó)際貿(mào)易帶來(lái)極大 的威脅。所以，硝基呋喃類藥物殘留的檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)研究己刻不容緩。
硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，通過(guò)檢測(cè)母體化合物并不能得知這類藥物的 濫用情況。檢測(cè)硝基呋喃類藥物殘留以杜絕使用這種違禁藥物的最佳方法是檢測(cè)其代謝 物而非母體化合物本身，因此，檢測(cè)硝基呋喃類藥物的殘留就變成了檢測(cè)這些與蛋白組織結(jié)合在一起的代謝物的殘留。
在抗生素藥物殘留的檢測(cè)中，儀器法如液相色譜和質(zhì)譜以及液相質(zhì)譜聯(lián)用是應(yīng)用最 廣泛的方法。這些方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法。但儀器法價(jià)格昂貴，費(fèi) 時(shí)較長(zhǎng)，需要大型儀器設(shè)備，需要專門的技術(shù)人員，所以難于用于現(xiàn)場(chǎng)操作。酶聯(lián)免疫 檢測(cè)法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)易，不需要專 門人員操作等優(yōu)點(diǎn)，這使得ELISA法成為一種理想的，可用于常規(guī)掃描的檢測(cè)方法。酶 聯(lián)免疫檢測(cè)法的核心是需要高質(zhì)量的抗體。大多數(shù)抗生素包括硝基呋喃類藥物都是小分 子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化合物轉(zhuǎn)變成能引 發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。
經(jīng)檢索，目前世界上尚未有關(guān)于呋喃妥因(Nitrofurantoin)代謝物1-氨基-乙內(nèi) 酰脲的免疫原的合成的報(bào)道，基于1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA Conjugate) 可用來(lái)制備鄰硝基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)特異反應(yīng)抗體，因此研 究1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原的合成及抗體制備有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種能引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生 針對(duì)鄰硝基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)有特異反應(yīng)的抗體的免疫原， 即1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA Conjugate)及其制備方法。同時(shí)，本發(fā)明 還提供了所述的l-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA Conjugate)在制備鄰硝基苯 甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原，由3 —羧基苯甲醛與1_氨基-乙內(nèi)酰脲形 成的偶聯(lián)物半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白連接制成。
其中所述產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)優(yōu)選活化牛血清蛋白。
上述l一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)如通式(I )
<formula>see original document page 6</formula> (I)
式中cBSA為活化牛血清蛋白(Cationized Bovine Serum Albumin)，其分子量范 圍是6. 7 6. 8 KDa;
n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲形成 的偶聯(lián)物(CPAHD)的分子數(shù)；所述n為整數(shù)l 10;
上述免疫原顯示出如下物化特征
(1) 外觀白色粉末固體；
(2) 紫外吸收光譜284 nm。
上述的l一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原結(jié)構(gòu)通式中所述n優(yōu)選整數(shù)5 8， cBSA分子 量?jī)?yōu)選6. 8 Kda 。
本發(fā)明所述l一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法，其特征是將3 —羧基苯甲 醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲形成偶聯(lián)物(CPAHD)與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合 為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原，并保持該免疫原的生物活性不變。
上述l一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的具體制備方法，由如下步驟完成
(1) 3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)的制備將l-氨基-乙 內(nèi)酰脲的鹽酸鹽與間羧基苯甲醛按1: 1 3:1溶于20 30mL無(wú)水甲醇中，在65士5。C下 回流反應(yīng)18 24小時(shí)，蒸干后用無(wú)水乙醇洗滌抽濾、干燥，得3 —羧基苯甲醛與1-氨 基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物，備用；
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制備在0 4。C條件下，先將乙二胺溶于pH為7. 38 7.56、濃度為0.01 M 0.02 M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7. 38 7. 50,備用； 稱取牛血清蛋白(BSA)和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)，然后以乙二胺牛 血清蛋白乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺的摩爾比為15 25 : 1 : 15 25的量依次 加入上述溶液中，在2(TC土5'C條件下攪拌反應(yīng)2 4h;將反應(yīng)溶液在0 4匸條件下， 用上述磷酸緩沖液攪拌透析70 80h，然后改用蒸餾水透析20 30h，每6h更換一次透 析液；在0 4。C,以10000 13000r/min離心上述透析后的溶液10 15min,取上清液； 凍干上清液，得到白色粉末固體即活化的牛血清蛋白(cBSA)，備用；
(3) 1-氨基-乙內(nèi)酰脲(CPAHD-cBSA)的制備 ① 溶液A的制備:稱取3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)溶 于 N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中，以3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)、 三正丁胺與氯甲酸異丁酯的摩爾比為1: 1 1.5: 4 6的量加入三正丁胺攪拌10min， 在冰浴條件下再加入氯甲酸異丁酯，反應(yīng)l 2h，得溶液A，備用；
② 溶液B的制備稱取活化的牛血清蛋白(cBSA)溶于N，N' -二甲基甲酰胺(DMF) 的水溶液中，得溶液B，其中以質(zhì)量比計(jì)，N,N' -二甲基甲酰胺水二1:1 1:3;
③ 溶液C的制備將A溶液緩慢加入到B溶液中，于0 4'C條件下攪拌反應(yīng)2 4h， 得溶液C，其中3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)與活化的牛血 清蛋白(cBSA)的摩爾比為100:1 150: 1;
(4) 用pH為7. 30 7.50、濃度為0. 01M 0. 02M的磷酸緩沖液在0 4。C下，攪拌 透析溶液C 70 80小時(shí)，然后改用蒸餾水透析20 30小時(shí)，每6 7小時(shí)更換一次透 析液；以12000 15000r/min離心透析后的溶液10 15min，取上清液，備用；
(5) 將步驟(4)所述上清液以常規(guī)方式凍干，得到1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原粗品。
上述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法中，優(yōu)選的實(shí)施方式是
步驟(1)所述1-氨基-乙內(nèi)酰脲的鹽酸鹽與間羧基苯甲醛的摩爾比為l : 1。
步驟(3)之③所述3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)與活化 的牛血清蛋白(cBSA)的摩爾比為120:1。
步驟(2)、 (4)所述磷酸緩沖液的pH為7.4，磷酸緩沖液的濃度為0.01 M。
本發(fā)明所述l一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原在制備鄰硝基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲 的偶聯(lián)物(NPAHD)特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明的技術(shù)方案可以成功地把半抗原l一氨基一乙內(nèi)酰脲與載體蛋白特別是 牛血清蛋白偶聯(lián)起來(lái)，從而制備成能夠在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫 原即1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA)。
利用本發(fā)明所述的l-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原免疫新西蘭大白兔，成功地獲得了對(duì) 鄰硝基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)有特異反應(yīng)的抗體。經(jīng)酶聯(lián)免疫檢 測(cè)實(shí)驗(yàn)鑒定，利用本發(fā)明所述的1-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原制備的抗體對(duì)鄰硝基苯甲醛與 1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)有特異性反應(yīng)，其抗血清效價(jià)達(dá)到l : 1, 024， 000 以上，其最低檢測(cè)限為O. l卯b， ICs。(轉(zhuǎn)化為AHD)為10卯b。
本發(fā)明成功地把半抗原1-氨基-乙內(nèi)酰脲與載體蛋白特別是牛血清蛋白偶聯(lián)起來(lái)， 合成了能夠在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫原。利用此免疫原免疫兔， 鼠，雞等動(dòng)物可以得到對(duì)鄰硝基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)有特異反 應(yīng)的抗體。把該抗體鍍?cè)谖⒖妆P內(nèi)，就可以用來(lái)檢驗(yàn)動(dòng)物源食品中呋喃妥因抗生素的殘 留。由于本發(fā)明方法具有簡(jiǎn)易，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，所以可以用于食品檢驗(yàn)檢疫 中的初步掃描篩選之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗(yàn)時(shí)間，還可以用于現(xiàn)場(chǎng)操作，從 而補(bǔ)充儀器法的缺點(diǎn)。
本發(fā)明所述半抗原1-氨基-乙內(nèi)酰脲與載體蛋白牛血清蛋白免疫原的合成為動(dòng)物源食品中呋喃妥因抗生素的殘留快速檢驗(yàn)又提供了新的手段，為制備卜氨基-乙內(nèi)酰脲的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒提供了基礎(chǔ)。


圖1紫外吸收光譜圖
其中1: l-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原2: 3 —羧基苯甲醛3: 3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)4:活化牛血清蛋白(cBSA)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
(1) 3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)的制備將1-氨基-乙 內(nèi)酰脲的鹽酸鹽與間羧基苯甲醛按l:l溶于20 30mL無(wú)水甲醇中，在65士2。C下回流反 應(yīng)20小時(shí)，蒸干后用無(wú)水乙醇洗滌抽濾、干燥，得3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲 的偶聯(lián)物，備用；
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制備:在0 4'C條件下，先將乙二胺溶于pH為7. 46、 濃度為0.01M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7.46，備用；稱取牛血清蛋白(BSA) 和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)，然后以乙二胺牛血清蛋白乙基[3-(二 甲胺基)丙基]碳二亞胺的摩爾比為20 : 1 : 20的量依次加入上述溶液中，在20。C士rC 條件下攪拌反應(yīng)3h;將反應(yīng)溶液在0 4'C條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析80h，然 后改用蒸餾水透析30h，每6h更換一次透析液；在0 4'C，以13000r/min離心上述透 析后的溶液15min，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體即活化的牛血清蛋白
(cBSA)，備用；
(3) l-氨基-乙內(nèi)酰脲(CPAHD-cBSA)的制備
① 溶液A的制備稱取3 —羧基苯甲醛與卜氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)溶 于N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中，以3—羧基苯甲醛與卜氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物
(CPAHD)、三正丁胺與氯甲酸異丁酯的摩爾比為1: 1: 5的量加入三正丁胺攪拌10min， 在冰浴條件下再加入氯甲酸異丁酯，反應(yīng)2h，得溶液A,備用；
② 溶液B的制備稱取活化的牛血清蛋白(cBSA)溶于N, N' -二甲基甲酰胺(DMF) 的水溶液中，得溶液B，其中以質(zhì)量比計(jì)，N，N' -二甲基甲酰胺:水=1:2;
③ 溶液C的制備將A溶液緩慢加入到B溶液中，于0 4'C條件下攪拌反應(yīng)4h， 得溶液C，其中3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)與活化的牛血 清蛋白(cBSA)的摩爾比為120:1;
(4) 用pH為7. 45、濃度為0. 01M的磷酸緩沖液在0 4'C下，攪拌透析溶液C 80 小時(shí)，然后改用蒸餾水透析30小時(shí)，每6小時(shí)更換一次透析液；以14000r/min離心透 析后的溶液15min，取上清液，備用；
(5) 將步驟(4)所述上清液以常規(guī)方式凍干，得到1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原粗
(6)通過(guò)紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于284nm。
實(shí)施例2:
U)3—羧基苯甲醛與卜氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)的制備將l-氨基-乙內(nèi) 酰脲的鹽酸鹽(151nig)與間羧基苯甲醛(75mg)溶于20mL無(wú)水甲醇中。在65'C下回流反應(yīng) 20小時(shí)。蒸干后用無(wú)水乙醇洗滌、抽濾、干燥，備用。
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制備在0 4X:條件下，先將乙二胺(13.5mg)溶于 pH為7.40，濃度為0.015 M磷酸緩沖溶液中，然后用濃鹽酸調(diào)pH為7.40，備用；稱 取牛血清蛋白(1000mg)和乙基[3- (二甲胺基)丙基]碳二亞胺(42mg)，然后加入上述溶液 中，在20。C條件下攪拌反應(yīng)3h;將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0 4'C條件下，用上述 磷酸緩沖液攪拌透析75h，然后改用蒸餾水透析25h，每6.5h更換一次透析液；在0 4 ℃，以13000r/min離心上述透析后的溶液10min，取上清液；凍干上清液，得到白色粉 末固體一活化牛血清蛋白(cBSA)，備用。
(3) l-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原(CPAHD-cBSA)的制備
a) 溶液A的制備稱取40mg CPAHD溶于10mL N, N' -二甲基甲酰胺(DMF)中。加 入66.7yL三正丁胺攪拌15min。在冰浴條件下加入93y L氯甲酸異丁酯，反應(yīng)1. 5h， 備用。
b) 溶液B的制備稱取65mg活化牛血清蛋白(cBSA)溶于15mL N,N' -二甲基甲酰 胺(DMF)的水溶液中(DMF:水-1: 1)。
c) 溶液C的制備將A溶液緩慢加入到B溶液中，于0 4'C條件下攪拌反應(yīng)4h。
(4) 用pH為7. 40，濃度為0. 01M的磷酸緩沖液在0 4'C下，攪拌透析溶液C 75h， 然后改用蒸餾水透析25h，每6.5h更換一次透析液；15000r/min離心透析后的溶液 15min，取上清液。
(5) 凍干上清液，得到1-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原粗品。
(6) 通過(guò)紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于284nm。
實(shí)施例3:
(1) 3—羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)的制備l-氨基-乙內(nèi)酰 脲的鹽酸鹽(151mg)與間羧基苯甲醛(50mg)溶于20mL無(wú)水甲醇中。在65℃下回流反應(yīng) 25小時(shí)，蒸干后用無(wú)水乙醇洗滌、抽濾、干燥，備用。
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制備在0 4。C條件下，先將乙二胺(27mg)溶于pH 為7. 5，濃度為0. 02 M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7. 40，備用；稱取牛血清 蛋白(1000mg)和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(84mg)，然后依次加入上述溶液中， 在2(TC下攪拌反應(yīng)4h;將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0 4。C條件下，用上述磷酸緩沖 液攪拌透析80h，然后改用蒸餾水透析30h，每7h更換一次透析液；在0 4°C，以 10000r/min離心上述透析后的溶液15min，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體 cBSA，備用。(3) 1-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原(CPAHD-cBSA)的制備
a) 溶液A的制備稱取40mg CPAHD溶于10mL N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中。加 入66.7uL三正丁胺攪拌10min。在冰浴條件下加入93 u L氯甲酸異丁酯，反應(yīng)1. 5h， 備用。
b) 溶液B的制備稱取70mg活化牛血清蛋白(cBSA)溶于15mL N， N' -二甲基甲酰 胺(簡(jiǎn)F)的水溶液中(DMF:水二1: 1)。
c) 溶液C的制備將制備的A溶液緩慢加入到B溶液中，于0 4'C條件下攪拌反 應(yīng)4h。。
(4) 用pH為7. 40，濃度為0. 05M的磷酸緩沖液在0 4'C下，攪拌透析溶液C 80h， 然后改用蒸餾水透析30h，每7h更換一次透析液；高速離心，取上清液。
(5) 凍干上清液，得到1-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原粗品；
(6) 通過(guò)紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于284nm。
實(shí)施例4:
(1) 3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(CPAHD)的制備將l-氨基-乙內(nèi) 酰脲的鹽酸鹽(151mg)與間羧基苯甲醛(150mg)溶于20mL無(wú)水甲醇中。在65t下回流反 應(yīng)18小時(shí)。蒸干后用無(wú)水乙醇洗滌、抽濾、干燥，備用。
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制備在0 4。C條件下，先將乙二胺(18mg)溶于pH 為7.40，濃度為0.01M磷酸緩沖溶液中，然后用濃鹽酸調(diào)pH為7.40，備用；稱取牛 血清蛋白(1000mg)和乙基[3- (二甲胺基)丙基]碳二亞胺(56mg)，依次加入上述溶液中， 在20。C條件下攪拌反應(yīng)2h;將乙二胺與牛血清蛋白的反應(yīng)溶液在0 4'C條件下，用上 述磷酸緩沖液攪拌透析70h,然后改用蒸餾水透析20h，每6h更換一次透析液；在0 4 °C，以13000r/min離心上述透析后的溶液15min，取上清液；凍干上清液，得到白色粉 末固體一活化牛血清蛋白(cBSA)，備用。
(3) 1_氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原(CPAHD-cBSA)的制備
a) 溶液A的制備稱取40mgCPAHD溶于10mLN，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中。加 入50uL三正丁胺攪拌10min。在冰浴條件下加入87nL氯甲酸異丁酯，反應(yīng)lh，備用。
b) 溶液B的制備稱取80mg活化牛血清蛋白(cBSA)溶于15mL N， N' -二甲基甲酰 胺(函F)的水溶液中(匿F:水二1: 1)。
c) 溶液C的制備將制備的A溶液緩慢加入到B溶液中，于0 4'C條件下攪拌反 應(yīng)4h。
(4) 用pH為7. 40，濃度為0. 01M的磷酸緩沖液在0 4。C下，攪拌透析溶液C70h， 然后改用蒸餾水透析20h，每6h更換一次透析液；13000r/min離心透析后的溶液13min， 取上清液。
(5) 凍干上清液，得到1-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原粗品；
(6) 通過(guò)紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于284nm。實(shí)施例5:
抗體的制備純化及檢測(cè)
1.抗體的制備
選擇上述實(shí)施例l所制備的l-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)以制備抗體。 取lmg/mL的卜氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原的溶液lmL,加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化 后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射給四只體重2kg的雄性健康新西蘭大白兔，lmL/只，15天后以同量 抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行二免，二免以后，每隔15天加強(qiáng)免疫一次，抗原 量減半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心臟采血，室溫靜置lh， 0 4。C過(guò)夜， 13000r/min離心15min,收集血清，一20。C保存，備用。
2. 抗體的純化
攪拌狀態(tài)下向上述制備的抗血清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨溶液的終濃度為體積 百分比是50%， 0 4。C放置過(guò)夜，有沉淀物析出；以13000r/min離心15min，棄上清液， 向沉淀物中加入0.01M、 pH7. 4的PBS至沉淀溶解，然后加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨溶 液的終濃度為體積百分比是33%， 0 4r放置過(guò)夜，有沉淀物析出；以13000r/min離 心15min，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、 pH7.4的PBS至沉淀溶解。將上述純化物 用0.01M、 pH7.4的PBS， 0 4X:透析，換透析液3次，然后加入質(zhì)量體積百分比為O. 02 %的疊氮化鈉，一2(TC保存，備用。
3. 抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)
(1)效價(jià)測(cè)定方法采用常規(guī)的間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法 在96孔的酶標(biāo)板上，用100yL/孔的l-氨基-乙內(nèi)酰脲的包被抗原(10yg/mL)(戊 二醛方法合成)包被，0 4。C放置過(guò)夜，然后用PBST (1000mLpH7.4、濃度O. 01M的PBS屮 體積百分比是O. 05%Tween20)洗板四次；用250u L/孔封閉液(1000mLPBST十質(zhì)量體積百 分比是1%卵清蛋白)封閉，室溫放置3h，洗板；在洗去封閉液后，力口100uL/孔的抗血 清，室溫放置2h，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入l : 1000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的羊抗兔IgG100uL/孔，室溫放置lh，洗板；加入底物鄰苯二胺顯色，室溫放置10min， 再加入2MHC1終止。酶標(biāo)儀A492nm檢測(cè)。
經(jīng)測(cè)定本發(fā)明所述l-氨基-乙內(nèi)酰脲免疫原制備的抗體效價(jià)達(dá)l : 1,024,000。 效價(jià)的判定以P/N大于2 : l的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)效價(jià)。 其中P為代測(cè)血清在某一稀釋倍數(shù)測(cè)定的吸光度值，N為陰性對(duì)照在相應(yīng)稀釋倍 數(shù)測(cè)定的吸光度值。
(2)特異性測(cè)定
測(cè)定步驟與效價(jià)測(cè)定類似，在上述最佳的包被抗原與抗體濃度條件下，加抗體的同時(shí)加入鄰硝基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)(從100ppm-0. lppb)，與包 被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限的抗體，鄰硝基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)的濃 度越高，抗體與包被抗原就結(jié)合得越少，從而顯色越淺，吸光度值越低。再與空白對(duì)照 (只加抗體，未加鄰硝基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物(NPAHD)的吸光度值)相 比較，以確定抗體特異性。
通過(guò)測(cè)定抗體特異性較好，其最低檢測(cè)限可達(dá)到O. lppb, ICs。(轉(zhuǎn)化為AHD)為10卯b。
實(shí)施例6
制備上述酶聯(lián)免疫檢測(cè)中所用1-氨基-乙內(nèi)酰脲與卵清蛋白的偶聯(lián)物
(1) 稱取117mg卵清蛋白溶于10ml硼砂緩沖液(Ph=8.5)中。
(2) 稱取15.8mg1-氨基-乙內(nèi)酰脲加入(1)液中攪拌溶解。
(3) 向(2)液中滴加0.2ml25X的戊二醛，于0—4'C條件下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。
用pH7. 4、濃度0. 01M的PBS緩沖液0 — 4'C條件下，攪拌透析步驟(3)制得的溶液72
小時(shí)，然后改用蒸餾水透析30小時(shí)，每6小時(shí)更換一次透析液。
凍干上清液，得到淡黃色固體，即為l-氨基-乙內(nèi)酰脲與卵清蛋白的偶聯(lián)物；其結(jié)構(gòu)圖
如下<formula>see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1.一種1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原，由3-羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲形成的偶聯(lián)物半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白連接制成。
2. 如權(quán)利要求1所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原，其特征是所述產(chǎn)生免疫原性的 載體物質(zhì)是活化牛血清蛋白。
3. 如權(quán)利要求2所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原，其結(jié)構(gòu)如通式(I )式中cBSA為活化牛血清蛋白，其分子量范圍是6.7 6.8 KDa;n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲形 成的偶聯(lián)物的分子數(shù)；所述n為整數(shù)l 10; 上述免疫原顯示出如下物化特征(1) 外觀白色粉末固體；(2) 紫外吸收光譜284 nm。
4. 如權(quán)利要求3所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原，其特征是所述n為整數(shù)5 8， cBSA分子量是6. 8 Kda 。
5. 權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法，其特征是 將3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲形成偶聯(lián)物與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)， 結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原，并保持該免疫原的生物活性不變。
6. 如權(quán)利要求5所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法，由如下步驟完成(1) 3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物的制備將1-氨基-乙內(nèi)酰脲的鹽酸鹽與間羧基苯甲醛按l:l 3:l溶于20 30mL無(wú)水甲醇中，在65士5。C下回流反應(yīng)18 24小時(shí)，蒸干后用無(wú)水乙醇洗滌抽濾、干燥，得3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的 偶聯(lián)物，備用；(2) 活化牛血清蛋白的制備:在0 4。C條件下，先將乙二胺溶于pH為7. 38 7. 56、 濃度為0.01M 0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7. 38 7.50，備用；稱取牛 血清蛋白和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺，然后以乙二胺牛血清蛋白乙基 [3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺的摩爾比為15 25 : 1 : 15 25的量依次加入上述溶液 中，在20。C土5'C條件下攪拌反應(yīng)2 4h;將反應(yīng)溶液在0 4C條件下，用上述磷酸緩 沖液攪拌透析70 80h，然后改用蒸餾水透析20 30h，每6h更換一次透析液；在0 4。C，以10000 13000r/min離心上述透析后的溶液10 15min，取上清液；凍干上清液， 得到白色粉末固體即活化的牛血清蛋白，備用；(3) 1-氨基-乙內(nèi)酰脲的制備① 溶液A的制備稱取3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物溶于N， N'-二甲基甲酰胺中，以3—羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物、三正丁胺與氯甲酸 異丁酯的摩爾比為1:1 1.5:4 6的量加入三正丁胺攪拌10min，在冰浴條件下再加入 氯甲酸異丁酯，反應(yīng)l 2h，得溶液A，備用；② 溶液B的制備稱取活化的牛血清蛋白溶于N，N' -二甲基甲酰胺的水溶液中， 得溶液B，其中以質(zhì)量比計(jì)，N，N' -二甲基甲酰胺:水=1:1 1:3;③ 溶液C的制備將A溶液緩慢加入到B溶液中，于0 4'C條件下攪拌反應(yīng)2 4h，得溶液C，其中3 —羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物與活化的牛血清蛋白的摩爾比為100:1 150: 1;(4) 用pH為7. 30 7. 50、濃度為0. 01M 0. 02M的磷酸緩沖液在0 4。C下，攪拌 透析溶液C 70 80小時(shí)，然后改用蒸熘水透析20 30小時(shí)，每6 7小時(shí)更換一次透 析液；以12000 15000r/min離心透析后的溶液10 15rain，取上清液，備用；(5) 將步驟(4)所述上清液以常規(guī)方式凍干，得到1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原粗P口n 0
7. 如權(quán)利要求6所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法，其特征是步驟(1) 所述1-氨基-乙內(nèi)酰脲的鹽酸鹽與間羧基苯甲醛的摩爾比為1 : 1。
8. 如權(quán)利要求6所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法，其特征是步驟(3)之③所述3 —羧基苯甲醛與l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物與活化的牛血清蛋白的摩爾比為 120:1。
9. 如權(quán)利要求6所述1—氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原的制備方法，其特征是步驟(2)、 (4)所述磷酸緩沖液的pH為7.4，磷酸緩沖液的濃度為0.01 M。
10. 權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述1一氨基一乙內(nèi)酰脲的免疫原在制備鄰硝基苯甲醛與 l-氨基-乙內(nèi)酰脲的偶聯(lián)物特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通式(I)的1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原，由3-羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲形成的偶聯(lián)物半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白連接制成。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的免疫原的制備方法，即將3-羧基苯甲醛與1-氨基-乙內(nèi)酰脲形成偶聯(lián)物與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原。本發(fā)明的1-氨基-乙內(nèi)酰脲的免疫原通過(guò)免疫新西蘭大白兔，制備了效價(jià)達(dá)1∶1,024,000以上的抗血清，其最低檢測(cè)限為0.1ppb，IC₅₀(轉(zhuǎn)化為AHD)為10ppb。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為制備1-氨基-乙內(nèi)酰脲的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/76GK101173007SQ20071001445
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2007年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日
發(fā)明者圍 劉, 盧圣欣, 張玉蘭, 趙承彪, 郗日沫 申請(qǐng)人:山東大學(xué)